Способ получения мембран эритроцитов

Способ получения мембран эритроцитов

Реферат

Изобретение относится к биологии и медицине, а именно к лабораторным методам исследования.

Известно, что для электрофоретического разделения мембранных белков эритроцитов в системе додецилсульфат натрия - полиакриламидный гель необходимо получить мембраны, свободные от гемоглобина (Dodge J.T. et al., Arch. Biochem. Biophys. - 1963. - Vol.100. - P.118-130; Fairbanks et al., Biochemistry. - 1971. - Vol.10. - P.2606-2617).

Известен метод получения мембран эритроцитов, свободных от гемоглобина (Dodge J.T et al., Arch. Biochem. Biophys. - 1963. - Vol.100. - P.118-130), включающий выделение эритроцитов из крови и их гемолиз в буферной системе с низкой ионной силой, с последующим ультрацентрифугированием при 30000g. После ультрацентрифугирования супернатант удаляется. В результате получаются чистые мембраны, свободные от гемоглобина. Однако этот способ требует ультрацентрифугирование и длительного времени (ультрацентрифугирование 3 раза по 30 минут).

Поэтому создание быстрого, не требующего ультрацентрифугирования способа получения мембран эритроцитов является актуальной задачей.

Решение поставленной задачи достигается способом, который заключается в том, что эритроциты выделяют из крови, гемолизируют в растворе с низкой ионной силой, добавляют к гемолизату хлористый лантан до конечной концентрации 0,8-1,2 мМ, после агрегации мембраны центрифугируют при 1000g в течение 5 мин. После этого супернатант убирают, еще раз добавляют хлористый лантан и центрифугируют при 1000g в течение 5 мин. По окончании центрифугирования супернатант убирают, а к мембранам эритроцитов для нейтрализации лантана добавляют 1 мМ ЭДТА (этилендиаминтетрауксусной кислоты). Далее мембраны эритроцитов используют для электрофоретического разделения белков.

Способ осуществляется следующим образом. Эритроциты трижды отмывают от плазмы и белых клеток крови центрифугированием в 10-кратном объеме физиологического раствора. Эритроциты гемолизируют в 20 мМ трис-HCl буфере (рН 8.5; 0-2°С). После гемолиза эритроцитов добавляют хлористый лантан до конечной концентрации 0,8-1,2 мМ. В этом диапазоне концентраций лантана происходит наиболее полное осаждение мембран. После агрегации мембран эритроцитов их центрифугируют при 1000g в течение 5 мин. Супернатант удаляют, а к мембранам еще раз добавляют буферный раствор с лантаном. Центрифугируют при 1000g в течение 5 мин. Супернатант убирают, а к мембранам для нейтрализации лантана добавляют 1 мМ ЭДТА. Полученные мембраны используют для электрофоретического разделения белков эритроцитов в системе додецилсульфат натрия - полиакриламидный гель (Steck T.L. J. Mol. Biol. - 1972. - Vol.66 - P.295-305).

Пример. На чертеже представлена электрофореграмма мембранных белков эритроцитов, полученных методом Dodge et al. 1963 (а) и лнтановым способом (б). Из чертежа видно, что электрофоретическое разделение мембран эритроцитов, полученных с использованием лантана, не отличается от классического метода.

Таким образом, способ не требует ультрацентрифугирования и сокращает время получения мембран эритроцитов в 10 раз.

Способ получения мембран эритроцитов, включающий выделение эритроцитов из крови и их гемолиз, отличающийся тем, что к гемолизату для осаждения мембран добавляют хлористый лантан до конечной концентрации 0,8-1,2 мМ, проводят центрифугирование при 1000 g в течение 5 мин, затем супернатант удаляют, а осадок еще раз промывают буферным раствором в присутствии лантана, после удаления супернатанта добавляют 1 мМ ЭДТА.