Способ получения экстракта региональных стволовых клеток из тканей плаценты свиной для замещения поврежденных клеток кожных и слизистых покровов

Способ получения экстракта региональных стволовых клеток из тканей плаценты свиной для замещения поврежденных клеток кожных и слизистых покровов

Реферат

Изобретение относится к биологии и медицине и может быть использовано для замещения поврежденных клеток кожных и слизистых покровов. Поверхностное нанесение экстракта клеток из здоровой плацентарной ткани свиной обеспечивает процессы регенерации и восстановления эпидермиса за счет содержащихся в экстракте факторов роста кератиноцитов, цитокинов и других биологически активных веществ.

Известны способы замещения поврежденных клеток культивированными in vitro трансплантатами соединительно-тканевого происхождения (фибробласты, миопласты, клетки эпителия).

Культивированные трансплантаты используют для лечения ожогов, регенерации эпидермиса, рогового эпителия, лечения хронических кожных язв и др.

Известны биосовместимые синтетические внеклеточные матрицы для тканевой инженерии (РЖ Медицина. Реф. 5913, 1999, №10). Трансплантация клеток с использованием биодеградируемых синтетических внеклеточных матриксов создает возможность формирования полностью новых органов и тканей.

Известен способ культивирования клеток для тканевой терапии, необходимых для восстановления функций поврежденного органа или ткани. Клетки в этом случае выделяются из органов пациента или донора. После культивирования имплантату придается необходимая форма и он пересаживается больному. Для улучшения реваскуляции имплантата используют различные стимуляторы роста пролонгированного действия (РФ Биотехнология, реф. №00.01-ОЧР1.353, 2000, №1).

Недостатком известных технологических решений является трудность с интеграцией живых клеток в организме реципиента, длительные сроки культивирования, использование дорогостоящих материалов - среды роста, стимуляторы и т.д.

В предлагаемом способе получения полного спектра биологически активных компонентов использовали региональные стволовые клетки, содержащие все регуляторные пептиды, запускающие регенераторные процессы в тканях.

Технический результат изобретения - получение экстракта из выращенных региональных стволовых клеток животного происхождения.

Указанный технический результат достигается использованием заявляемого способа.

Способ осуществляется следующим образом.

Плаценту, полученную при опоросе здоровой свиньи с нормальными родами, для транспортировки в лабораторию помещали в стерильный сосуд с физиологическим раствором и антибиотиками. После доставки в лабораторию плаценту переносили в сосуд, содержащий 300 мл фосфатно-буферного раствора или раствора Хэнкса (рН 7,2). Плаценту промывали осторожным взбалтыванием в течение 1-2 минут, а затем переносили в другой сосуд с раствором Хэнкса. После трех-четырехкратного отмывания в растворе Хэнкса плаценту стерильными ножницами измельчали на кусочки размером 2-3 см². Затем заливали 150 мл 0,25% раствора трипсина. Трипсинизацию проводили на магнитной мешалке в течение 3 часов при 20°С, затем биомассу региональных стволовых клеток выращивают монослоем на среде 199 с последующей водно-солевой экстракцией.

Сущность способа поясняется примером.

Для определения максимального выхода клеточной массы подбирались параметры трипсинизации. Было проведено 3 опыта. Во всех опытах брали участок плаценты весом 200 г в опыте №1 Трипсинизацию проводили при 4°С - 1 час, в опыте №2 при 20°С - 3 часа, в опыте №3 при 37°С - 5 часов. Результаты проведенных опытов представлены в таблице 1.

Проведенные опыты показали, что оптимальным режимом получения максимального количества клеточной массы является вариант трипсинизации с использованием температурного режима 20°С в течение 3 часов, позволяющий получить 115 млн. клеток на 1 г ткани. Затем клеточную массу региональных стволовых клеток переносили на среду 199 (производства ООО «Биолот», г.Санкт-Петербург) и выращивали монослоем с последующей водно-солевой экстракцией.

Таблица 1
Влияние параметров трипсинизации на выход клеточной массы
№ п/п	Параметры	Опыт 1	Опыт 2	Опыт 3
1	Температура трипсинизации	4°С	20°С	37°С
2	Время трипсинизации	1 час	3 часа	5 часов
3	Средний выход клеточной массы	80 млн. клеток на 1 г ткани	115 млн. клеток на 1 г ткани	100 млн. клеток на 1 г ткани

Способ получения экстракта региональных стволовых клеток из плаценты свиной для замещения поврежденных клеток кожных и слизистых покровов, характеризующийся тем, что отмывку тканей плаценты свиной проводят в фосфатном буфере или растворе Хэнкса с последующим измельчением ее на кусочки 2-3 см³, кусочки заливают 150 мл 0,25%-ного раствора трипсина, трипсинизацию проводят на магнитной мешалке в течение 3 ч при 20°С, затем биомассу региональных стволовых клеток выращивают монослоем на среде 199 с последующей водно-солевой экстракцией.