Способ профилактики пастереллеза птиц живой вакциной

Способ профилактики пастереллеза птиц живой вакциной

Реферат

Предлагаемое изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии и предназначено для профилактики пастереллеза птиц при определенных условиях вакцинации их живой вакциной,

Обнаружение Луи Пастером в 1880 году ослабления вирулентности микроба "куриной холеры" (возбудителя пастереллеза) явилось историческим фактом зарождения учения о направленной изменчивости патогенных микроорганизмов и получения первой живой вакцины. В мире решение о возможности использовать живую вакцину против пастереллеза птиц по-прежнему обстоит спорно. Вакцина вызывает напряженный, но нестерильный специфический иммунитет. Остаточная вирулентность и бактерионосительство вакцинных пастерелл, а также поствакцинальные осложнения у птиц настораживают возможным появлением пастереллеза. Совпадение развития пастереллеза птиц с резкими колебаниями температуры окружающей среды и дождливой погодой обусловлено снижением естественной резистентности птиц-пастереллоносителей (Г.Д.Пустовит, 1965; И.В.Домарадокий, 1971; Е.И.Буткин, 1972). Подобно полагают, что и с ослаблением резистентности привитых живой вакциной птиц в их организме размножаются вакцинные пастереллы, развивается септицемия с симптомами заболевания (А.Н.Борисенкова, 1979; И.А.Болотников, 1982). Согласно же другому положению, вакцина безопасна в применении, так как представляет собой предельно ослабленные с направленной изменчивостью пастереллы, которым не свойственно реверсировать в патогенные, а свойственно изменяться по пути их дальнейшей сапрофитизации (И.Я.Глебова, 1958; А.В.Масюков, 1965). Ввиду того, что живая вакцина при введении подкожно вызывает осложнения, предложено прививать ее накожно (А.В.Масюков, 1958). На практике же живая вакцина при инъекции в организм вызывает осложнения и даже гибель птиц, обычно слаборезистентных (П.Н.Влезько, 1965; Б.Л.Дубовой, 1965). Вместе с тем известно, что пастереллы, в том числе и вакцинные, выражение локализуются на слизистой носовой полости и в других органах дыхания и у птиц устанавливается пастереллоносительство без симптомов болезни (Е.М.Кожевников, 1971, 1973). Более приемлемой для "колонизации" и инвазивности пастерелл определена слизистая полости глотки птиц (K.R.Rhoades, R.B.Bimler, 1990). В этой связи живую вакцину предложено выпаивать (W.T.Derieux. 1977, 1980), или же выпаивать и повторно прививать аэрозольно (N.Singer, M. Malkinson, 1979), или же прививать ее только аэрозольно (Г.Д.Ищенко, И.С.Дубров, 1982; В.В.Каширин, 1986). Однако при предложенных способах вакцинации не всегда возможно получить полный иммунологический эффект, в связи с чем количество специфически резистентных птиц к возбудителю пастереллеза в биопробе выявляется от 0-20 до 60-80%. Кроме того, у части накожно или аэрозольно привитых птиц возможны поствакцинальные осложнения. Между тем, при выпойке или же аспирации живой вакцины ее иммунизирующая доза значительно не вся локализуется на слизистой носовой и ротоглоточной полостей, а сопутствующая роль температуры окружающей среды не учитывается или же подлежит анализу недостаточно объективно. По нашим данным, прививка живой вакцины локально на слизистую ротоглоточной полости, причем даже в больших количествах, безвредна и эффективна (Патент РФ №2050161 от 20.12.1995). Очевидно, что вакцинные пастереллы проявляют свою остаточную вирулентность и вызывают специфический иммунитет в зависимости не только от естественной резистентности птиц, но и от пути (способа) введения их микробной клетки в организм. Кроме этого установлено, что пастереллы являются морфо- и термодабильными бактериями, активность биологических свойств которых зависит от температуры окружающей среды (Патент РФ №2051970 от 10.01.1996; В.В.Каширин, 1996). Путь заражения восприимчивого организма и температура окружающей среды играют главную роль в повышении вирулентности пастерелл и в развитии заболевания (Патент РФ №2123531 от 20.12.1998). Ввиду изложенного, существенным недостатком известных способов применения живой вакцины против пастереллеза птиц является неполная безопасность и неполная иммунологическая эффективность из-за недостаточно точного определения места прививки вакцинных пастерелл в организме и неизученности влияния температуры окружающей среды на их остаточную вирулентность и прививку. Очевидно, что в целях достижения эффективности вакцинации недостаточно придано значение месту локализации естественного пастереллоносительства у птиц и, как и равнозначно, наиболее вероятному уязвимому месту природного пути внедрения пастерелл в их организм - слизистой носовой и ротоглоточной полостей.

В течение около 50 лет известен способ прививки живых вакцин против пастереллеза водоплавающих птиц из штаммов "АВ" и "К" Краснодарской НИВС в полость лицевого синуса (Наставление по применению, в варианте последней редакции, утвержденное Департаментом ветеринарии МСХ PS 22 июля 1996 г.) - прототип. Эти живые вакцины, изготавливаемые и хранящиеся для использования лиофилизированными (ТУ 10.19.76-89, утвержденные 19 апреля 1989 г.), рекомендовано прививать только водоплавающей птице. При этом на практике обычно востребована вакцина из штамма "К", причем чаще для прививки молодняка птиц с 15-суточного возраста. В случае необходимости привить птицу старше 2-месячного возраста применяют первой, в качестве вспомогательной, вакцину из штамма "АВ", ослабляющую реактогенность вакцины из штамма "К" во второй прививке. Лиофилизированные вакцинные пастереллы регидратируют в физиологическом растворе и с этого момента применяют в течение 4 часов для прививки путем введения в полость лицевого синуса водоплавающих птиц. Между тем, изготавливаемые биопромышленностью серии живых вакцин из штаммов пастерелл "АВ" и "К" контролируют на безвредность и иммуногенность на курах, прививая подкожно.

Историческая справка по избранному прототипу изобретения свидетельствует, что применение обеих живых вакцин из ослабленных штаммов пастерелл "АВ" и "К" обосновано решением вопросов формирования и проявления "антиинвазивного" иммунитета к пастереллезу на примере организма не только водоплавающих птиц (уток), но и кур (А.В.Масюков, 1958, 1965). Вакцинные штаммы пастерелл подобны по методике их получения (И.Я.Глебова, 1958; А.В.Масюков, 1965) и идентичны по своей антигенной структуре (В.В.Каширин, 1986, 1988). При этом пастереллы вакцинного штамма "АВ" лишены свойства инвазивности и слабоиммуногенны, а пастереллы вакцинного штамма "К" обладают инвазивностью и более иммуногенны (А.В.Масюков, 1965). Очевидно, что по причине реактогенности вакцины из штамма пастерелл "К" не только для кур, но и для водоплавающих птиц было необходимым создать еще одну живую вакцину из более ослабленного штамма пастерелл "АВ" для безопасности проведения первой прививки. Однако только с нахождением более безвредного места (способа) прививки живой вакцины, вместо прививки ее путем инъекции подкожно, стало возможным значительно уменьшить число случаев гибели птиц от поствакцинальных осложнений и безопаснее проводить вакцинации. Этим удачным местом для прививки живой вакцины установлена полость лицевого синуса, которая выражена только у водоплавающих птиц и в нее можно ввести вакцину через иглу, проколов кожный покров. Между тем у кур, индеек и других птиц этот орган почти атрофирован. Поскольку же вакцинация сельскохозяйственных птиц путем инъекции вызывает гибель их от осложнений, живые вакцины из штаммов пастерелл "АВ" и "К" Краснодарской НИВС с 21 марта 1978 года рекомендовано применять только на водоплавающей птице, прививая в полость лицевого синуса. Вместе с тем замечено, что с лиофилизацией изготавливаемых живых вакцин из штаммов пастерелл "АВ" и "К" еще более сократилось число случаев гибели водоплавающих от поствакцинальных осложнений. В этом отношении всего лишь разъясняется, что лиофилизация стабилизирует биологическую активность живой вакцины за счет повышения сохранности жизнеспособных вакцинных пастерелл. Однако этот невыясненный феномен срабатывал только при введении вакцины в полость лицевого синуса и нисколько не влиял на небезопасность применения вакцины путем инъекции. Поэтому единственно возможным, относительно безвредным местом прививки живой вакцины по-прежнему обозначена полость лицевого синуса, причем, разумеется, только у водоплавающих птиц. Однако введение вакцины в полость лицевого синуса - это одновременно, частично есть и ее инъекция. Обычно это происходит из-за малейшей неточности в определения места прокола кожи и угла направления иглы при невозможности ведения полного визуального контроля, следствием чего является непреднамеренное, случайное введение какой-то части прививочной дозы живой вакцины не в полость лицевого синуса, а в облегающие ее мягкие ткани. Кроме того, по причине нарушения целостности самой кожи в точке прокола ее иглой отчасти тоже при введении вакцины в полость лицевого синуса непреднамеренно происходит инъекция какого-то количества вакцинных пастерелл. В итоге, при введении живой вакцины в полость лицевого синуса невозможно избежать гибели от осложнений по меньшей мере около 2% вакцинированных птиц. Очевидно, что и способ применения живой вакцины по Наставлению в полость лицевого синуса водоплавающих птиц, избранный за прототип, не вполне безопасный, значительно трудоемкий, неприемлемый для прививки птиц других видов. Сама же полость лицевого синуса водоплавающих птиц, принципиально как более безвредное место прививки живой вакцины, изучена недостаточно. Кроме того, влияние температуры окружающей среды на прививку живой вакцины в организме птиц является неизученным, проблемным вопросом. Все эти существенные недостатки способа применения живой вакцины, избранного за прототип, ограничивают возможность широкого применения ее в качестве безопасного и эффективного средства против пастереллеза птиц. Поскольку живая вакцина из штамма "К" прививается на слизистую ротоглоточной полости водоплавающих птиц безвредно и иммунологически эффективно (Патент РФ №2050161 от 20.12.1995), открывается реальная возможность применения этой вакцины и на птице других видов в сельском хозяйстве. При этом изготовление и применение слабоиммуногенной живой вакцины из штамма "АВ" в качестве вспомогательной предполагается нецелесообразным и в прототипе тоже является недостатком.

В целом анализ применения живой вакцины против пастереллеза птиц свидетельствует о принципиально важном значении пути и места (способа) введения ее в организм, причем в качестве диофилизированной (сухой), регидратированной в физиологическом растворе.

Задачей изобретения является создание напряженного специфического иммунитета у птиц к пастереллезу путем организации условий безвредной прививки живой вакцины.

Поставленная задача достигается тем, что в качестве живой вакцины используют блокированные по инвазивности действием низкой температуры при лиофилизации ослабленные термолабильные пастереллы. Лиофильно высушенную живую вакцину предварительно регидратируют в дозе 0,5 млрд. м.к. в 0,2-1,5 мл физиологического раствора и в этой дозе прививают на слизистую носовой и ротоглоточной полостей интраназально или орально путем закапывания, впрыскивания или орошения, или назально-орально путем двукратного погружения клюва птицы по носовые отверстия в рабочий раствор вакцины и наблюдения рефлекса глотательного движения. С момента вакцинации птицу содержат не менее 10 суток при допустимом оптимальном диапазоне температуры окружающей среды 15-25°С (оптимум 20°С). У птиц в таких условиях вакцинации постепенно, беспрепятственно развивается напряженный специфический иммунитет. В поствакцинальном периоде для птиц с развитым напряженным специфическим иммунитетом отклонения температуры окружающей среды от допустимого оптимального диапазона обычно не представляют опасности (осложнения по причине прививки живой вакцины не наблюдаются).

Существенным отличием является то, что в качестве живой вакцины используют блокированные по инвазивности действием низкой температуры при лиофилизации ослабленные термолабильные пастереллы, которые сухими предварительно регидратируют в дозе 0,5 млрд. м.к, в 0,2-1,5 мл физиологического раствора и в этой дозе прививают на слизистую носовой и ротоглоточной полостей интраназально или орально путем закапывания, впрыскивания или орошения, или назально-орально путем двукратного погружения клюва птицы по носовые отверстия в рабочий раствор вакцины и наблюдения рефлекса глотательного движения. С момента вакцинации птицу содержат не менее 10 суток при допустимом оптимальном диапазоне температуры окружающей среды 15-25°С (оптимум 20°С).

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения.

В исследованиях применяли живую вакцину против пастереллеза водоплавающих птиц из штамма "К" Краснодарской НИВС (сухую) и типичный возбудитель пастереллеза птиц Pasteurella multocida A:I серовара, наиболее распространенный и повсеместно вызывающий заболевание (по нашим данным в 89% случаев эпизоотии). В частности, использовали коллекционированные в разное время и из разных регионов сильновирулентные контрольные штаммы пастерелл ВГНКИ №55 и №712. Свойства слабовирулентных вакцинных и сильновирулентных контрольных штаммов пастерелл изучали путем световой микроскопии, биологической пробы, изоляции в физиологическом растворе и культивирования в жидкой и на плотной питательных средах. В качестве наиболее восприимчивой к заражению пастереллами лабораторной биомодели использовали организм голубя массой тела 300-350 г. Препараты для микроскопии окрашивали по Гинсу, Романовскому-Гимза, Граму. Опыты по изучению способов прививки живой вакцины, включающих условия вакцинации, ставили на утятах и гусятах с 15-суточного возраста, на подрощенном молодняке кур с 4-месячного возраста и взрослых курах разных пород. Острые опыты по определению специфического иммунитета ставили на утках и курах массой тела 1700-2000 г. Специфическую резистентность птиц оценивали по коэффициенту иммунологической эффективности (КИЭ, %).

Пример 1

Определяли остаточную вирулентность пастерелл живой вакцины из штамма "К" в зависимости от пути введения в организм голубей, испытывали микробные образцы: 1) вакцинные пастереллы биофабричного изготовления, сухие, перед изучением регидратированные из расчета 0,5 млрд. м.к. (доза вакцины) в 0,5 мл физиологического раствора; 2) бульонная культура капсулированных вакцинных пастерелл 12-часового возраста (10 ч при 37 и 2 ч при 20°С), содержащая около 1 млрд. м.к./мл; 3) бульонная культура бескапсульных вакцинных пастерелл 12-часового возраста (12 ч при 37°С), содержащая около 1 млрд. м.к./мл. Путь и доза введения образцов вакцинных пастерелл голубям: внутримышечно (инъекция в грудную мышцу) и интраназально (на слизистую носовой и ротоглоточной полостей) в количестве около 300, 150 и 75 млн. м.к. в 0,3 мл соответственно. На каждое заражение в испытуемой дозе использовали по 4 птицы. Биопробу ставили при 20-22°С окружающей среды. Срок наблюдений был 7 суток. Затем определяли минимальную летальную дозу (МДД) и по ее величине судили об остаточной вирулентности испытуемых образцов пастерелл, приготовленных из вакцинного штамма "К", Результаты биологических исследований приведены в табл.1.

Таблица 1
Результаты определения остаточной вирулентности пастерелл живой вакцины из штамма "К" на голубях
№ п/п	Испытуемый микробный образец	Доза, млн. м.к./0.3 мл	Результаты инфицирования птиц
внутримышечно	интраназально
К-во, гол.	Пало	% гибели	К-во. гол.	Пало	% гибели
1.	Живая вакцина, изготовленная биофабрикой	300	4	4	100	4	0	0
150	4	2	50	4	0	0
75	4	0	0	4	0	0
2.	Бульонная культура капсулированных бактерий	300	4	4	100	4	2	50
150	4	4	100	4	I	25
75	4	2	50	4	0	0
3.	Бульонная культура бескапсульных бактерий	300	4	2	50	4	0	0
150	4	0	0	4	0	0
75	4	0	0	4	0	0
Примечание: от павших птиц во всех случаях бактериологических исследований выделены пастереллы.

В биопробе все образцы вакцинных пастерелл в определенной дозе при инъекции в грудную мышцу вызывали гибель голубей по истечении 18-24 часов. Установлено, что остаточная вирулентность вакцинных пастерелл биофабричного изготовления (МЛД около 300 млн. м.к.) в два раза слабее, чем остаточная вирулентность бульонной культуры капсулированных вакцинных пастерелл (МЛД около 150 млн. м.к.), и в два раза сильнее, чем остаточная вирулентность бульонной культуры бескапсульных пастерелл (МЛД₅₀ около 300 млн. м.к.). При интраназальном введении гибель голубей вызывала только бульонная культура капсулированных вакцинных пастерелл. Так, от дозы около 300 млн. м.к./0,3 мл из 4 птиц пало 2 (50%) и от дозы около 150 млн. м.к./0,3 мл из 4 птиц пала 1 (25%). Гибель голубей наступила через 24-48 часов. Таким образом, в опыте установили, что пастереллы живой вакцины из штамма "К" выражение проявляют остаточную вирулентность в биопробе на голубях при введении путем инъекции (например, внутримышечно), тогда как при введении естественным путем (например, интраназально) проявляют то же свойство, если они капсулированы. Исходя из установленного, бульонную культуру капсулированных вакцинных пастерелл, выраженно отличающуюся остаточной вирулентностью для голубей, решено изучить на реверсию этого свойства.

Пример 2

Изучали пастереллы живой вакцины из штамма "К" на реверсию вирулентности в зависимости от пути введения в организм голубей. В качестве испытуемого микробного образца использовали бульонную культуру капсулированных вакцинных пастерелл 12-часового возраста (10 ч при 37 и 2 ч при 20°С) в дозе около 300 млн. м.к./0,3 мл. Путь введения вакцинных пастерелл в организм птиц: внутримышечно (инъекция в грудную мышцу) и интраназально (на слизистую носовой и ротоглоточной полостей). В двух опытах соответственно пути введения вакцинных пастерелл последовательно вели по 5 пассажей на голубях, получая после каждого пассажа бульонную культуру капсулированных бактерий для применения ее в последующем пассаже. В целях испытания вакцинных пастерелл на реверсию вирулентности птиц сразу после инфицирования помещали в условия по температуре 4-10, а с момента гибели - 20±1°С (оптимум) окружающей среды по способу повышения вирулентности пастерелл (Патент РФ №2123531 от 20.12.1998). Каждый образец бульонной культуры капсулированных вакцинных пастерелл, полученный после пятого (заключительного) пассажа соответственно пути введения бактерий в организм птицы, изучали в остром опыте в качестве испытуемого на повышение (на реверсию) вирулентности. Острый опыт ставили на аналогичных голубях путем инъекции определенных доз капсулированных вакцинных пастерелл в грудную мышцу. Срок биопробы был 7 суток. Остаточная вирулентность вакцинных пастерелл, изучаемых в качестве бульонной культуры капсулированных бактерий, установленная в результате первого пассажа их через восприимчивый организм и, в частности, описанная в примере 1 (табл.1), служила в опыте контрольной. Результаты биологических исследований приведены в табл.2.

Таблица 2
Результаты определения вирулентности пастерелл живой вакцины из штамма "К" после пяти соответствующих пассажей на голубях в зависимости от пути введения в организм
Испытуемый образец вакцинных пастерелл	Доза, млн. м.к./0,3 мл	Птиц в биопробе	Пало в биопробе по суткам, гол.	Пало всего	% гибели
1	2	3	4	5	6	7
Культура капсулированных бактерий пассированных внутримышечно	300,0	4	4							4	100
150,0	4	3	1						4	100
75,0	4	1	1	0	0	0	0	0	2	50
37,5	4	0	0	0	0	0	0	0	0	0
Культура капсулированных бактерий, пассированных интраназально	300,0	4	4							4	100
150,0	4	2	2							100
75,0	4	0	2	0	0	0	0	0	2	50
37,5	4	0	0	0	0	0	0	0	0	0
Контрольная (исходная) культура капсулированных бактерий	300,0	4	4							4	100
150,0	4	3	1						4	100
75,0	4	0	2	0	0	0	0	0	2	50
Примечание: от павших птиц во всех случаях бактериологических исследований выделены пастереллы.

Результаты биологических исследований свидетельствовали, что пастереллы живой вакцины из штамма "К" в качестве бульонной культуры капсулированных бактерии-после пяти соответствующих пассажей на голубях как при внутримышечном, так и при интраназальном путях введения не изменили свою исходную (контрольную) остаточную вирулентность. В соответствии с принципиально избранным методическим подходом к усилению биологических свойств вакцинных пастерелл не представилась возможным повысить их остаточную вирулентность. Поэтому утверждать о реверсии пастерелл живой вакцины из штамма "К" к патогенному варианту нет доказательств и, следовательно, существенных оснований.

Пример 3

Изучали влияние температуры окружающей среды на остаточную вирулентность пастерелл живой вакцины из штамма "К" в зависимости от пути введения голубям. В качестве испытуемого микробного образца использовали бульонную культуру капсулированных вакцинных пастерелл 12-часового возраста (10 ч при 37 и 2 ч при 20°С) в дозе около 300 млн. м.к./0,3 мл. Приготовив культуру бактерий, ее сразу вводили 5 голубям интраназально, а охладив эту же культуру 1 час при 5°С окружающей среды, ее вводили другим 5 голубям так же интраназально и другим 5 голубям в грудную мышцу, считая последних контрольными. Всех птиц содержали при 20-22°С окружающей среды по группам. Срок наблюдений был 7 суток. Затем оставшихся в живых перемещали в условия 4-10°С окружающей среды и вели наблюдения еще 5 суток.

В проведенных исследованиях установлены отличающиеся результаты. Так, из 5 птиц, инфицированных интраназально приготовленной бульонной культурой капсулированных вакцинных пастерелл, пало 3, гибель которых наступила через 36-48 часов. При этом другие 5 птиц, так же инфицированные интраназально этой же культурой бактерий, но предварительно охлажденной 1 час при 5°С окружающей среды, остались живы все в течение 7 суток биопробы, тогда как 5 контрольных, инфицированных той же культурой в грудную мышцу, пали через 18-24 часа. Между тем, в результате перемещения оставшихся в живых интраназально инфицированных 7 голубей из условий по температуре 20-22°С в условия 4-10°С окружающей среды большая часть их (4 из 7) пала через 3-5 суток (срок наблюдений). Последний полученный результат было решено воспроизвести в дополнительном опыте с целью полного убеждения в объективности установленного.

Дополнительный опыт ставили на 10 голубях, которых так же, как и по вышеописанному, инфицировали интраназально аналогичной охлажденной бульонной культурой капсулированных вакцинных пастерелл, По схеме опыта 3 птицы через 24 и 3 птицы через 48 часов переместили из условий по температуре 20-22°С в условия 4-10°С окружающей среды, а оставшиеся 4 птицы содержали в тех же первоначальных условиях без каких-либо изменений по температуре и их считали в опыте контрольными. Срок наблюдений был 5 суток. В результате из 6 опытных птиц, содержащихся в условиях при 4-10°С окружающей среды, пало 3 через 48-72 часа после инфицирования и, затем, пала еще одна птица к концу 5 суток биопробы (срок наблюдений). При этом все 4 контрольных голубя, содержащихся при первоначальных условиях по температуре (20-22°С) окружающей среды, в течение этого времени после инфицирования остались живы.

В итоге биологических исследований сделан вывод, что остаточная вирулентность пастерелл живой вакцины выражение проявляется на высоко восприимчивой лабораторной биомодели "голубь" и зависит не только от их капсуляции и пути введения в организм, но и от температуры окружающей среды. Вакцинные пастереллы проявляют свойство инвазивности, реализуют свою остаточную вирулентность, свойство инвазивности у пастерелл под действием низкой температуры окружающей среды блокируется, тогда как в восприимчивом организме на слизистой носовой и ротоглоточной полостей при вдыхании холодного воздуха и питье холодной воды проявляется наиболее активно. При температуре 20-22°С окружающей среды пастереллам живой вакцины свойственно умеренно проявлять инвазивность, в связи с чем умеренно развивается их бактериемия. При этом даже наиболее чувствительный к инфицировавши ослабленными пастереллами макроорганизм (например, голубь) остается в биопробе жив.

Пример 4

Изучали инвазивность и естественную генерацию пастерелл живой вакцины, предварительно подвергшихся действию низкой температуры окружающей среды. Опыт ставили на утятах 17-суточного возраста в условиях по температуре 20-22°С окружающей среды. В качестве испытуемых микробных образцов применяли: 1) вакцинные пастереллы биофабричного изготовления, подвергшиеся действию низкой температуры (замораживанию) при их лиофилизации, для опыта сухими, регидратированные в дозе 0,5 млрд. м.к. (доза вакцины) в 0,5 мл физиологического раствора; 2) бульонная культура капсулированных вакцинных пастерелл 12-часового возраста (10 ч при 37 и 2 ч при 20°С), содержащая около 1 млрд. м.к./мл, охлажденная 1 час при 5°С окружающей среды. При этом бульонная культура капсулированных вакцинных пастерелл 12-часового возраста (10 ч при 37 и 2 ч при 20°С), не подвергавшаяся охлаждению и действию низкой температуры окружающей среды, служила в опыте в качестве контрольного микробного образца. Описанные микробные образцы вводили утятам интраназально в дозе около 0,5 млрд. м.к./0,5 мл, по 5 голов в группах соответственно. Группы птиц содержали в равнозначных условиях, но изолированно одна от другой. По каждой группе птиц через каждые последующие 11-12 часов с момента введения изучаемого микробного образца брали из подкрыльцовой вены пробы крови, сразу готовили мазки крови, которые окрашивали по Романовскому-Гимза и по Граму. Препараты микроскопировали с оценкой не менее 10 полей зрения. По обнаружению коккоподобных грамотрицательных бактерий судили о проявлении инвазивности и развитии бактериемии вакцинных пастерелл. Вместе с тем образцы вакцинных пастерелл сравнивали и по формированию их популяции ("колонизации") на слизистой верхних дыхательных путей птиц. Бактериологической петлей брали пробу слизи со слизистой в области небной щели и вносили в 1 мл физраствора. Приготовленную взвесь отобранной пробы материала высевали на мясо-пептонный агар (МПА) по общепринятому методу Дригальского. Бактериологическую оценку вели по морфологии растущих колоний пастерелл. При этом морфология колоний в первичных посевах исходных образцов вакцинных пастерелл на МПА служила в исследованиях в качестве контрольной.

В проведенных исследованиях установлены отличающиеся результаты. У птиц опытных групп, привитых испытуемыми образцами вакцинных пастерелл, начало бактериемии замечено через 22-24 часа и выраженное развитие бактериемии - через 36-48 часов, тогда как у птиц контрольной группы уже через 11-12 часов после введения микробного образца отмечено в крови большое количество коккоподобных грамотрицательных бактерий. При этом в посевах на МПА проб слизи с верхних дыхательных путей птиц 1 и 2 опытных групп через 11-12 часов после введения интраназально соответствующего микробного образца установлен рост в виде мукоидных колоний бактерий, круглых по форме, темно-белого цвета, непрозрачных в проходящем свете. Морфологически эти колонии бактерий были подобны колониям пастерелл в первичных (контрольных) посевах исходных образцов вакцинных пастерелл, приготовленных для постановки опыта. В то же время в посевах на МПА проб слизи с верхних дыхательных путей птиц контрольной группы среди небольшого количества мукоидных колоний пастерелл отмечено много колоний их с голубоватым оттенком, прозрачных в проходящем свете, круглых по форме, а по размеру сравнительно меньших в несколько раз. Однако уже через 22-24 часа после введения микробных образцов соответственно по группам утят и, как правило, в последующие сроки наблюдений по всем бактериологическим исследованиям в посевах проб слизи на МПА отмечены только колонии с голубоватым оттенком, прозрачные в проходящем свете, круглые по форме, сравнительно меньшие от исходных по величине. При этом у всех птиц, без существенных отличий в группах и между группами, отмечена бактериемия на 12-14 сутки после вакцинации, на 15-е сутки - бактерии в крови обнаружены изредка, а на 16-е - не выявлены. При этом у птиц всех групп на слизистой верхних дыхательных путей сохранилась идентичная популяция пастерелл по 20 сутки (срок наблюдений).

Результаты бактериологических исследований свидетельствовали о термолабильности пастерелл живой вакцины. Низкая температура окружающей среды блокирует инвазивность вакцинных пастерелл вне макроорганизма. Температура окружающей среды 20-22°С является важным условием умеренного проявления этого свойства естественной генерацией ослабленных пастерелл в популяции на слизистой верхних дыхательных путей птиц, в связи с чем у интраназально привитых бактериемия развивается постепенно, умеренно и без осложнений. Поэтому иммунизирующая доза живой вакцины в отличие от ее прививочной создается в организме индивидуально, постепенно, за счет естественной генерации ослабленных вакцинных пастерелл в популяции на слизистой верхних дыхательных путей. Вакцинные пастереллы естественной генерации отличаются от изначально привитых (регидратированных в физрастворе из сухого состояния) свойством инвазивности.

Установленное свойство термолабильности пастерелл послужило более объективнее объяснить положительную роль метода вакуумной лиофильной сушки в стабилизации биологических свойств живой вакцины против пастереллеза птиц по методике ГНКИ, утвержденной управлением ветеринарии МСХ СССР 14 сентября 1962 г. Сущность получаемого практического эффекта заключается не только в надежности сохранения вакцинных пастерелл лиофилизироваиными, но и в блокировании их инвазивности при замораживании перед сушкой. Такие вакцинные пастереллы при нанесении на слизистую верхних дыхательных путей птиц безвредны, но по-прежнему небезопасны при введении путем инъекции. При этом безвредность и иммуногенность живой вакцины стабилизируются за счет естественной генерации ее пастерелл на слизистой верхних дыхательных путей и их постепенной инвазивности в парентеральную среду организма птиц в зависимости от температуры вдыхаемого воздуха.

Пример 5

Анализировали применение живой вакцины против пастереллеза водоплавающих птиц из штамма "К" Краснодарской НИВС (сухой) в полость лицевого синуса по Наставлению и возможность применения этой вакцины на слизистую носовой и ротоглоточной полостей птиц. Исследования вели в производственных и лабораторных условиях. С этой целью при вакцинации и последующем содержании птиц учитывали температуру окружающей среды.

В условиях ЗАО ППФ "Юбилейная" Кагальницкого района Ростовской области при температуре окружающей среды в течение суток 25-29°С провели вакцинацию утят 17-суточного возраста в количестве 10 тыс. гол в полость лицевого синуса по Наставлению. И с целью сравнения в условиях экспериментальной базы ГНУ СКЗНИВИ соответственно при температуре окружающей среды 18-22°С, 25°С и выше, 15°С и ниже вакцинировали интраназально, орально и в полость лицевого синуса по Наставлению соответственно по 5 аналогичных утят. Вакцину (сухую) растворяли физиологическим раствором из расчета содержания ее дозы в 0,2, 0,5 и 1,0 мл растворителя соответственно для прививки в полость лицевого синуса, интраназально и орально. Аналогичных невакцинированных утят в количестве 15 гол. (контрольные) содержали изолированно от вакцинированных для исключения контаминации вакцинными пастереллами.

В целях поиска условий эффективной прививки вакцины выяснили:

1) анатомотопографически - полость лицевого синуса является придатком носовой полости, свободно сообщается с носовой и, по продолжению, с ротоглоточной полостями, что подтверждается при анатомировании и особенно наглядно демонстрируется при введении в нее любого жидкого красителя на примере трупа птицы (контрастная жидкость истекает через носовые отверстия, хоаны и небную щель), в связи с чем и определяется реальная возможность прививать живую вакцину в достаточно малой дозе ее растворителя интраназально или орально, причем более безопасно, эффективно, сравнительно нетрудоемко и удобно, и не только водоплавающей птице, но и птице других видов;

2) бактериологически - численность жизнеспособных пастерелл в 1 дозе вакцины около 500 млн. м.к., что соответствует ее нормативному показателю и результатам биофабричного контроля;

- вакцинные пастереллы постоянно сохраняют свою популяцию на слизистой верхних дыхательных путей интраназально привитых утят и, судя по развитию бактериемии, проявляют инвазивность в зависимости от температуры окружающей среды: при 26-30°С внедряются в парентеральную среду организма птицы кратковременно (3-5 суток), при 5-10°С - длительно (30 суток, срок наблюдений), при 15-25°С (оптимум 20°°°С) - умеренно (7-14 суток);

3) клинически - в производственных условиях, в частности при температуре окружающей среды даже 25-29°С, прививка живой вакцины в полость лицевого синуса утят по Наставлению вызывает у части птиц осложнения (отек головы, тендовагиниты, артриты, отказ передвигаться, отставание в росте и развитии, исхудание), приводящие к выбраковке и утилизации по меньшей мере около 2% привитого поголовья, что обычно происходит из-за малейшей неточности в определении места прокола кожи и угла направления иглы при невозможности ведения полного визуального контроля, следствием чего является непреднамеренное, случайное введение какой-то части прививочной дозы вакцины не в полость лицевого синуса, а в облегающие ее мягкие ткани, а также нарушение целостности самой кожи в точке прокола ее иглой и опять-таки инъекция какого-то количества вакцинных пастерелл;

4) биологически - в биопробе при 18-22°С окружающей среды в течение 10 суток при интраназальном заражении подрощенных до возраста взрослых уток через 60 поствакцинальных суток 10 МЛД вирулентного контрольного штамма пастерелл ВГНКИ №55 (серовар А:I) установлен напряженный специфический иммунитет, который выражен через КИЭ (%) и у вакцинированных в производственных условиях при 25-29°С окружающей среды в полость лицевого синуса (по Наставлению) равен 80% (выжило 8 из 10 зараженных при гибели на 4- и 6-е сутки по 1 гол), а у вакцинированных в условиях экспериментальной базы при 18-22°С окружающей среды соответственно интраназально, орально и в полость лицевого синуса (по Наставлению) - по 100% (выжили все 15 из 15 зараженных) при гибели всех невакцинированных (контрольных) в течение 1-, 2- и 3-х суток после заражения. (табл.3).

Экспериментально установили, что живая вакцина при инъекции

Таблица 3
Биологическая оценка способов прививки живой вакцины из штамма пастерелл "К" утятам (через 60 суток)
Способ вакцинации птиц	Доза вакцины, млрд. м.к./мл	Птиц в биопробе	Динамика гибели интранально зараженных 10 МЛД в течение 10 суток, гол.	Всего выж./пало	КИЭ, %
1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
В полос