Способ диагностики внутриутробных вирусных инфекций у детей

Изобретение относится к области лабораторной диагностики и может быть использовано для диагностики внутриутробных вирусных инфекций у детей раннего возраста. Сущность изобретения состоит в том, что путем морфологического исследования плаценты, определения в крови матери и ребенка IgM и IgG антител в реакции мРСК исследуют ретроплацентарную кровь, кровь ребенка и матери, дополнительно определяют вирусные антигены, специфические иммунные комплексы с антигенами и специфические низкоавидные антитела IgG3, IgG1-2. Техническим результатом является разработка способа, позволяющего с высокой точностью и специфичностью проводить обследование ребенка и матери и осуществлять специфическую противовирусную и иммуномодулирующую терапию.

Реферат

Изобретение относится к области медицины, а именно к диагностике внутриутробных вирусных инфекций у детей раннего возраста. Раннее выявление перинатального инфицирования позволяет проводить диспансерное наблюдение за детьми и своевременную терапию.

Среди факторов риска патологии беременности и рождения детей с тяжелыми психосоматическими нарушениями одно из первых мест принадлежит вирусным инфекциям, особенно имеющим склонность к латентно-хроническому течению, таким как герпесвирусные инфекции. Отмечается увеличение частоты ВУИ, вызываемого герпес-вирусами (вирусом простого герпеса 1 и 2 типа (ВПГ 1/2), вирусом Эбштейна-Бар, цитомегаловирусом человека (ЦМВ), вирусами гриппа, краснухи, парвовирусами В19.

Выявление внутриутробного инфицирования детей различными вирусами весьма актуально. Известно около 500 вирусов, способных поражать организм человека и вызывать острые и персистентные формы инфекционного процесса. Иммунная перестройка, происходящая в организме женщины во время беременности, создает условия для активации латентной инфекции, что увеличивает вероятность внутриутробного заражения плода. Вирусные инфекции особенно опасны во время беременности, так как могут вызывать тяжелый инфекционный процесс, приводящий к инвалидности или смертности новорожденных. Показателями высокого риска ВУИ являются острая вирусная инфекция или обострение хронической латентной вирусной инфекции во время беременности.

Частота внутриутробного инфицирования различными вирусами, специфическая тропность их к иммунокомпетентным клеткам, способность вызывать иммуносупрессию и длительно персистировать в организме детей, проявляясь в виде разнообразной патологии, является основанием разработки способов определения риска внутриутробного инфицирования ребенка на основе вирусологического исследования ретроплацентарной крови для диспансеризации детей с внутриутробными вирусными инфекциями и своевременного назначения противовирусной и иммуноориентированной терапии.

Несмотря на то, что достаточно описано воздействие многих вирусных инфекций на систему мать - плацента - ребенок, однако перинатальное инфицирование некоторыми вирусами, например вирусом Эбштейна-Барр (ВЭБ), остается малоизученным. Разработка способов для более точной, специфичной и своевременной диагностики внутриутробного инфицирования является весьма актуальной в настоящее время.

Известны способы диагностики внутриутробных вирусных инфекций с помощью морфологических методов. Так, в работе Цинзерлинга В.А. и Мельниковой В.Ф. "Перинатальные инфекции. Вопросы патогенеза, морфологической диагностики и клинико-морфологических сопоставлений" Практическое руководство. Санкт-Петербург: «Элби СПб» - 2002 приведены данные патоморфологического иследования последов, проводившегося с помощью морфометрического, макроскопического и микроскопического методов. Авторами были описаны морфологические особенности различных вирусных плацентитов, разработаны критерии оценки риска внутриутробной инфекции у детей на основании обследования последа. Несмотря на то, что морфологическое обследование плаценты показывает структурные изменения в последе, однако у этого способа есть ряд существенных недостатков: морфологическое исследование дает только качественную оценку изменений в последе, что не дает специфического анализа поражения вирусами, не всегда определяет реализацию инфекции у ребенка вследствие защитной функции плаценты, кроме того, данный способ зависит от некоторых условий, таких как опыт и навык морфолога, качество применяемого оборудования, проводящего исследование, таким образом, все это не обеспечивает точность и специфичность постановки диагноза.

Наиболее близким к предлагаемому нами способу, является способ диагностики внутриутробных инфекций у беременных и детей, приведенный в работе Маркова И.С. "Диагностика и лечение герпетических инфекций и токсоплазмоза": Сб. статей. - К.: АртЭк, 2002. Диагностика внутриутробных инфекций проводилась с помощью определения специфических к ВПГ 1 и 2 типа, ЦМВ, ВЭБ и токсоплазмозу антител, классов IgM и IgG у беременных женщин, а также у новорожденных в пуповинной крови. Наличие вирусной ДНК в плазме крови исследовали методом ПЦР. Для ИФА использовали коммерческие диагностические наборы. Исследование крови на антитела проводили однократно, осуществляли ПЦР-мониторинг репликативной активности возбудителей инфекций у беременных. По показаниям проводили ультразвуковое сканирование плода и плаценты. При выявлении репликативной активности возбудителей на основании выявления специфических IgM и вирусной ДНК назначали противовирусную терапию.

В данном способе имеются следующие недостатки. Использование ПЦР диагностики, серологическое выявление IgM и IgG антител с помощью ИФА не дает возможности проводить комплексную, информативную и достоверную оценку результатов. Для выявления ДНК вирусов (ВПГ, ЦМВ) не обеспечивается выявление полноценного вирусного антигена, кроме того, требуется наличие специальной лаборатории. Для проведения ПЦР анализа необходимо знать специальные методические указания взятию, транспортировке, хранению, пробоподготовке биологического материала. Проведение ПЦР диагностики обязательно в день взятия материала. Серологическое обследование с помощью ИФА, показывающее наличие антител IgG к вирусам в крови, не является четким признаком активности инфекционного процесса, так как антитела, например, к ВЭБ выявляются до 85-90% у здоровых доноров, с другой стороны, при угнетении иммунного ответа антителогенез нарушается, а у новорожденных определение серологических маркеров малоэффективно вследствие несформировавшейся иммунной системы, кроме того, в начальной стадии болезни IgM антител может не быть, так как они образуются отсроченно. При диагностике с помощью ИФА в 30% случаев выявляются ложноположительные и сомнительные результаты. В этом случае рекомендуют повторно проанализировать образцы параллельно с сыворотками данных больных, взятыми через 7-14 дней, что требует применения дополнительных трудоемких методов, не всегда информативных, и не обеспечивает экспрессность диагностики и точность постановки диагноза. Ложноположительные результаты могут показать сыворотки, содержащие неспецифические белки, присутствующие в сыворотке, например ревматоидный фактор класса М. Вышеуказанные недостатки снижают точность диагностики внутриутробных вирусных инфекций этим методом. Кроме того, ультразвуковое сканирование плода и плаценты - неспецифический метод, который не является достаточно информативным для диагностики внутриутробного инфицирования.

С целью устранения этих недостатков авторы предлагают способ диагностики внутриутробных вирусных инфекции у детей путем вирусологического определения комплекса показателей: антигенов вирусов, специфических иммунных комплексов, нагруженных антигенами, ранних низкоавидных антител в ретроплацентарной крови, крови новорожденного и крови матери.

Технический результат настоящего изобретения состоит в повышении точности и специфичности диагностики активного инфекционного процесса у ребенка. Этот результат достигается тем, что путем морфо-вирусологического исследования плаценты, определения в крови матери и ребенка IgM и IgG авторы в реакции мРСК исследуют ретроплацентарную кровь, кровь ребенка и матери, дополнительно определяют вирусные антигены, специфические иммунные комплексы с антигенами, специфические низкоавидные антитела IgG3, IgG1-2, и при значениях в ретроплацентарной крови вирусного антигена >0,10 ОЕ; уровне специфических иммунных комплексов >0,06 ОЕ; титров антител >1:20 выявляют конкретного возбудителя вирусного плацентита, а при наличии в сыворотке крови ребенка антигена вируса >0,10 ОЕ; СИК >0,06 ОЕ; IgM в титре >1:20; одного из - IgG3, IgG1-2, IgG4 в титрах в 2-4-кратном увеличении в сравнении с титрами матери тех же подклассов IgG; при обнаружении одного из - IgG3, IgG1-2, IgG4 в титре >1:20, а у матери другого из - IgG3, IgG1-2, IgG4 ставят ребенку диагноз внутриутробной вирусной инфекции.

Авторы впервые предложили проведение комплексного вирусологического исследования ретроплацентарной крови, крови новорожденного и матери, так как обследование только одного из вышеперечисленных объектов не дает полной картины инфицирования плода вследствие защитной роли плаценты и особенностей антителогенеза новорожденных (недостаточной выработке IgM и трансплацентарном происхождении IgG от матери). Плацента, по мнению авторов, помимо механического барьера для проникновения вирусов представляет интерес как орган, осуществляющий иммунологическую защиту плода от патогенного агента, при физиологической иммуносупрессии матери во время беременности, усугубляемой вирусной инфекцией. Нами было показано, что в 27% случаев отмечается несовпадение патоморфологического заключения обследования последа и вирусологического анализа ретроплацентарной крови, поэтому необходимо обследовать кровь ребенка и матери, так как по нашим данным реализация подтвержденной вирусной инфекции в плаценте выявлена у 76% детей, а 24% новорожденных были здоровы, тогда как если опираться только на данные обследования плаценты, то ошибочный диагноз внутриутробной инфекции был бы выставлен и этим на самом деле здоровым детям. Полученные данные свидетельствуют о том, что ВУИ последа не означает неизбежное развитие инфекции у ребенка. Но также известно, что вирусное поражение плаценты может привести к патологии внутриутробного периода, развитию у детей инфекционных болезней с типичной клиникой, развитию соматических заболеваний, которые диагностируются сразу при рождении или развиваются через какое-то время (отсроченная патология), рождению внешне здорового ребенка, что свидетельствует о необходимости обследования ретроплацентарной крови.

Как показали авторы, обследование матери целесообразно потому что, иммунный статус детей в периоде новорожденности и в первые годы жизни в значительной степени связан с особенностями течения беременности у их матерей. Концентрация IgM в сыворотке крови у новорожденных обычно (по прототипному способу) в 8-10 раз ниже, чем концентрация IgG.

Диагностика вирусных инфекций у новорожденных затруднена в связи с нередким отсутствием клинически выраженной симптоматики. Обнаружение специфических антител класса IgM у детей раннего возраста однозначно указывает на инфицированность (однако у новорожденных и детей раннего возраста этот класс специфических иммуноглобулинов выявляется редко). Авторы доказали, что значительную помощь в диагностике внутриутробных инфекций оказывает определение различных подклассов низкоавидных IgG-антител (IgG3, IgG1-2).

Авторы впервые предлагают использовать метод мРСК для выявления ряда вирусологических критериев: вирусный антиген, специфические иммунные комплексы с антигенной нагрузкой и специфические антитела классов IgM и IgG различных подклассов (IgG3, IgG1-2, IgG4), указывающих на наличие активного инфекционного процесса на момент обследования. Дополнительное определение низкоавидных антител (IgM, IgG3, IgG1-2), вырабатывающихся на ранних сроках инфекционного процесса и свидетельствующих об обострении заболевания в настоящий момент, способствует своевременной и более точной диагностике внутриутробных инфекций у детей.

Авторы разработали диагностически значимые количественные критерии уровня вирусного антигена в сыворотке крови, концентрации СИК и титров специфических антител различных подклассов Ig.

Способ осуществляется следующим образом: с помощью модифицированной РСК (мРСК) в экстракте ретроплацентарного сгустка и сыворотке крови матери и ребенка проводят определение АГ вирусов и специфические иммунные комплексы (СИК) с учетом превалирования в структуре антигенов вирусов, определение AT различных подклассов Ig (IgM, IgG3, IgG1-2, IgG4). Результат мРСК оценивали в количественном тесте с использованием принципа расщепления ортофенилдиамина (ОФД) оксидазными ферментами, вышедшими из разрушенных эритроцитов барана - тестирующего ингредиента РСК, содержание фермента оценивают на иммуноферментном анализаторе АИФ-Ц-01 С при длине волны 492 нм.

Определение АГ вирусов. В сыворотку 50 мкг крови больных добавляют 50 мкг диагностическую сыворотку, содержащую AT к вирусам (в титре 1/1000), и две дозы комплемента (50 мкг). Через один час контакта в систему вводят гемолитическую смесь (0,85% взвесь бараньих эритроцитов и 10 доз антисыворотки к ним). Оценку опыта проводят через 30 мин. Уровень АГ вирусов рассчитывют по формуле:

АГ ВЭБ=(Кконтрольопыт)/Кконтроль

где Кконтроль - количественный показатель ферментов в контроле исследуемой сыворотки;

Копыт - количественный показатель ферментов в исследуемой сыворотке

За минимальное содержание АГ принимали величину >0,10 ОЕ.

Определение специфических иммунных комплексов (СИК) с превалированием АГ. Постановка данного опыта аналогична опыту по определению АГ, но за наличие СИК с АГ в сыворотке считают результат, дающий при расчете по указанной формуле отрицательную величину. Такой показатель отражает взаимоотношение АГ и AT в комплексе, когда добавление высокоавидных AT и экзогенного комплемента приводило к дестабилизации комплекса и элиминации из него комплементарных белков, усиливающих гемолиз эритроцитов. Диагностически значимым считали уровень СИК с АГ >0,06 ОЕ.

Дифференцировку AT на подклассы М и G осуществляют с помощью 2% суспензии аминокислоты цистеина, разрушающей антитела класса М, определение подклассов IgG1-2, IgG3 и IgG4 проводят расчетным путем с учетом степени сорбции комплемента на иммунные комплексы AT больных, изменений концентрации AT после удаления их 5% суспензией Staph. Cowan 1, а также разрушения их 2% суспензией цистеина.

Описанный способ был апробирован вначале на небольшом материале, полученные хорошие результаты побудили авторов оформить заявочный материал на изобретение и в дальнейшем широко использовать способ диагностики. Было произведено вирусологическое обследование 96 ретроплацентарных сгустков крови из плацент с морфологическими признаками вирусных плацентитов, вирусологически внутриутробные вирусные инфекции, такие как ВПГ 1/2, ЦМВИ, ВЭБ инфекция были подтверждены в 70 (72,9%) случаях. При вирусологическом обследовании пар мать - ребенок диагноз вирусной внутриутробной инфекции был подтвержден у 76,0% обследуемых. Способ можно проиллюстрировать на конкретных примерах:

Пример 1. Больной Ш., 1 месяц. Амбулаторная карта № 263.

Диагноз: внутриутробная ВЭБ инфекция, обострение.

В заключении патоморфологического исследования последа выставлен диагноз ДНК-вирусный плацентит с хронической субкомпенсированной недостаточностью плаценты.

При обследовании ретроплацентарного сгустка с помощью мРСК выявили наличие специфических антител к ВЭБ подкласса IgG1-2 в титре 1:40, АГ ВПГ (0,3 ОЕ) специфических антител к ВПГ подкласса IgG3 в титре 1:56, это свидетельствовало о сочетанном поражении плаценты разными герпесвирусами и позволило установить диагноз - сочетанный ВПГ и ВЭБ плацентит.

В сыворотке крови матери больного были обнаружены СИК с АГ ВЭБ (0,1 ОЕ), специфические антитела к ВЭБ подкласса IgG1-2 в титре 1:28, специфические антитела к ВПГ подкласса IgG4 в титре 1:80. В сыворотке крови ребенка выявили специфические антитела к ВЭБ подкласса IgG3 в титре 1:32, что свидетельствовало о том, что ребенок был инфицирован только ВЭБ (наличие диагностических титров к ВЭБ подкласса IgG3 против IgG1-2 у матери показывало, на принадлежность этих антител именно ребенку и течению у него активного инфекционного процесса), а инфицирование мальчика ВПГ, выявленного у матери и в последе, не состоялось, так как ткани плаценты, очевидно, задержали возбудителя.

На основании полученных данных ребенку был выставлен диагноз: внутриутробная ВЭБ инфекция, обострение.

Пример 2. Больная З., 1 месяц. Амбулаторная карта № 307.

Диагноз: Внутриутробная ЦМВ инфекция, хроническая форма.

В заключении патоморфологичского исследования последа выставлен диагноз ДНК-вирусный плацентит с хронической недостаточностью плаценты и острой декомпенсацией.

При обследовании ретроплацентарного сгустка с помощью мРСК выявили наличие специфических антител к ЦМВ подкласса IgG4 в титре 1:28, это позволило диагностировать ЦМВ плацентит.

В сыворотке крови матери больной были обнаружены специфические антитела к ЦМВ подкласса IgG4 в титре 1:20. В сыворотке крови ребенка выявили специфические антитела к ЦМВ подкласса IgG4 в титре 1:60, что свидетельствовало о хроническом течении ЦМВИ именно у ребенка, так как была выявлена более чем 2-кратная сероконверсия IgG4 к матери.

На основании полученных данных ребенку был выставлен диагноз: внутриутробная ЦМВ инфекция, хроническая форма.

Пример 3. Больная М., 1 месяц. Амбулаторная карта № 315.

Диагноз: Сочетанная внутриутробная вирусная инфекция. ВПГ инфекция, обострение. ЦМВ инфекция, хроническая форма.

В заключении патоморфологичского исследования последа выставлен диагноз: гнойный хориоамнионит, субхориальный интервиллит, эндоваскулит пуповинных сосудов. ДНК-вирусный плацентит с хронической недостаточностью плаценты и острой декомпенсацией.

При обследовании ретроплацентарного сгустка с помощью мРСК выявили наличие специфических антител к ВПГ подкласса IgG1-2 в титре 1:32 и специфических антител к ЦМВ подкласса IgG4 в титре 1:60, это позволило диагностировать сочетанный ВПГ и ЦМВ плацентит.

В сыворотке крови матери больной были обнаружены специфические антитела к ВПГ подкласса IgG1-2 в титре 1:64 и специфические антитела к ЦМВ подкласса IgG4 в титре 1:28. В сыворотке крови ребенка выявили АГ ВПГ (0,4 ОЕ), специфические антитела к ВПГ подкласса IgG3 в титре 1:60, что свидетельствовало об активной ВПГ инфекции у ребенка в момент обследования, так как этап элиминации вируса, о котором судят по подклассу специфических антител, у матери и ребенка был различен, если у матери инфекция уже перешла в хроническую фазу, то у ребенка выявлены маркеры обострения (АГ ВПГ и IgG3). А также у ребенка были обнаружены специфические антитела к ЦМВ подкласса IgG4 в титре 1:80, что свидетельствовало о хроническом течении у девочки ЦМВИ, так как выявлена более чем 2-кратная сероконверсия IgG4 у ребенка к материнским антителам того же подкласса.

На основании полученных данных ребенку был выставлен диагноз: сочетанная внутриутробная вирусная инфекция. ВПГ инфекция, обострение. ЦМВ инфекция, хроническая форма.

Пример 4. Больной Т., 1 месяц. Амбулаторная карта № 329.

Диагноз: здоров.

В заключении патоморфологического исследования последа выставлен диагноз ДНК-вирусный плацентит с хронической субкомпенсированной недостаточностью плаценты.

При обследовании ретроплацентарного сгустка с помощью мРСК выявили наличие специфических антител к ВЭБ подкласса IgG4 в титре 1:40, специфических антител к ЦМВ подкласса IgG4 в титре 1:56, это свидетельствовало о сочетанном поражении плаценты разными герпесвирусами и позволило установить диагноз: сочетанный ВЭБ и ЦМВ плацентит.

В сыворотке крови матери больного были обнаружены специфические антитела к ВЭБ подкласса IgG4 в титре 1:30, специфические антитела к ВПГ подкласса IgG4 в титре 1:42. В сыворотке крови ребенка выявили специфические антитела к ВЭБ подкласса IgG4 в титре 1:20, что свидетельствовало о материнском происхождении этих антител и отсутствии ВЭБ инфекции у самого ребенка, маркеров же ВПГ инфекции у мальчика выявлено не было. Полученные результаты показывают защитную функцию плацентарного барьера в данном случае.

На основании полученных данных ребенку не был выставлен диагноз внутриутробной вирусной инфекции.

Предложенный авторами способ обладает высокой точностью, специфичностью и простотой исполнения, не требует специальной лаборатории и сложного оборудования. Позволяет проводить обследование ребенка и матери на конкретного возбудителя, выявленного вначале в ретроплацентарной крови, что делает исследование более целенаправленным, а также повышает экономическую эффективность диагностики.

Настоящий способ диагностики внутриутробных вирусных инфекций у детей позволяет осуществлять диспансерное наблюдение за детьми с подтвержденной инфекцией, а также проводить противовирусную и иммуномодулирующую терапию и может использоваться в работе детских поликлиник.

Диагностика ПГВИ в ретроплацентарной крови
методпоказателидиагностические значения
обращая мРСКвирусный антител>0,10 OE
СИК>0,06 OE
мРСКIgMтитр>1:20
IgG3титр>1:20
IgG1-2титр>1:20
IgG4титр>1:20
Диагностика ПГВИ у детей
ребенокпоказателидиагностические значения
вирусный антител>0,10 ОЕ
СИК>0,06 ОЕ
IgMтитр>120
Диагностика ПГВИ у детей с учетом вертикальной сероконверсии специфических антител от матери
показателидиагностические значения
матьребенок
IgG3титр>1:20в 2-4 раза больше материнских тигров таких же подклассов антител
IgG1-2титр>1:20
IgG4титр>1:20
Диагностика ПГВИ у ребенка в зависимости от подклассов антител у матери
ребенокмать
IgG3IgG1-2 илиIgG4
lgG1-2IgG3 илиIgG4
IgG4IgG3илиIgG1-2

Способ диагностики внутриутробных вирусных инфекции у детей путем морфологического исследования плаценты, определения в крови матери и ребенка IgM и IgG антител, отличающийся тем, что в реакции мРСК исследуют ретроплацентарную кровь, кровь ребенка и матери, дополнительно определяют вирусные антигены, специфические иммунные комплексы с антигенами, специфические низкоавидные антитела IgG3, IgG1-2 и при значениях в ретроплацентарной крови вирусного антигена >0,10 OE; уровне специфических иммунных комплексов >0,06 ОЕ; титров антител >1:20 выявляют конкретного возбудителя вирусного плацентита, а при наличии в сыворотке крови ребенка антигена вируса >0,10 OE; СИК >0,06 OE; IgM антител в титре >1:20; одного из подклассов антител - IgG3, IgG1-2, IgG4 в титрах в 2-4-кратном увеличении в сравнении с титрами матери тех же подклассов IgG; при обнаружении одного из подклассов антител - IgG3, IgG1-2, IgG4 в титре >1:20, а у матери другого из - IgG3, IgG1-2, IgG4 ставят ребенку диагноз внутриутробной вирусной инфекции.