Свободные от цинка и обедненные цинком инсулиновые композиции с повышенной стабильностью

Свободные от цинка и обедненные цинком инсулиновые композиции с повышенной стабильностью

Реферат

Изобретение относится к стабилизированным фармацевтическим композициям, содержащим полипептид, выбираемый из группы, состоящей из инсулина (как, например, человеческий инсулин, инсулин из поджелудочной железы крупного рогатого скота или свиней), аналога инсулина, производного инсулина, активных метаболитов инсулина или их комбинаций; поверхностно-активное вещество или комбинации нескольких поверхностно-активных веществ и необязательно консервант или комбинации нескольких консервантов, а также необязательно изотонизирующее средство, буферы или другие вспомогательные вещества или их комбинации, причем фармацевтическая композиция обеднена цинком или свободна от него. Эти композиции можно использовать для лечения диабета, и особенно они применимы для использования в инсулиновых насосах, приспособлениях типа "рейсфедер", инжекторах, ингаляторах или для препаратов, для которых необходима повышенная физическая стабильность. Изобретение относится также к парентеральным препаратам, которые включают такие композиции и которые можно применять в случае диабета, а также к способам получения композиций и повышения стабильности инсулинсодержащих композиций.

Примерно 120 миллионов людей во всем мире страдают сахарным диабетом. Сверх того, примерно 12 миллионов являются больными диабетом типа I, для которых замещение отсутствующей эндокринной секреции инсулина представляет собой единственную возможную в настоящее время терапию. Больным диабетом всю жизнь, как правило, многократно в сутки, делают инъекции инсулина. В противоположность диабету типа I в случае диабета типа II в принципе нет недостатка в инсулине, однако во множестве случаев, прежде всего в прогрессирующей стадии, предусматривают лечение инсулином, в случае необходимости, в комбинации с пероральным антидиабетическим средством, в качестве самой благоприятной формы терапии.

В случае здоровых субъектов высвобождение инсулина поджелудочной железой четко связано с концентрацией глюкозы в крови. Повышенные уровни глюкозы в крови, которые возникают после приема пищи, быстро компенсируются соответствующим увеличением секреции инсулина. В состоянии натощак уровень инсулина в плазме снижается до базального значения, которого достаточно для обеспечения непрерывного снабжения чувствительных к инсулину органов и тканей глюкозой и поддержания низким гепатического продуцирования глюкозы в течение ночи. Замена присущей организму секреции инсулина экзогенным, чаще всего подкожным, введением инсулина, как правило, не вызывает достижения вышеописанного качества физиологической регуляции глюкозы в крови. Часто наблюдаются отклонения уровня глюкозы в крови в большую или меньшую сторону, которые в самых тяжелых формах могут быть угрожающими для жизни. Наряду с этим, однако, повышенные в течение ряда лет уровни глюкозы в крови без первоначальных симптомов представляют собой значительную опасность для здоровья. Путем широкомасштабного исследования DCCT в США (исследовательская группа по изучению контроля и осложнений в случае диабета) (N. Engl. J. Med., 329, 977-986 (1993)) однозначно доказано, что хронически повышенные уровни глюкозы в крови в значительной степени ответственны за возникновение поздних диабетических повреждений. Поздними диабетическими повреждениями являются микро- и макроваскулярные повреждения, которые проявляются, смотря по обстоятельствам, в виде ретино-, нефро- или невропатии и приводят к потере зрения, почечной недостаточности, а также к потере конечностей и, сверх того, сопровождаются повышенным риском сердечно-сосудистых заболеваний. Из этого можно сделать вывод, что улучшенная терапия диабета в первую очередь должна быть направлена на поддержание уровня глюкозы в крови по возможности близко к физиологической области. Согласно концепции усиленной инсулиновой терапии это должно достигаться путем многократных суточных инъекций быстро и медленно действующих инсулинсодержащих композиций. Быстро действующие препараты вводят в момент приема пищи с целью компенсации повышения уровня глюкозы в крови после приема пищи. Медленно действующие базальные инсулины должны обеспечивать основное снабжение инсулином в особенности в течение ночи, не приводя к гипогликемии.

Инсулин представляет собой полипептид из 51 аминокислоты, которые распределяются на 2 аминокислотные цепи: цепь А из 21 аминокислоты и цепь В из 30 аминокислот. Цепи связаны друг с другом двумя дисульфидными мостиками. Инсулинсодержащие композиции уже многие годы используют для терапии диабета. При этом применяют не только инсулины природного происхождения, но и с недавних пор также производные и аналоги инсулина.

Аналоги инсулина представляют собой аналоги инсулинов природного происхождения, а именно человеческий инсулин или инсулины животного происхождения, которые отличаются замещением по меньшей мере одного нативно встречающегося аминокислотного остатка другими аминокислотными остатками и/или присоединением/удалением по меньшей мере одного аминокислотного остатка из соответствующего, в остальном такого же, как нативно встречающийся, инсулина. В случае добавляемых и/или заменяемых аминокислотных остатков речь также может идти о таковых, которые нативно не встречаются.

Производными инсулина являются производные инсулина природного происхождения или аналога инсулина, которые получают путем химической модификации. Химическая модификация может состоять, например, в присоединении одной или нескольких определенных химических групп к одной или нескольким аминокислотам.

Как правило, производные и аналоги инсулина по сравнению с человеческим инсулином обладают немного измененным действием.

Аналоги инсулина с ускоренным наступлением действия описываются в европейских патентах ЕР 0214826, ЕР 0375437 и ЕР 0678522. Патент ЕР 0124826 относится, в частности, к замещениям в положениях В27 и В28. В патенте ЕР 0678522 описываются аналоги инсулина, которые в положении В29 содержат различные аминокислоты, предпочтительно пролин, но не глутаминовую кислоту. Патент ЕР 0375437 охватывает аналоги инсулина с лизином или аргинином в В28, которые необязательно дополнительно могут быть модифицированы в В23 и/или А21.

В европейском патенте ЕР 0419504 раскрыты аналоги инсулина, которые защищены от химических модификаций, изменены в случае аспарагина в В3 и по меньшей мере в случае одной другой аминокислоты в положениях А5, А15, А18 или А21.

В международной заявке WO 92/00321 описываются аналоги инсулина, в случае которых по меньшей мере одна аминокислота в положениях В1-В6 заменена лизином или аргинином. Такого рода инсулины, согласно заявке WO 92/00321, обладают пролонгированным действием.

Имеющиеся в продаже инсулиновые композиции с инсулинами природного происхождения в отношении замены инсулина различаются происхождением инсулина (например, инсулин из поджелудочной железы крупного рогатого скота, свиней; человеческий инсулин), а также составом, вследствие чего можно влиять на профиль действия (наступление и продолжительность действия). Путем комбинации различных инсулиновых препаратов можно достигать самых различных профилей действия и устанавливать по возможности физиологические уровни сахара в крови. С некоторых пор в продаже имеются не только указанные инсулины природного происхождения, но и также композиции, включающие производные или аналоги инсулина, которые обладают измененной кинетикой. Рекомбинантная ДНК-технология на сегодняшний день позволяет получать такие модифицированные инсулины. К ним относятся так называемые мономерные аналоги инсулина, как инсулин Lispro, инсулин Aspart и HMR1964 (Lys(B3)-Glu(B29)-человеческий инсулин) с быстрым наступлением действия, а также инсулин Glargin с пролонгированной продолжительностью действия.

Наряду с продолжительностью действия для пациентов очень важна стабильность композиции. Стабилизированные инсулиновые композиции с повышенной физической долговременной стабильностью необходимы в особенности для композиций, которые подвергаются особым механическим нагрузкам или повышенным температурам. К ним относятся, например, инсулины в системах введения, как приспособления типа "рейсфедер", системы для ингаляции, неигловидные инъекционные системы или инсулиновые насосы. Инсулиновые насосы либо помещают, либо имплантируют в тело пациента. В обоих случаях композиция подвергается воздействию температуры тела и передвижению, а также нагнетательному движению насоса и, таким образом, очень высокой термомеханической нагрузке. Так как приспособления типа "рейсфедер" для введения инсулина (одноразовые или повторно применимые приспособления типа "рейсфедер") чаще всего также помещают на тело, в этом случае происходит то же самое. Существующие до сих пор композиции в этих условиях обладают только ограниченной стабильностью. В нейтральном растворе при фармацевтической концентрации инсулин находится в форме стабилизированных цинксодержащих гексамеров, которые состоят из трех идентичных димерных единиц (Brange и др., Diabetes Care, 13, 923-954 (1990)). Путем удлинения аминокислотной последовательности можно уменьшать ассоциацию инсулина. Так, например, аналог инсулина Lispro находится преобладающе в виде мономера и благодаря этому быстрее резорбируется и обладает более короткой продолжительностью действия (HPT Ammon и C. Werning, Antidiabetika, 2-е издание, Wiss. Verl.-Ges., Штуттгарт, 2000 г., с. 94 и последующие). Именно быстро действующие аналоги инсулина, которые находятся в мономерной или димерной форме, обладают пониженной стабильностью и повышенной склонностью к агрегации при термической и механической нагрузке. Они часто становятся заметными в виде помутнений и осадков нерастворимых агрегатов (Bakaysa и др., патент US 5474978). Эти более высокомолекулярные продукты превращения (димеры, тримеры, полимеры) и агрегаты снижают не только введенную дозу инсулина, но и могут провоцировать раздражения или иммунные реакции у пациента. Кроме того, такие нерастворимые агрегаты могут наносить ущерб и закупоривать канюли и шланги насосов. Так как цинк приводит к дополнительной стабилизации инсулина, свободные от цинка или обедненные цинком композиции с инсулином и аналогами инсулина особенно подвержены нестабильностям. В особенности мономерные аналоги инсулина с быстрым наступлением действия очень быстро склонны к агрегации и физическим нестабильностям, так как происходит образование нерастворимых агрегатов из мономеров инсулина. Для обеспечения качества инсулиновой композиции необходимо избегать образования агрегатов.

Существуют различные подходы к стабилизации инсулинсодержащих композиций. Так, в международной заявке WO 98/56406 описаны стабилизированные композиции за счет включающего ТРИС или аргинин буфера. В патенте US 5866538 описывается инсулинсодержащая композиция, которая содержит глицерин и хлорид натрия в концентрациях 5-100 ммоль и должна обладать повышенной стабильностью. В патенте US 5948751 описываются инсулинсодержащие композиции с повышенной физической стабильностью, которая достигается добавлением маннита или подобных сахаров. Добавка избыточного количества цинка к цинксодержащему раствору инсулина также может повышать стабильность (J. Brange и др., Diabetic Medicine, 3, 532-536 (1986)). Также подробно описано влияние значения рН и различных вспомогательных веществ на стабильность инсулинсодержащих композиций (J. Brange и L. Langkjaer, Acta Pharm. Nordica, 4, 149-158). Часто эти способы стабилизации недостаточны в случае повышенных требований (повышение стойкости при комнатной температуре или температуре тела и механической нагрузке) или в случае так называемых мономерных аналогов инсулина или быстро действующих инсулинов, которые особенно подвержены физическому стрессу. К тому же все коммерчески доступные инсулинсодержащие композиции содержат цинк, который добавляют для стабилизации композиции. Так, Bakaysa и др. в патенте US 5474978 описывают стабилизированные композиции из комплексов инсулина, которые состоят из 6 мономеров аналогов инсулина, 2 атомов цинка и по меньшей мере 3 молекул консерванта на основе фенола. Дополнительно эти композиции могут содержать физиологически приемлемый буфер и консервант. Если, напротив, хотят получить свободные от цинка или обедненные им инсулиновые композиции, то указанные способы стабилизации недостаточны для пригодной для продажи композиции. Например, нельзя получить не содержащую цинка композицию на основе инсулина Lispro из-за недостаточной физической стабильности (Bakaysa и др., Protein Science, 5, 2521-2531 (1996)). Обедненные цинком или не включающие его инсулинсодержащие композиции с достаточной стабильностью, в особенности физической стабильностью, в уровне техники не описаны.

Таким образом, задачей изобретения является получение свободных от цинка композиций на основе инсулинов или их производных и аналогов, которые отличаются высокой стабильностью.

Неожиданно было показано, что добавка поверхностно-активных веществ (эмульгаторов), как, например, полоксамеры или полисорбаты (Твин^®) может резко повышать стабильность инсулиновых композиций и, таким образом, даже можно приготовлять свободные от цинка композиции, которые обладают превосходной стабильностью, чтобы их можно было применять также в инфузионных насосах или других системах введения. Эти композиции особенно в стрессовых условиях обладают повышенной стабильностью. Это имеет значение как для инсулина, так и для аналогов, производных инсулина или их смесей.

В нейтральных композициях инсулин образует комплексы с ионами цинка. При этом в случае достаточной концентрации цинка из 6 молекул инсулина и 2 ионов цинка образуются стабильные гексамеры. Для образования этой структуры необходима концентрация цинка по меньшей мере 0,4% (мас./мас.) по отношению к инсулину. В случае композиции со 100 ед/мл инсулина это соответствует концентрации примерно 13 мкг/мл цинка. Избыток цинка (например, 4 иона цинка на гексамер) еще более отчетливо стабилизирует композицию по отношению к физическому стрессу (J. Brange и др. "Neutral insulin solutions physically stabilized by the addition of Zn²⁺", Diabetic Med., 3, 532-536 (1986)). В противоположность этому в композициях с более незначительными концентрациями цинка (<0,4 мас. % по отношению к инсулину) образование гексамеров понижено. Это приводит к очень пониженной стабильности композиции (J. Brange и L. Langkjaer, Acta Pharm. Nord, 4, 149-158 (1992)). Термины "свободный от цинка" или "обедненный цинком" согласно настоящей заявке означают наличие менее чем 0,4 мас. % цинка по отношению к содержанию инсулина в композиции, предпочтительно менее чем 0,2 мас. % по отношению к содержанию инсулина. В случае общеупотребимой инсулинсодержащей композиции со 100 ед. на мл (0,6 мкмоль/мл) это означает, например, концентрацию ионов Zn⁺⁺ менее чем 13 мкг/мл (0,2 мкмоль/мл), предпочтительно менее чем 6,5 мкг/мл ионов Zn⁺⁺, в фармацевтической композиции по отношению к концентрации инсулина 100 ед./мл. Освобождения от цинка также можно достигать путем добавления комплексующихся с цинком веществ, как, например, цитрат или этилендиаминтетрауксусная кислота, так что для образования гексамерного комплекса инсулин/цинк не имеется в достаточном количестве ионов цинка.

Фармацевтические композиции содержат 60-6000 нмоль/мл, предпочтительно 240-3000 нмоль/мл, инсулина, метаболита инсулина, аналога инсулина или производного инсулина.

В качестве поверхностно-активных веществ можно применять, в частности, неионные или ионные (анионные, катионные или амфотерные) поверхностно-активные вещества. В особенности предпочтительны фармацевтически обычно применяемые поверхностно-активные вещества, как, например, мыла щелочных металлов, аминов и щелочно-земельных металлов (стеараты, пальмитаты, олеаты, рициноляты), алкилсульфаты и алкилсульфонаты (лаурилсульфат натрия, цетилсульфат натрия, стеарилсульфат натрия), нативные поверхностно-активные вещества (соли желчных кислот, сапонины, гуммиарабик), катионные поверхностно-активные вещества (альконийбромиды, цетилпиридинийхлорид, цетримид), жирные спирты (цетиловый спирт, стеариловый спирт, холестерин), неполные и полные эфиры жирных кислот и многоатомных спиртов, как глицерина, сорбита и других (Span^®, Tween^®, Myrj^®, Brij^®), Cremophor^® или полоксамеры.

Поверхностно-активные вещества находятся в фармацевтической композиции в концентрации 0,1 мкг/мл-10000 мкг/мл, предпочтительно 1 мкг/мл-1000 мкг/мл.

Композиция может содержать, далее, консерванты (как, например, фенол, крезол, парабены), изотонизирующие средства (как, например, маннит, сорбит, лактоза, декстроза, трегалоза, хлорид натрия, глицерин), буферные вещества, соли, кислоты и щелочи, а также другие вспомогательные вещества. Эти вещества могут присутствовать, соответственно, индивидуально или также в виде смесей.

Глицерин, декстроза, лактоза, сорбит и маннит обычно находятся в фармацевтической композиции в концентрации 100-250 ммоль, NaCl - в концентрации вплоть до 150 ммоль. Буферные вещества, как, например, фосфатный, ацетатный, цитратный, аргининовый, глицилглициновый или ТРИС- (то есть 2-амино-2-гидроксиметил-1,3-пропандиол) буфер, а также соответствующие соли находятся в концентрации 5-250 ммоль, предпочтительно 10-100 ммоль. Другими вспомогательными веществами могут быть, в частности, соли, аргинин, протамин или Сурфен^®.

Объектом изобретения поэтому является фармацевтическая композиция, содержащая полипептид, выбираемый из группы, состоящей из инсулина, аналога инсулина, производного инсулина, активного метаболита инсулина или их комбинации; поверхностно-активное вещество или комбинации нескольких поверхностно-активных веществ; необязательно консервант или комбинации нескольких консервантов; и необязательно изотонизирующее средство, буферные вещества и/или другие вспомогательные вещества или их комбинации, причем фармацевтическая композиция свободна от цинка или обеднена цинком; предпочтительной является такая фармацевтическая композиция, где поверхностно-активное вещество выбрано из группы, состоящей из мыл щелочных металлов, аминов, щелочно-земельных металлов; алкилсульфатов, алкилсульфонатов, нативных поверхностно-активных веществ, катионных поверхностно-активных веществ, жирных спиртов, неполных и полных эфиров жирных кислот и многоатомных спиртов, как глицерина и сорбита, полиолов; причем указанные соли жирных кислот выбраны из группы, состоящей из стеаратов, пальмитатов, олеатов, рицинолятов; причем алкилсульфаты выбраны из группы, состоящей из лаурилсульфата натрия, цетилсульфата натрия, стеарилсульфата натрия; причем нативные поверхностно-активные вещества выбраны из группы, состоящей из солей желчных кислот, сапонинов, гуммиарабика, лецитинов; причем катионные поверхностно-активные вещества выбраны из группы, состоящей из альконийбромидов, цетилпиридинийхлорида, цетримида^®; причем жирные спирты выбраны из группы, состоящей из цетилового спирта, стеарилового спирта, холестерина; причем неполные и полные эфиры жирных кислот и простые эфиры глицерина и сорбита выбраны из группы, состоящей из Span^®, Tween^®, Myrj^®, Brij^®, Cremophor^®; причем полиолы выбраны из группы, состоящей из полипропиленгликолей, полиэтиленгликолей, полоксамеров, плюроников, тероников; причем консервант выбран из группы, состоящей из фенола, крезола, парабенов; причем изотонизирующее средство выбрано из группы, состоящей из маннита, сорбита, хлорида натрия, глицерина; причем вспомогательные вещества выбраны из группы, состоящей из буферных веществ, кислот, щелочей; причем инсулин является инсулином природного происхождения, как, например, человеческий инсулин, инсулин из поджелудочной железы крупного рогатого скота или свиней; причем аналог инсулина выбран из группы, состоящей из Gly(A21)-Arg(B31)-Arg(B32)-человеческого инсулина; Lys(B3)-Glu(B29)-человеческого инсулина; Lys^B28Pro^B29-человеческого инсулина, В28Asp-человеческого инсулина, человеческого инсулина, в случае которого пролин в положении В28 заменен на Asp, Lys, Leu, Val или Ala и где в положении В29 Lys может быть заменен на Pro; Ala(B26)-человеческого инсулина; дез(B28-B30)-человеческого инсулина; дез(B27)-человеческого инсулина или дез(B30)-человеческого инсулина; причем производное инсулина выбирают из группы, состоящей из В29-N-миристоил-дез(B30)-человеческого инсулина, В29-N-пальмитоил-дез(B30)-человеческого инсулина, В29-N-миристоил-человеческого инсулина, В29-N-пальмитоил-человеческого инсулина, В28-N-миристоил-Lys^B28Pro^B29-человеческого инсулина, В28-N-пальмитоил-Lys^B28Pro^B29-человеческого инсулина, В30-N-миристоил-Thr^B29Lys^B30-человеческого инсулина, В30-N-пальмитоил-Thr^B29Lys^B30-человеческого инсулина, В29-N-(N-пальмитоил-γ-глутамил)-дез(B30)-человеческого инсулина, В29-N-(N-литохолил-γ-глутамил)-дез(B30)-человеческого инсулина, В29-N-(ω-карбоксигептадеканоил)-дез(B30)-человеческого инсулина и В29-N-(ω-карбоксигептадеканоил)-человеческого инсулина.

Другим объектом изобретения является фармацевтическая композиция, как описанная выше, в которой инсулин, аналог инсулина, активный метаболит инсулина и/или производное инсулина находится в концентрации 60-6000 нмоль/мл, предпочтительно в концентрации 240-3000 нмоль/мл (это соответствует примерно концентрации 1,4-35 мг/мл или 40-500 ед./мл); в которой поверхностно-активное вещество находится в концентрации 0,1-10000 мкг/мл, предпочтительно в концентрации 1-1000 мкг/мл.

Следующим объектом изобретения является фармацевтическая композиция, как указанная выше, в которой глицерин и/или маннит находится в концентрации 100-250 ммоль, и/или хлорид предпочтительно находится в концентрации вплоть до 150 ммоль.

Дальнейшим объектом изобретения является фармацевтическая композиция, как указанная выше, в которой буферное вещество находится в концентрации 5-250 ммоль.

Другим объектом изобретения является инсулинсодержащая композиция, включающая добавки, как, например, соли, протамин или Сурфен^®, которые замедляют высвобождение инсулина. К нему также относятся смеси из таких инсулинов в депо-форме с вышеописанными композициями.

Другим объектом изобретения является также способ получения таких фармацевтических композиций.

Также следующим объектом изобретения является применение таких композиций для лечения сахарного диабета.

Дальнейшим объектом изобретения является применение, соответственно, добавление поверхностно-активных веществ в качестве стабилизатора во время процесса получения инсулина, аналогов инсулина, или производных инсулина, или содержащих их композиций.

В описанных фармацевтических композициях, содержащих полипептид, выбираемый из группы, состоящей из инсулина, аналога инсулина, производного инсулина, активного метаболита инсулина или их комбинаций, значение рН составляет 2-12, предпочтительно 6-8,5 и особенно предпочтительно 7-7,8.

Ниже изобретение поясняется с помощью примеров, которые никоим образом не должны ограничивать объема охраны.

Примеры

Сравнительные исследования

Получают различные, не содержащие цинка композиции с аналогом инсулина HMR1964 (Lys(B3), Glu(B29)-человеческий инсулин). Для этого не содержащий цинка HMR1964 и остальные компоненты растворяют в одной части воды для инъекций, устанавливают значение рН при 7,3±0,2 с помощью соляной кислоты/NaOH и доливают до конечного объема. Концентрация HMR1964 в каждом из нижеописанных опытов составляет 3,5 мг/мл (соответствует 100 ед./мл). Вторую композицию готовят идентичным образом, однако добавляют еще определенное количество поверхностно-активного вещества. Растворами заполняют стеклянные сосуды (пузырьки) емкостью 5 мл или 10 мл и закатывают. Эти сосуды теперь используют в стрессовых условиях.

1. Ротационный тест: 5 сосудов с загрузкой, а также 5 сосудов со сравнительной загрузкой подвергают ротационному тесту. Для этого сосуды устанавливают в ротаторе и вращают при температуре 37°С со скоростью 60 оборотов в минуту через головную часть (360°). Спустя определенные периоды времени сравнивают помутнение находящихся в сосудах композиций по отношению к стандарту мутности или определяют с помощью лабораторного фотометра для измерения мутности (нефелометра) в формазиновых нефелометрических единицах (FNU). Опыт осуществляют до тех пор, пока во всех сосудах показатель мутности не превысит 18 FNU.

2. Вибрационный тест: сосуды устанавливают на лабораторном вибраторе в инкубаторе и встряхивают при температуре 30°С со скоростью 100 перемещений в минуту. Спустя определенные периоды времени определяют показатель мутности образцов с помощью лабораторного фотометра для измерения мутности (нефелометра) в формазиновых нефелометрических единицах (FNU).

Пример 1

Стабилизация HMR1964 путем добавления цинка в ротационном тесте

а) В водном растворе, содержащем в конечном составе, 2,7 мг/мл м-крезола, 20 мг/мл глицерина и 6 мг/мл трометамола (Трис), растворяют не содержащий цинка HMR1964 (таким образом, рассчитано, что в готовой композиции достигают концентрации 3,5 мг/мл) и устанавливают значение рН при 7,2-7,4 с помощью 1 н. соляной кислоты/1 н. раствора NaOH (измерено при комнатной температуре). Раствор доливают водой до конечного объема и фильтруют в стерильных условиях через фильтр 0,2 мкм. Затем раствором заполняют бутылочки для инъекций емкостью 5 мл и закрывают крышками.

b) Сравнительный раствор готовят аналогичным образом, однако перед давлением воды вводят соответствующее количество 0,1%-ного исходного раствора хлорида цинка, так что в готовой композиции получают содержание цинка 15 мкг/мл.

Соответственно, 5 образцов затем подвергают ротационному тесту и определяют помутнение спустя различные периоды времени. Результаты представлены в нижеследующей таблице.

	Число образцов для испытаний с помутнением >18 FNU спустя
Описание	0 ч	8 ч	16 ч	32 ч	40 ч	56 ч
HMR1964 без добавки	0	5	-	-	-	-
HMR1964+15 мкг/мл Zn	0	0	0	0	4	5

Добавка цинка отчетливо замедляет возникающее помутнение раствора и благодаря этому стабилизирует композицию с HMR1964. Без добавки цинка уже спустя 8 часов в ротационном тесте композиция проявляет отчетливое помутнение.

Пример 2

Стабилизация HMR1964 путем добавки полисорбата 20 (Твин^® 20) в ротационном тесте

а) В водном растворе, содержащем, в конечном составе 3,15 мг/мл м-крезола, 5 мг/мл NaCl и 6 мг/мл трометамола, растворяют не содержащий цинка HMR1964 (таким образом, рассчитано, что в готовой композиции достигают концентрации 3,5 мг/мл) и устанавливают значение рН при 7,2-7,4 с помощью 1 н. соляной кислоты/1 н. раствора NaOH (измерено при комнатной температуре). Раствор доливают водой до конечного объема и фильтруют в стерильных условиях через фильтр 0,2 мкм. Затем раствором заполняют бутылочки для инъекций емкостью 5 мл и закрывают крышками.

b) Сравнительный раствор готовят аналогичным образом, однако перед добавлением воды вводят соответствующее количество 0,1%-ного исходного раствора полисорбата 20 (Твин^® 20), так что в готовой композиции достигают концентрации 10 мкг/мл.

Соответственно, 5 образцов затем подвергают ротационному тесту и определяют помутнение спустя различные периоды времени. Результаты представлены в нижеследующей таблице.

	Число образцов для испытаний с помутнением >18 FNU спустя
Описание	0 ч	8 ч	16 ч	24 ч	32 ч	40 ч
HMR1964 без добавки	0	5	-	-	-	-
HMR1964+10 мкг/мл Твин® 20	0	0	0	0	5	-

Добавка полисорбата 20 очень отчетливо замедляет появление помутнения.

Пример 3

Стабилизация HMR1964 путем добавки полоксамера

в ротационном тесте

а) В водном растворе, содержащем в конечном составе 4,5 мг/мл фенола, 5 мг/мл NaCl и 6 мг/мл трометамола, растворяют не содержащий цинка HMR1964 (таким образом, рассчитано, что в готовой композиции достигают концентрации 3,5 мг/мл) и устанавливают значение рН при 7,2-7,4 с помощью 1 н. соляной кислоты/1 н. раствора NaOH (измерено при комнатной температуре). Раствор доливают водой до конечного объема и фильтруют в стерильных условиях через фильтр 0,2 мкм. Затем раствором заполняют бутылочки для инъекций емкостью 5 мл и закрывают крышками.

b) Сравнительный раствор готовят аналогичным образом, однако перед добавлением воды вводят соответствующее количество 0,1%-ного исходного раствора полоксамера 171 (как, например, Genapol^®), так что в готовой композиции достигают концентрации 10 мкг/мл.

Соответственно, 5 образцов затем подвергают ротационному тесту и определяют помутнение спустя различные периоды времени. Результаты представлены в нижеследующей таблице.

	Число образцов для испытаний с помутнением >18 FNU спустя
Описание	0 ч	8 ч	16 ч	24 ч	32 ч	40 ч
HMR1964 без добавки	0	5	-	-	-	-
HMR1964+0,01 мкг/мл полоксамера 171	0	0	0	2	5	-

Также добавка полоксамера 171 отчетливо замедляет появление помутнений и стабилизирует композицию.

Пример 4

Стабилизация HMR1964 путем добавки полисорбата 20, соответственно, полисорбата 80 в вибрационном тесте

а) В водном растворе, содержащем в конечном составе 3,15 мг/мл м-крезола, 5 мг/мл NaCl и 6 мг/мл трометамола, растворяют не содержащий цинка HMR1964 (таким образом, рассчитано, что в готовой лекарственной форме достигают концентрации 3,5 мг/мл) и устанавливают значение рН при 7,2-7,4 с помощью 1 н. соляной кислоты/1 н. раствора NaOH (измерено при комнатной температуре). Раствор доливают водой до конечного объема и фильтруют в стерильных условиях через фильтр 0,2 мкм. Затем раствором заполняют бутылочки для инъекций емкостью 5 мл и закрывают крышками.

b) Сравнительный раствор готовят аналогичным образом, однако перед добавлением воды вводят соответствующее количество 0,1%-ного исходного раствора полисорбата 20 (Твин^®20), так что в готовой композиции достигают концентрации 10 мкг/мл.

c) Готовят другой сравнительный раствор таким же образом, как в b), однако на этот раз вместо полисорбата 20 используют полисорбат 80 (Твин^® 80).

Образцы при температуре 30°С подвергают встряхиванию на лабораторном вибраторе (60 оборотов в минуту) и спустя определенные периоды времени измеряют помутнение образцов. Результаты представлены в нижеследующей таблице.

	Вибрационный тест, помутнение (FNU) спустя
Добавка	Исходный	1 неделя	2 недели	3 недели	4 недели
Без добавки	0,55	2,04	4,86	6,12	10,51
0,01 мг/мл Твин 20	1,75	2,60	2,44	2,44	3,80
0,01 мг/мл Твин 80	2,38	2,98	2,86	3,01	4,14

Как добавка полисорбата 20, так и добавка полисорбата 80 в вибрационном тесте оказывают стабилизирующее воздействие на HMR1964.

Пример 5

Стабилизация HMR1964 путем добавки цинка или полоксамера (Genapol^®) в вибрационном тесте

а) В водном растворе, содержащем в конечном составе 3,3 мг/мл фенола, 5 мг/мл NaCl и 6 мг/мл трометамола, растворяют не содержащий цинка HMR1964 (таким образом, рассчитано, что в готовой композиции достигают концентрации 3,5 мг/мл) и устанавливают значение рН при 7,2-7,4 с помощью 1 н. соляной кислоты/1 н. раствора NaOH (измерено при комнатной температуре). Раствор доливают водой до конечного объема и фильтруют в стерильных условиях через фильтр 0,2 мкм. Затем раствором заполняют бутылочки для инъекций емкостью 5 мл и закрывают крышками.

b) Сравнительный раствор готовят аналогичным образом, однако перед добавлением воды вводят соответствующее количество 0,1%-ного исходного раствора полоксамера 171 (Genapol^®), так что в готовой композиции достигают концентрации 10 мкг/мл.

c) Готовят другой сравнительный раствор таким же образом, как в b), однако вместо полоксамера к раствору перед доливкой водой добавляют соответствующее количество 0,1%-ного исходного раствора хлорида цинка, так что в готовой композиции достигают концентрации цинка 15 мкг/мл.

	Вибрационный тест, помутнение (FNU) спустя
Добавка	Исходный	1 неделя	2 недели	3 недели	4 недели
Без добавки	0,39	0,70	4,46	8,74	14,11
0,01 мг/мл полок-самера	0,36	0,57	0,52	1,59	0,89
0,015 мг/мл Zn	1,02	0,68	0,70	0,56	0,86

Как добавка цинка, так и добавка полоксамера предотвращают появление помутнений в вибрационном тесте.

Пример 6

Стабилизация HMR1964 путем добавки полоксамера

в ротационном тесте

а) В водном растворе, содержащем в конечном составе 3,3 мг/мл фенола, 5 мг/мл NaCl и 6 мг/мл трометамола, растворяют не содержащий цинка HMR1964 (таким образом, рассчитано, что в готовой композиции достигают концентрации 3,5 мг/мл) и устанавливают значение рН при 7,2-7,4 с помощью 1 н. соляной кислоты/1 н. раствора NaOH (измерено при комнатной температуре). Раствор доливают водой до конечного объема и фильтруют в стерильных условиях через фильтр 0,2 мкм. Затем раствором заполняют бутылочки для инъекций емкостью 5 мл и закрывают крышками.

b) Сравнительный раствор готовят аналогичным образом, однако перед добавлением воды вводят соответствующее количество 0,1%-ного исходного раствора полоксамера 171 (Genapol^®), так что в готовой композиции достигают концентрации 100 мкг/мл.

Соответственно, 5 образцов затем подвергают ротационному тесту и определяют помутнение спустя различные периоды времени. Результаты представлены в нижеследующей таблице.

	Число образцов для испытаний с помутнением >18 FNU спустя
Описание	0 ч	8 ч	16 ч	24 ч	32 ч	40 ч
HMR1964 без добавки	0	5	-	-	-	-
HMR1964+0,10 мкг/мл полоксамера 171	0	0	0	0	1	5

Добавка 100 мкг/мл полоксамера также очень отчетливо стабилизирует композицию с HMR1964.

1. Фармацевтическая композиция, содержащая Lys (B3), Glu (B29), человеческий инсулин; и поверхностно-активное вещество или комбинации нескольких поверхностно-активных веществ, причем поверхностно-активное вещество выбрано из группы, включающей Tween® (полисорбат); причем фармацевтическая композиция свободна от цинка или содержит менее 0,2 вес.% цинка в расчете на содержание инсулина в композиции.

2. Фармацевтическая композиция по п.1, в которой Lys (B3), Glu (B29), человеческий инсулин находится в концентрации 60-6000 нмоль/мл.

3. Фармацевтическая композиция по п.2, в которой Lys (B3), Glu (B29), человеческий инсулин находится в концентрации 240-3000 нмоль/мл.

4. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-3, в которой поверхностно-активное вещество находится в концентрации 10 мкг/мл.

5. Фармацевтическая композиция по п.1, дополнительно содержащая крезол, трометамол и NaCl.

6. Способ получения фармацевтической композиции по любому из пп.1-5, в котором компоненты в виде водных растворов объединяют, затем устанавливают значение рН 7,2-7,4, добавляют полисорбат, доводят до конечного объема водой, затем фильтруют.

7. Способ получения фармацевтической композиции по п.6, в котором достигают конечной концентрации 3,15 мг/мл крезола, 3,5 мг/мл HMR1964, 6,0 мг/мл трометамола, 5,0 мг/мл NaCl и 0,1 мг/мл Твин® 20.

8. Фармацевтическая композиция, полученная способом по любому из п.6 или 7.