Векторы для доставки молекул к экспрессирующим cd11b клеткам

Векторы для доставки молекул к экспрессирующим cd11b клеткам

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение относится к новому применению аденилциклазного токсина Bordetella в приготовлении векторов для нацеливания in vivo представляющей интерес молекулы конкретно на экспрессирующие CD11b клетки. Данное изобретение относится также к иммуногенной композиции, которая примирует иммунные реакции, к фармацевтическим композициям и новому вектору для доставки молекул к экспрессирующим CD11b клеткам.

Bordetella pertussis, этиологический агент коклюша, секретирует несколько токсинов, в том числе хорошо известный токсин коклюша (РТ) и аденилатциклазный токсин (CyaA), или также аденилциклазу. CyaA является в мышиной респираторной модели критическим фактором вирулентности B. pertussis, который является необходимым для ранних стадий колонизации легких. Действительно, генетическая делеция этого токсина разительно уменьшает патологические эффекты инфекции B. pertussis, снижая число бактерий, извлекаемых из легких, и почти устраняя рекрутинг воспалительных клеток и повреждение легких, наблюдаемое после инфекции [Weiss et al., 1984; Weiss et al., 1989; Gross et al., 1992; Khelef et al., 1992; Khelef et al., 1994; Gueirard et al., 1998]. Кроме того, CyaA является защитным антигеном против инфекции B. pertussis в мышиной респираторной модели [Guiso et al., 1989; Guiso et al., 1991].

Первоначально обнаруженная Hewlett et al. в культуральных супернатантах B. pertussis [Hewlett et al., 1976] аденилциклаза, как было позднее обнаружено, активируется эукариотическим кальмодулином [Wolff et al., 1980]. Этот поразительный признак быстро нашел логическое обоснование, когда было показано Confer и Eaton, что аденилциклаза может проникать в эукариотические клетки, где при активации кальмодулином она может запускать процесс значительного увеличения цАМФ в этих клетках-мишенях [Confer et al., 1982].

Аденилциклаза кодируется геном cyaA, и его экспрессия, подобно экспрессии других генов вирулентности B. pertussis, координированно регулируется сигналами окружающей среды. Ген cyaA является частью оперона, который содержит также гены cyaB, D и Е, которые необходимы для секреции CyaA [Ladant et al., 1999].

Токсин CyaA является бифункциональным белком из 1706 остатков, который состоит из N-концевого каталитического домена из 400 аминокислот и С-концевой части из 1306 остатков, которая является ответственной за связывание этого токсина с мембраной клетки-мишени и последующую доставку этой каталитической части молекулы в цитозоль клетки [Sakamoto et al., 1992] [Ladant et al., 1999]. Эта часть проявляет также слабую гемолитическую активность вследствие ее способности образовывать катионселективные каналы в биологических мембранах [Benz et al., 1994] [Gray et al., 1998]. Этот район является гомологичным гемолизину Escherichia coli и другим членам семейства RTX (Repeat in ToXin) бактериальных токсинов. В частности, он содержит ряд богатых глицином и аспартатом нанопептидных повторов, которые участвуют в связывании кальция [Rose et al., 1995] [Coote et al., 1992].

Полипептид CyaA синтезируется в виде неактивного протоксина, который превращается в активный токсин в результате посттрансляционного пальмитоилирования двух внутренних лизинов (лизинов 856 и 963). Эта модификация требует продукта вспомогательного гена, cyaC, который локализован вблизи cyaA на хромосоме B. pertussis.

Было показано, что CyaA связывается с различными типами клеток и инвазирует различные типы клеток, в том числе клетки, не имеющие мембранного транспорта, такие как эритроциты млекопитающих [Rogel et al., 1992]. Это предполагает, что каталитический домен CyaA транслоцируется (перемещается) прямо через плазматическую мембрану клеток-мишеней. Интернализация каталитического домена в цитозоль клетки является кальций- и температурозависимым процессом и зависит от потенциала плазматической мембраны [Rogel et al., 1992] [Karimova et al., 1998] [Otero et al., 1995]. Однако молекулярные механизмы, посредством которых этот токсин транспортирует свой N-концевой каталитический домен через мембрану, в настоящее время являются в значительной степени неизвестными. Кроме того, не был известен специфический рецептор для связывания CyaA.

Физиологические последствия клеточной интоксикации посредством CyaA были охарактеризованы in vitro в фагоцитах. Confer и Eaton первые показали, что CyaA, экстрагированный из B. pertussis, увеличивает уровень внутриклеточного цАМФ в нейтрофилах или макрофагах, приводя к ингибированию хемотаксиса и бактерицидных функций, таких как генерирование супероксида и фагоцитарных свойств [Confer et al., 1982]. Эти активности были подтверждены позднее с очищенными токсинами или с бактериальными мутантами с генетической делецией CyaA [Pearson et al., 1987; Friedman et al., 1987] [Njamkepo et al., 2000]. В противоположность этому и вопреки значительным изменениям в их содержании цАМФ жизнеспособность клеточных линий не гематопоэтического происхождения, по-видимому, не подвергается влиянию интоксикации CyaA [Bassinet et al., 2000]. Кроме того, авторы данного изобретения показали ранее, что CyaA B. pertussis может запускать апоптоз макрофагов in vitro [Khelef et al., 1993; Khelef et al., 1995] и in vivo [Gueirard et al., 1998]. В этих моделях генетическая делеция CyaA устраняла апоптоз макрофагов, но не гибель нейтрофилов, что предполагает, что CyaA i) является ответственным за апоптоз макрофагов, ii) может быть ответственным за апоптоз нейтрофилов, но что за это может быть также ответственен и другой фактор.

Наряду с этим, исследования in vivo, выполненные на мышиной модели инфекции В. bronchiseptica (гомологе B. pertussis животных, CyaA которого является близкородственным), показали, что главной мишенью токсичности CyaA В. bronchiseptica является GM-CSF-зависимая и циклофосфамидчувствительная популяция, которая контролирует ранние стадии инфекции [Harvill et al., 1999]. Эти критерии идентифицировали нейтрофилы и, возможно, другие клетки, в том числе макрофаги или дендритные клетки, но не были описаны данные или высказаны предположения, что клеточный рецептор CD11b участвует в нацеливании посредством CyaA. Эти популяции клеток-мишеней для CyaA являются фактором, который лимитирует ранние фазы инфекции и способствует развитию адаптивной иммунной реакции, которая регулирует последние фазы инфекции [Harvill et al., 1999].

В противоположность другим токсинам, CyaA в течение продолжительного времени считался независимым от какого-либо рецептора связывания. В основе этого лежали наблюдения, что i) CyaA может вызывать интоксикацию большого разнообразия модельных клеточных линий различного происхождения [Ladant et al., 1999], ii) CyaA связывается с клетками Jurkat и овечьими эритроцитами, не обнаруживая насыщения [Gray et al., 1999]. Однако некоторая специфичность была обнаружена в отношении клеток, инфицируемых CyaA. Действительно, исследования in vivo показали, что во время мышиной респираторной инфекции видами Bordetella CyaA специфически разрушал лейкоциты (особенно макрофаги) без разительного повреждения эпителиальных клеток [Gueirard et al., 1998; Harvill et al., 1999].

В патентной заявке WO 93/21324 было предложено использование аденилциклазы Bordetella для индукции CD4+ Т-клеточной или CD8+ Т-клеточной реакции; однако поскольку не был идентифицирован специфический рецептор для аденилциклазы Bordetella, было неизвестно, связано ли представление этого антигена с поглощением неспецифической антигенпредставляющей клеткой с последующим примированием перекрестнореагирующим антигеном и представлением дендритными клетками, или этот антиген был нацелен на специфические антигенпредставляющие клетки (рАРС).

В соответствии с их поверхностным фенотипом, дендритные клетки (высокая экспрессия МНС I и II, костимуляторных молекул и молекул адгезии) представляют наиболее активные АРС во многих анализах in vitro для примирования "необученных" Т-клеток [Bell et al., 1999; Viola et al., 1999]. Другие АРС, такие, например, как покоящиеся "необученные" В-клетки, могли бы даже быть толерогенными (вызывающими толерантность), так как инъецирование покоящихся В-клеток самцов самкам-хозяевам приводит к специфической толеризации специфических для самцов CD8+ Т-клеток [Fuchs et al., 1992]. In vitro "необученные" В-клетки могли бы способствовать делеции "необученных" CD8+ Т-клеток через Fas-зависимый механизм [Bennet et al., 1998].

Кроме того, представление Ag (антигена) дендритными клетками коррелирует in vivo с индукцией Т-клеточных реакций. Это было установлено для МНС II-рестрицированного представления антигена (Ag). Инъекция Ag без адъюванта внутривенным путем (iv) обычно не индуцирует примирование Т-клеток [Kyburz et al., 1993; Aichele et al., 1994; Aichele et al., 1995] и приводит к представлению Ag неспецифическими В-клетками [Guery et al., 1997] [Zhong et al., 1997; Reis e Sousa et al., 1999] и в конечном счете дендритными клетками [Crowley et al., 1990] [Zhong et al., 1997; Reis e Sousa et al., 1999]. В противоположность этому, стратегии локальной иммунизации, например, подкожной (sc) иммунизации, обычно в присутствии адъюванта, вызывают индукцию примирования Т-клеток и нацеленное представление Ag Лангергансовой клеткой, мигрирующей из кожи в ЛУ (лимфатический узел), дренируя сайт иммунизации. В этом случае В-клетки и макрофаги не участвуют [Guery et al., 1996]. Подобные результаты были получены после подкожной (sc) или интрадермальной (id) ДНК-иммунизации для MHCII- и MHCI-пептидных комплексов: дендритные клетки могут быть непосредственно трансфицированы в локальном участке инъекции и затем могут мигрировать в афферентные ЛУ через афферентную лимфатическую систему [Condon et al., 1996; Casares et al., 1997; Porgador et al., 1998]. Эта миграция известна как ключевое событие иммунитета, так как механическое разрушение афферентной лимфатической системы аннулирует Т-клеточную реакцию на повышающие чувствительность кожи агенты или кожные трансплантаты [Zinkernagel et al., 1997].

Таким образом, нацеливание на дендритные клетки является существенным для стимуляции CD4⁺ и CD8⁺ Т-клеток. Поскольку большинство реакций в виде антител являются зависимыми от помощи CD4⁺ Т-клеток, нацеливание антигена на дендритные клетки является главной задачей в вакцинации.

Интерес авторов заявки лежал в исследовании представления аденилциклазы видов Bordetella Т-клеткой, и они идентифицировали специфическую рецепторную молекулу, присутствующую на специфических клетках, которая взаимодействует с CyaA и открывает новые возможности для применения CyaA в качестве белкового вектора для представляющих интерес молекул.

Генетически детоксицированные бактериальные токсины являются кандидатами в качестве вакцинных векторов, в частности для Т-эпитопа, вследствие их способности вторгаться в эукариотические клетки (Ladant et al., 1999). Однако было показано, что небольшое число белковых векторов примирует реакции ЦТЛ (цитотоксических Т-лимфоцитов) in vivo (Ballard et al., 1996; Cabonette et al., 1999). Кроме того, несмотря на многочисленные многообещающие исследования in vitro, не описан вектор, нацеленный исключительно на рАРС, в частности на дендритные клетки и более предпочтительно - на миелоидные дендритные клетки.

Авторы изобретения дополнительно показали, что другие клетки, в частности нейтрофилы, могли бы быть мишенями для векторов согласно изобретению.

Данное изобретение обеспечивает средства, которые могут, по меньшей мере частично, удовлетворить эти потребности, и предлагает новые векторы, которые могли бы конкретно нацеливать молекулы на определенные популяции рАРС, например, для обеспечения возможности стимуляции иммунной реакции.

Кроме того, молекула, нацеленная на эти рАРС и специфические лейкоциты, могла бы обеспечить получение новых векторов, применимых для доставки биологически активной молекулы к проксимальному окружению этих клеток. Например, эти молекулы могли бы модулировать функциональные свойства клеток-мишеней или клеток, участвующих в иммунной реакции или в воспалительной реакции.

В самом деле, авторы изобретения обнаружили, что аденилциклазный токсин Bordetella pertussis специфически связывается с клеточным рецептором, названным (CD11b/CD18) α_М/β₂-рецептором, и что это взаимодействие является необходимым для внутриклеточной доставки аденилциклазного домена в цитозоль клеток и затем для смерти клеток. Интегрин α_М/β₂ (CD11b/CD18) является димером семейства β₂-интегринов, причем экспрессия этих интегринов ограничивается лейкоцитами. Характер распределения экспрессии CD11b/CD18 α_М/β₂ у мыши и человека ограничивается его экспрессией в нейтрофилах/гранулоцитах, макрофагах, дендритных клетках, NK-клетках и субпопуляциях В- и Т- CD8+ лимфоцитов (Jeyaseelan et al., 2000; Arnaout et al., 1990).

Таким образом, этот рецептор представлял бы идеальную мишень для новых векторов, сконструированных, в частности, для Т-эпитоп-иммунизации.

В данном изобретении авторы показали, что аденилциклаза Bordetella может быть использована для нацеливания молекулы in vivo конкретно на экспрессирующие CD11b клетки.

В частности, в данном изобретении авторы заявки показали, что пептидный антиген, содержащийся в аденилциклазном токсине Bordetella pertussis, может быть эффективно нацелен конкретно на поверхность дендритных клеток, может транслоцироваться в цитозоль указанных дендритных клеток и примировать ЦТЛ-реакцию.

В конкретном варианте указанную реакцию получают без помощи адъюванта и CD4+ Т-клеток (Т-клеток-хелперов).

Было также показано, что генетически модифицированная аденилциклаза может быть химически связана с представляющим интерес пептидом для нацеливания указанного пептида на экспрессирующие CD11b клетки, в частности в цитозоль дендритных клеток.

Таким образом, данное изобретение обеспечивает новую эффективную иммуногенную композицию, а также новый вектор доставки лекарственного средства в экспрессирующие CD11b клетки.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение относится к применению аденилциклазы Bordetella в получении белкового вектора для нацеливания представляющей интерес молекулы конкретно в экспрессирующие CD11b клетки.

Данное изобретение относится также к применению аденилциклазы Bordetella, где указанную аденилциклазу рекомбинируют с антигеном и, в частности, модифицируют путем инсерции представляющего интерес пептида или модифицируют путем инсерции представляющей интерес молекулы для получения композиции для нацеливания указанных пептида или молекулы на экспрессирующие CD11b клетки.

Термин "специфически" означает в контексте данного изобретения, что аденилциклаза при использовании в качестве вектора для представляющей интерес молекулы преимущественно направляется к экспрессирующим CD11b клеткам, предоставляя тем самым средство для нацеливания представляющей интерес молекулы на поверхности указанных клеток или в указанных клетках селективным образом относительно других клеток.

В одном варианте данного изобретения представляющая интерес молекула направляется, в частности, к экспрессирующим CD11b клеткам.

В применении здесь термин "экспрессирующие CD11b клетки" относится к клеткам, которые экспрессируют CD11b/CD18 α_М/β₂-рецептор на их поверхности. В частности, этими клетками являются гранулоциты/нейтрофилы, макрофаги, NK-клетки, субпопуляции CD8+ Т-клеток и В-клеток и миелоидные дендритные клетки.

Поскольку экспрессирующие CD11b клетки и более конкретно миелоидные дендритные клетки, нейтрофилы и макрофаги участвуют в существенных функциях иммунной и природной защитной системы, в частности в воспалительных и специфических иммунных реакциях, данное изобретение относится к приготовлению белкового вектора или композиции, способных нацеливать представляющую интерес молекулу или представляющий интерес пептид на эти экспрессирующие CD11b клетки, в частности на миелоидные дендритные клетки, нейтрофилы или макрофаги.

В частности, в одном варианте нацеливание указанных молекулы или пептида является эффективным in vivo.

Тем самым данное изобретение обеспечивает средства для конструирования композиций, пригодных для введения животному-хозяину или человеку-хозяину, требующих нацеливания на определенные лейкоциты и, в частности, миелоидные дендритные клетки, нейтрофилы и макрофаги.

Аденилциклаза Bordetella является кальмодулинзависимой аденилциклазой, секретируемой в видах Bordetella, или ее фрагментом, причем указанный фрагмент сохраняет функциональные свойства этой аденилциклазы, главного фактора вирулентности, обязательного для начальных фаз бактериальной колонизации в легком. Эта аденилциклаза синтезируется и секретируется в форме полипептида из 1706 аминокислот. Кальмодулинзависимая каталитическая активность локализована в первых 400 аминокислотах. Для того чтобы он стал активным, указанный аденилциклазный токсин становится инвазивным и гемолитическим при посттрансдукционной модификации посредством коэкспрессии продукта гена cyaC.

Следующие специфические признаки аденилциклазного токсина Bordetella указывают на то, что этот токсин может быть использован в приготовлении белкового вектора для нацеливания in vivo представляющей интерес молекулы на экспрессирующие CD11b клетки:

а) эта аденилциклаза связывается специфически с экспрессирующими CD11b клетками,

b) N-каталитический домен транслоцируется в цитозоль этих экспрессирующих CD11b клеток,

с) С-концевой домен связывается с мембраной экспрессирующих CD11b клеток и может интернализироваться по пути эндоцитоза,

d) эпитоп, химически связанный с генетически модифицированной аденилциклазой, может индуцировать in vivo специфические ЦТЛ-реакции.

Выражение "аденилциклаза" в данном изобретении включает в себя природную или модифицированную аденилциклазу, в том числе генетически или химически модифицированную аденилциклазу, обеспечивающую полученный продукт, способный нацеливать предсталяющую интерес молекулу конкретно на экспрессирующие CD11b клетки.

Таким образом, данное изобретение относится к применению аденилциклазы Bordetella, определенной выше, и более конкретно к применению модифицированной или рекомбинантной аденилциклазы для нацеливания представляющей интерес молекулы специфически в экспрессирующие CD11b клетки.

Более конкретно, рекомбинантные аденилциклазы включают в себя аденилциклазы, которые были генетически модифицированы для обеспечения либо аденилциклаз с пептидной последовательностью или остатками цистеина, встроенными в каталитическом домене, либо укороченных аденилциклаз, не имеющих всего их каталитического домена или его части.

Вследствие специфического взаимодействия между аденилциклазным токсином Bordetella и CD11b/CD18 α_М/β₂-рецептором представляющая интерес молекула специфически нацеливается по меньшей мере на поверхность экспрессирующих CD11b клеток. В конкретном варианте данного изобретения аденилциклазный токсин Bordetella используют в получении белкового вектора для доставки представляющей интерес молекулы либо в цитозоль экспрессирующих CD11b клеток, на поверхность экспрессирующих CD11b клеток или в путь эндоцитоза экспрессирующих CD11b клеток.

Экспрессирующие векторы для получения рекомбинантной аденилциклазы Bordetella описаны в патентной заявке WO 93/21324 (Institut Pasteur). Новые экспрессирующие векторы для получения генетически модифицированной аденилциклазы Bordetella, пригодные для химического связывания представляющего интерес пептида, также описаны в экспериментальной части далее. Более конкретно, могут быть сконструированы экспрессирующие векторы, направляющие экспрессию как гена cyaA, так и гена cyaC (Sebo et al., 1991). Параллельно может быть сконструирована вторая плазмида, несущая гены, необходимые для секреции цитотоксической аденилциклазы в E. coli, такие как hlyB и hlyD, как описано, например, у Meckman et al., 1985. В частности, может быть использована экспрессионная плазмида рСАСТ3, описанная в WO 93/21324. С использованием этой плазмиды аденилциклаза может быть экспрессирована в E. coli и, возможно, секретирована этой бактерией в больших количествах. Ее можно также легко очистить, например, с использованием аффинной хроматографии на смоле СаМ Affi-Gel или других опубликованных процедур, например с использованием ДЭАЭ-сефарозы и фенил-сефарозы (Guermonprez et al., 2000).

В одном варианте данного изобретения аденилциклаза является рекомбинантной генетически модифицированной аденилциклазой. В частности, мутации, такие как точковые мутации, делеции или инсерции могут быть получены с использованием обычных способов сайт-направленного или случайного мутагенеза, при условии, что домены, необходимые для связывания с экспрессирующими CD11b клетками и, необязательно, для транслокации в цитозоль, все еще являются функциональными. Анализы для оценки специфического связывания рекомбинантных токсинов и их фрагментов с экспрессирующими CD11b клетками и необязательно последующей транслокации каталитичесого домена описаны в следующей ниже экспериментальной части.

В другом варианте данного изобретения рекомбинантная аденилциклаза вида Bordetella является фрагментом природного, модифицированного или рекомбинантного аденилциклазного токсина вида Bordetella, где указанный фрагмент способен связывать CD11b-рецептор. В частности, в данном изобретении было обнаружено, что фрагмент, включающий в себя остатки 373-1706 (CyaA 373-1706), содержит структуры, существенно необходимые для взаимодействия с CD11b/CD18-рецептором. Таким образом, предпочтительным фрагментом аденилциклазного токсина вида Bordetella является аденилциклазный токсин Bordetella, в котором отсутствует весь N-концевой каталитический домен или часть, и более конкретно аденилциклаза Bordetella pertussis, в которой отсутствуют - полностью или частично - остатки 1-373.

Специфическое связывание CD11b может оцениваться in vitro с использованием моноклональных анти-CD11b-антител, как иллюстрируется в примерах.

Для применения в получении белкового вектора или получении композиции эта аденилциклаза предпочтительно является нетоксичной. Нетоксичные мутанты аденилциклазного токсина хорошо описаны в данной области (Betsou et al., 1993; Betsou et al., 1995).

В предпочтительном варианте данного изобретения аденилциклаза выделена из Bordetella pertussis.

В конкретных вариантах представляющая интерес молекула выбрана из группы, содержащей пептиды, гликопептиды, липопептиды, полисахариды, олигосахариды, нуклеиновые кислоты, липиды и химикалии.

В конкретных вариантах представляющей интерес молекулой является гетерологичный антиген. В применении здесь термин "гетерологичный" относится к антигену, иному, чем аденилциклаза, которая используется в самом векторе.

В предпочтительном варианте данного изобретения производство белкового вектора предусматривает стадию встраивания гетерологичной молекулы и, в частности, пептида, в каталитический домен аденилциклазы в пермиссивном сайте.

В применении здесь термин "пермиссивный сайт" относится к сайту, где гетерологичная молекула и, в частности, пептид могут быть встроены без существенного влияния на желаемые функциональные свойства аденилциклазного токсина, т.е. без влияния на домены, необходимые для специфического связывания с CD11b/CD18-рецептором и предпочтительно без влияния на процесс транслокации каталитического домена. В предпочтительном варианте дополнительно сохраняется способность токсина CyaA стимулировать синтез цАМФ в клетках-мишенях.

Способы выбора пермиссивных сайтов представлены, например, в WO 93/21324 и в Ladant et al., 1992. В частности, методология с использованием двойного отбора (устойчивости к антибиотику и калориметрического теста на чашках с использованием α-комплементации) позволяет легко идентифицировать олигонуклеотидные инсерции (сохраняющие рамку считывания) в части гена, кодирующего N-концевой каталитический домен этого токсина. Функциональные последствия действия этих мутаций на каталитическую активность этого токсина могут быть легко проанализированы как генетически (функциональной комплементацией cya^- штамма E. coli), так и биохимически (характеристикой стабильности модифицированных аденилциклаз, их ферментативной активности, их взаимодействия с саМ и т.д.). Эта методология позволяет проводить скрининг большого числа мутаций для идентификации сайтов, которые являются потенциально выгодными для встраивания антигенных детерминант.

В конкретных вариантах данного изобретения пермиссивный сайт выбран из группы, состоящей из остатков 137-138, остатков 224-225, остатков 228-229, остатков 235-236, остатков 317-318 и остатков 335-336 аденилциклазы Bordetella pertussis.

Однако в данном изобретении могут быть использованы другие пермиссивные сайты, которые могут быть идентифицированы, например, с использованием указанной выше методологии, в частности сайты между остатками 400 и 1700.

Производство белкового вектора может также предусматривать стадию слияния представляющей интерес молекулы, например гетерологичного пептида, на N-концевом участке аденилциклазы Bordetella, в которой полностью или частично отсутствует ее N-концевой каталитический домен, и более предпочтительно аденилциклазы Bordetella pertussis, в которой отсутствуют остатки 1-373.

В предпочтительном варианте данного изобретения аденилциклаза в соответствии с одним из приведенных выше определений используется в производстве белкового вектора или в получении композиции, специфически сконструированных для примирования CD8+ цитотоксической Т-клеточной реакции (ЦТЛ-реакции), причем указанная реакция осуществляет нацеливание аденилциклазы, модифицированной (в частности, рекомбинированной или конъюгированной) представляющей интерес молекулой, на экспрессирующие CD11b клетки с последующей транслокацией представляющей интерес молекулы в цитозоль указанных экспрессирующих CD11b клеток и, в частности, миелоидных дендритных клеток. В этом контексте представляющая интерес молекула является или она содержит предпочтительно эпитоп или антиген.

В применении здесь термин "эпитоп" относится к гетерологичной молекуле и, в частности, гетерологичному пептиду, который может индуцировать иммунную реакцию.

В конкретных вариантах антиген выбран из группы, состоящей из внутриклеточного антигена бактериальной клетки, антигена опухолевой клетки, вирусного антигена, грибного антигена или антигена клетки-паразита.

В предпочтительном варианте данного изобретения природную, модифицированную или рекомбинантную аденилциклазу, в соответствии с приведенными выше определениями, используют в производстве белкового вектора или в получении композиции, специфическии предназначенных для примирования CD4+ клеточной реакции, причем указанная реакция осуществляет нацеливание аденилциклазы, модифицированной (в частности, рекомбинированной или конъюгированной) представляющей интерес молекулой, на экспрессирующие CD11b клетки, в частности миелоидные дендритные клетки. В этом контексте представляющая интерес молекула является или она содержит предпочтительно эпитоп или антиген.

Представляющей интерес молекулой может быть, в частности, антиген, выбранный из группы, состоящей из антигена полиовируса, антигена вируса ВИЧ, антигена вируса гриппа, эпитопа вируса хориоменингита, опухолевого антигена.

Кроме того, функциональные свойства экспрессирующих CD11b клеток определяют новое применение аденилциклазного токсина Bordetella в приготовлении белкового вектора для нацеливания лекарственного средства на эти специфическиие клетки. В этом контексте, в одном конкретном варианте данного изобретения, так называемой представляющей интерес молекулой является лекарственное средство. Указаннное лекарственное средство может быть химически или генетически связано с аденилциклазой. Способы связывания лекарственного средства с полипептидом являются хорошо известными в данной области и предусматривают, например, дисульфидное связывание с использованием активированного N-пиридилсульфонилом сульфгидрила.

Предпочтительно представляющей интерес молекулой является противовоспалительное лекарственное средство, которое при связывании с аденилциклазным токсином специфически нацеливается на поверхность клеток, участвующих в воспалительной реакции, таких как нейтрофилы.

В частности, в экспериментальной части впервые показано, что можно прививать молекулы к CyaA химическим связыванием или генетическим встраиванием для нацеливания in vivo на CD11B+ антигенпредставляющие клетки и, в частности, в цитозоль CD11b+ антигенпредставляющих клеток. В самом деле, было обнаружено, что при связывании молекулы, соответствующей конкретному CD8+ Т-клеточному эпитопу, с каталитическим доменом детоксицированного CyaA, либо при помощи дисульфидной связи, либо путем генетической инсерции, эта сконструированная молекула может индуцировать in vivo специфическую ЦТЛ-реакцию, показывая таким образом, что указанный CD8+ Т-клеточный эпитоп транслоцируется в цитозоль экспрессирующих CD11b клеток.

Более конкретно, представление антигена для селективного примирования CD8+ цитотоксических клеток выполняется в основном миелоидными дендритными клетками.

Таким образом, в конкретном варианте рекомбинантная аденилциклаза, используемая для получения белкового вектора, является генетически модифицированной аденилциклазой, содержащей одну или несколько молекул, химически связанных посредством дисульфидной связи с генетически встроенными остатками цистеина, локализованными в каталитическом домене указанной аденилциклазы.

Фактически, множественные молекулы могут быть связаны химически с аденилциклазой посредством дисульфидной связи с различными остатками цистеина, локализованными в различных пермиссивных сайтах в каталитическом домене.

Автор изобретения также показал, что ЦТЛ, специфические в отношении приготовленного в виде вектора антигена, могут быть примированы in vivo после единственной внутривенной инъекции рекомбинантного токсина, в частности, без необходимости обеспечения гетерологичного адъюванта. Эти результаты, показанные в экспериментальной части, и, в частности, специфическое нацеливание этого эпитопа на миелоидные дендритные клетки обеспечивают новые стратегии иммунизации, которые не требуют использования адъюванта и помощи CD4+ Т-клеток.

Таким образом, данное изобретение относится также к применению аденилциклазного токсина Bordetella, рекомбинированного с молекулой и, в частности, представляющим интерес пептидом, для получения композиции, приготовленной для внутривенного введения и обеспечивающей CD8+ Т-клеточную реакцию in vivo, причем указанная композиция не содержит гетерологичного адъюванта. Данное изобретение относится также к самой этой композиции.

Данное изобретение относится, в частности, также к новой иммуногенной композиции, приготовленной для введения, в частности внутривенного введения, животному-хозяину или человеку-хозяину, отличающейся тем, что она содержит рекомбинантную аденилциклазу Bordetella, которая содержит антиген, встроенный в ее каталитический домен.

Далее, данное изобретение относится к фармацевтической композиции для введения человеку или животному, составленной для нацеливания представляющей интерес молекулы специфически на экспрессирующие CD11b клетки, отличающейся тем, что указанная представляющая интерес молекула связана с аденилциклазой вида Bordetella.

В одном предпочтительном варианте представляющая интерес молекула выбрана из группы, состоящей из пептидов, гликопептидов, липопептидов, полисахаридов, олигосахаридов, нуклеиновых кислот, липидов и химикалиев.

В другом предпочтительном варианте представляющей интерес молекулой является антиген.

В другом конкретном варианте фармацевтическая или иммуногенная композиция содержит конструкцию нуклеиновой кислоты, кодирующую рекомбинантную аденилциклазу вида Bordetella, содержащую рекомбинантную аденилциклазу вида Bordetella, связанную с представляющей интерес молекулой.

В конкретных вариантах аденилциклазой является токсин из Bordetella pertussis.

В других конкретных вариантах этот аденилциклазный токсин является генетически модифицированным токсином. В одном предпочтительном варианте аденилциклаза является нетоксичной аденилциклазой, в частности детоксицированной аденилциклазой.

В одном предпочтительном варианте генетически модифицированная аденилциклаза способна транслоцировать представляющую интерес молекулу специфически в цитозоль экспрессирующих CD11b клеток.

В частности, указанной генетически модифицированной аденилциклазой является аденилциклаза Bordetella, в которой полностью или частично отсутствует ее каталитический N-концевой домен, и более конкретно аденилциклаза Bordetella pertussis, в которой отсутствуют остатки 1-373.

Предпочтительно генетически модифицированная аденилциклаза содержит один или несколько остатков цистеина, встроенных в каталитическом домене в пермиссивные сайты. Такая генетически модифицированная аденилциклаза может быть связана с представляющими интерес одной или несколькими молекулами посредством дисульфидных связей во встроенном остатке (встроенных остатках) цистеина.

В предпочтительном варианте эту молекулу и, в частности, антиген встраивают в пермиссивные сайты, выбранные из группы, состоящей из остатков 137-138, остатков 224-225, остатков 228-229, остатков 235-236 и остатков 317-318 и остатков 335-336 аденилциклазы Bordetella pertussis, или эта молекула слита с N-концевой частью аденилциклазы Bordetella, в которой полностью или частично отсутствует N-концевой каталитический домен, и более конкретно с N-концевой частью аденилциклазы Bordetella pertussis, в которой отсутствуют остатки 1-373.

В конкретном варианте этой молекулой является антиген, который является внутриклеточным антигеном бактериальной клетки, антигеном опухолевой клетки, вирусным антигеном, грибным антигеном или антигеном клетки-паразита.

В предпочтительных вариантах представляющей интерес молекулой является антиген, выбранный из группы, состоящей из антигена полиовируса, антигена вируса ВИЧ, антигена вируса гриппа, эпитопа вируса хориоменингита, опухолевого антигена.

В другом варианте генетически модифицированный токсин способен доставлять представляющую интерес молекулу специфически к поверхности экспрессирующих CD11b клеток или в путь эндоцитоза.

Авторы изобретения показали, что in vivo внутривенное введение иммуногенной композиции животному-хозяину или человеку-хозяину, как определено в данном изобретении, без адъюванта (адъювантов) является достаточным для эффективной стимуляции иммунной реакции у указанного животного-хозяина или человека-хозяина.

В частности, иммуногенные композиции данного изобретения способны индуцировать или стимулировать in vivo или in vitro иммунную клеточную реакцию с участием специфических дендритных клеток.

В результате этого в конкретном варианте эта иммуногенная или фармацевтическая композиция является выгодно лишенной примирующих адъювантов, обычно используемых в данной области, таких как гидроксид алюминия.

В одном конкретном варианте представляющей интерес молекулой является лекарственное средство, предпочтительно противовоспалительное лекарственное средство.

Кроме того, данное изобретение относится также к применению определенной выше иммуногенной композиции для получения вакцины или иммунотерапевтической композиции для введения животному-хозяину или человеку-хозяину.

В применении здесь термин "иммунотерапевтическая композиция" относится к композиции, которая приводит к иммунологической реакции и которая связана с терапевтическими способами лечения, такими как лечение против рака, вирусных инфекций, паразитарных инфекций или бактериальных инфекций.

Далее, данное изобретение относится к способу иммунизации хозяина, животного или человека, где указанный способ предусматривает стадии:

а) обеспечения иммуногенной композиции, как описано выше;

b) введения указанной иммуногенной композиции, предпочтительно внутривенным путем, указанному хозяину для стимуляции иммунной реакции.

Наконец, данное изобретение относится к белковому вектору для доставки представляющей интерес молекулы конкретно к экспрессирующим CD11b клеткам, отличающемуся тем, что указанный вектор содержит аденилциклазу вида Bordetella и более предпочтительно рекомбинантную или модифицированную аденилциклазу вида Bordetella, связанную с указанной представляющей интерес молекулой.

Этот белковый вектор способен нацеливать представляющую интерес молекулу на экспрессирующие CD11b клетки через конкретно связывание аденилциклазы Bordetella с CD11b/CD18 α_М/β₂-рецептором, который присутствует на поверхности специфических клеток. В одном конкретном варианте этот вектор способен также доставлять представляющую интерес молекулу специфически в цитозоль экспрессирующих CD11b клеток.

В к