Аутопроцессирующиеся растения и части растений

Аутопроцессирующиеся растения и части растений

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Связанные заявки

В настоящей заявке испрашивается приоритет заявки рег. №60/215281, поданной 27 августа 2001, которая вводится в настоящее описание посредством ссылки.

Область, к которой относится изобретение

В общих чертах, настоящее изобретение относится к молекулярной биологии растений, а более конкретно к созданию растений, которые экспрессируют процессирующий фермент, придающий нужные свойства растению или его продуктам.

Предшествующий уровень техники

Ферменты используются для обработки ряда сельскохозяйственных продуктов, таких как древесина, фрукты и овощи, крахмалы, соки т.п. Обычно процессирующие ферменты продуцируют и выделяют из различных источников в промышленном масштабе, например, путем микробной ферментации (под действием α-амилазы Bacillus) или выделения из растения (с помощью β-галактозидазы кофе или папаина из частей растения). Ферментные препараты используют в различных методах обработки путем смешивания фермента и субстрата при соответствующей влажности, температуре и в определенный период времени и механического перемешивания в целях осуществления ферментативной реакции в промышленных масштабах. Методы включают отдельные стадии продуцирования фермента, производство ферментного препарата, смешивания фермента и субстрата и помещение полученной смеси в подходящие условия, стимулирующие прохождение ферментативной реакции. При этом подходящим и предпочтительным является метод, который позволяет сэкономить время и энергию, сократить стадию смешивания, снизить финансовые затраты и/или стоимость продуцирования ферментов либо улучшить результаты или получить новые продукты. Одним из примеров процедуры, которая нуждается в усовершенствовании, является помол кукурузы.

В настоящее время кукурузу размалывают с получением кукурузного крахмала и других побочных продуктов, образующихся при размоле кукурузы, таких как кукурузный глютеновый продукт, кукурузная глютеновая мука или кукурузное масло. Крахмал, полученный таким способом, часто подвергают дальнейшей обработке с получением других продуктов, таких как дериватизированные крахмалы и сахара, или ферментации с получением различных продуктов, включая спирты или молочную кислоту. Обработка кукурузного крахмала часто предусматривает использование ферментов, а в частности ферментов, которые расщепляют крахмал и превращают его в ферментируемые сахара или фруктозу (под действием α- и глюкоамилазы, α-глюкозидазы, глюкозоизомеразы и т.п.). Современные промышленные способы требуют больших фмнансовых затрат, поскольку для осуществления обработки кукурузы в промышленном масштабе необходимо конструирование очень больших мельниц, что не отвечает приемлемому экономическому показателю "затраты - эффективность". Кроме того, способ требует отдельного производства гидролизующих или модифицирующих крахмал ферментов с последующим использованием оборудования для смешивания данного фермента и субстрата в целях продуцирования продуктов из гидролизованного крахмала.

Способ получения крахмала из кукурузного зерна хорошо известен и включает осуществление процесса мокрого помола. Мокрый помол кукурузы включает стадии замачивания кукурузного зерна, размола этого кукурузного зерна и отделения компонентов этого зерна. Зерно замачивают в чане для замачивания с обратным потоком воды примерно при 120°F, и зерно оставляют в чане для замачивания на 24-48 часов. Вода в чане для замачивания обычно содержит диоксид серы при концентрации примерно 0,2 мас.%. В этом способе диоксид серы используют для снижения микробного роста, а также для восстановления дисульфидных связей в белках эндосперма в целях более эффективного отделения крахмала от белка. Обычно на один бушель кукурузы используют примерно 0,59 галлонов воды для замачивания. Вода для замачивания идет в отходы и часто содержат нежелательные уровни остаточного диоксида серы.

Затем замоченное зерно обезвоживают и подвергают размолу в серии мельниц тонкого помола. В первой серии мельниц тонкого помола происходит дробление зерна, в результате чего из этого зерна высвобождается зародыш. Промышленные мельницы тонкого помола, подходящие для крупномасштабного мокрого помола, имеются в продаже под торговым знаком Bauer. Для отделения зародыша от остальной части зерна используют центрифугирование. Широко используемым промышленным центрифужным сепаратором является центрифужный сепаратор Merco. Мельницы тонкого помола и центрифужные сепараторы являются дорогостоящим оборудованием, которое потребляет много энергии.

В следующей стадии этого процесса оставшиеся компоненты зерна, включая крахмал, шелуху, волокно и клейковину, загружают на другую серию мельниц тонкого помола и пропускают через серию промывочных сит для отделения волокнистых компонентов от крахмала и клейковины (белка эндосперма). Крахмал и клейковина проходят через сита, а волокно не проходит через сита. Центрифугирование или третья стадия измельчения с последующим центрифугированием используется для отделения крахмала от белка эндосперма. В результате центрифугирования продуцируется крахмальная суспензия, которую обезвоживают, а затем промывают свежей водой и сушат до достижения примерно 12% влажности. В основном чистый крахмал обычно подвергают дополнительной обработке с использованием ферментов.

Отделение крахмала от других компонентов зерна осуществляют в целях удаления кожуры семян и белков зародыша и эндосперма, что способствует эффективному контактированию крахмала с процессирующими ферментами, а поэтому полученные продукты гидролиза, в основном, не содержат примесей других компонентов зерна. Такое разделение позволяет эффективно выделять другие компоненты зерна, которые могут затем поступать в продажу как вспомогательные продукты для повышения дохода, получаемого от использования мельницы.

После выделения крахмала в результате мокрого помола этот крахмал обычно подвергают таким стадиям обработки, как желатинизация, разжижение и декстринизация, в целях продуцирования мальтодекстрина, и последующим стадиям осахаривания, изомеризации и очистки в целях продуцирования глюкозы, мальтозы и фруктозы.

Желатинизация применяется при гидролизе крахмала, поскольку доступные в настоящее время ферменты не могут быстро гидролизовать кристаллический крахмал. Для того, чтобы сделать крахмал доступным для гидролитических ферментов, этот крахмал обычно приготавливают в виде водной суспензии (20-40% твердых веществ) и нагревают при подходящей температуре гелеобразования. Для кукурузного крахмала температура составляет 105-110°С. Желатинизированный крахмал обычно является очень вязким, а поэтому его разбавляют в следующей стадии, называемой разжижением. При разжижении некоторые связи между глюкозными молекулами крахмала разрываются, и это происходит либо под действием фермента, либо под действием кислоты. В этой стадии и в последующей стадии декстринизации используются термостабильные ферменты эндо-α-амилазы. Степень гидролиза регулируется в стадии декстринизации, в результате чего получают продукты гидролиза с нужным процентом декстрозы.

Последующий гидролиз декстриновых продуктов после стадии разжижения осуществляют с использованием различных экзоамилаз и деветвящих ферментов, в зависимости от нужного продукта. И наконец, если необходимо получить фруктозу, то обычно используют иммобилизованный фермент глюкозоизомеразу для превращения глюкозы во фруктозу.

Осуществление сухого помола для получения ферментируемых сахаров (например, с последующим получением этанола) из кукурузного крахмала способствует эффективному контактированию экзогенных ферментов с крахмалами. Этот способ требует меньших финансовых затрат, чем способ мокрого помола, однако было бы желательно получить еще большую экономическую выгоду, поскольку, в большинстве случаев, побочные продукты, образующиеся в указанных процессах, часто не являются такими ценными, как продукты, получаемые при мокром помоле. Так, например, при сухом помоле кукурузы зерно измельчается в порошок, что облегчает эффективный контакт крахмала с расщепляющими ферментами. После гидролиза кукурузной муки ферментами остаточные твердые вещества имеют определенную пищевую ценность, поскольку они содержат белки и некоторые другие компоненты. Недавно в работе Eckhoff, озаглавленной "Fermentation and costs of fuel ethanol from corn with quick-germ process" (Appl. Biochem. Biotechnol., 94:41 (2001)), были описаны возможности усовершенствования и существующие проблемы, связанные с сухим помолом. Метод "быстрого отделения зародыша" позволяет отделять богатый маслом зародыш от крахмала с использованием меньшего времени замачивания.

Одним из примеров растения, где регуляция и/или уровень эндогенных процессирующих ферментов может приводить к получению желаемого продукта, является сладкая кукуруза. Типичные сорта сладкой кукурузы отличаются от полевой кукурузы тем, что сладкая кукуруза не способна к биосинтезу нормальных уровней крахмала. Обычно, для ограничения биосинтеза крахмала, сорта сладкой кукурузы подвергают генетическим мутациям в генах, кодирующих ферменты, участвующие в биосинтезе крахмала. Такие мутации присутствуют в генах, кодирующих крахмалсинтазу и АДФ-глюкозопирофосфорилазу (такие как мутации в сахарных и суперсахарных сортах кукурузы). Фруктоза, глюкоза и сахароза, которые представляют собой простые сахара, необходимые для продуцирования приятного сладкого вкуса, являющегося предпочтительным для потребителя свежей кукурузы, аккумулируются в развивающемся эндосперме таких мутантов. Однако, если уровень накопления крахмала является слишком высоким, то есть если эту кукурузу оставляют на слишком длительный срок для созревания (поздний урожай), или если эта кукуруза, перед ее употреблением, хранится в течение очень длительного периода времени, то этот продукт теряет свою сладость и приобретает крахмалистый привкус и нежелательные органолептические свойства. Поэтому окно сбора урожая для сладкой кукурузы является слишком узким, и ее срок хранения ограничен.

Другая серьезная проблема, с которой сталкиваются фермеры, выращивающие сладкую кукурузу, связана с тем, что ценность этих сортов кукурузы ограничивается исключительно их использованием в пищевых продуктах. Если фермер захочет заранее, во время развития семян, собрать урожай сладкой кукурузы для ее использования в качестве пищевого продукта, то он понесет значительные убытки в урожае. Низкий выход и плохое качество зерна сладкой кукурузы можно объяснить двумя фундаментальными причинами. Первая причина заключается в том, что мутации в пути биосинтеза крахмала оказывают ингибирующее действие на механизмы биосинтеза крахмала, и зерно не наливается полностью, что приводит к снижению выхода и качества зерна. Во вторых, из-за высокого содержания сахаров в зерне и неспособности этих сахаров секвестироваться в качестве крахмалов влагостойкость семян снижается, что приводит к еще большему снижению срока сохранения питательных веществ в зерне. Эндоспермы семян сортов сладкой кукурузы сморщиваются и сплющиваются, но не подвергаются присущей им десикации и становятся восприимчивыми к болезням. Кроме того, низкое качество семян сладкой кукурузы связано с другими агрономическими проблемами, такими как низкая жизнеспособность семян, плохое прорастание семян, восприимчивость саженцев к болезням и плохая ранняя всхожесть, обусловленная комбинацией факторов, вызываемых неадекватным накоплением крахмала. Таким образом, плохое качество продуктов сладкой кукурузы экономически отражается на потребителях, фермерах/производителях, распространителях продукции и семеноводах.

Таким образом, что касается сухого помола, то необходимо разработать такой способ, который позволил бы повысить эффективность процесса и/или повысить ценность побочных продуктов. Что касается мокрого помола, то необходимо разработать такой способ обработки крахмала, который позволил бы избежать использования оборудования, требующегося для продолжительного замачивания, измельчения, помола и/или отделения компонентов зерна. Так, например, необходимо модифицировать или исключить стадию замачивания при мокром помоле, что позволит снизить количество сбросных вод, требующих удаления, и, тем самым, сэкономить энергию и время и увеличить производительность помола (время нахождения зерна в чанах для замачивания должно снижаться). Также необходимо исключить или усовершенствовать способ отделения крахмалсодержащего эндосперма от зародыша.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение относится к самопроцессирующимся растениям и к частям таких растений, а также к способам их использования. Самопроцессирующиеся растения и части растения настоящего изобретения способны экспрессировать и активировать фермент(ы) (мезофильный, термофильный или гипертермофильный ферменты). После активации фермента(ов) (мезофильного, термофильного или гипертермофильного фермента) растение или часть растения обладает способностью к аутопроцессингу субстрата, что позволяет достичь нужного результата.

Настоящее изобретение относится к выделенному полинуклеотиду, (а) содержащему последовательность SEQ ID NO:2, 4, 6, 9, 19, 21, 25, 37, 39, 41, 43, 46, 48, 50, 52 или 59 или комплементарную последовательность, или к полинуклеотиду, который гибридизуется с последовательностью, комплементарной любой из последовательностей SEQ ID NO:2, 4, 6, 9, 19, 21, 25, 37, 39, 41, 43, 46, 48, 50, 52 или 59, в условиях низкой степени жесткости, и который кодирует полипептид, обладающий α-амилазной, пуллуланазной, α-глюкозидазной, глюкозоизомеразной или глюкоамилазной активностью, или (b) кодирующему полипептид, содержащий последовательность SEQ ID NO:10, 13, 14, 15, 16, 18, 20, 24, 26, 27, 28, 29, 30, 33, 34, 35, 36, 38, 40, 42, 44, 45, 47, 49 или 51, или его ферментативно активный фрагмент. Предпочтительно, выделенный полинуклеотид кодирует гибридный полипептид, содержащий первый полипептид и второй пептид, где указанный первый полипептид обладает α-амилазной, пуллуланазной, α-глюкозидазной, глюкозоизомеразной или глюкоамилазной активностью. Более предпочтительно, второй пептид содержит пептид сигнальной последовательности, который может нацеливать первый полипептид на вакуоль, эндоплазматический ретикулум, хлоропласт, крахмальные зерна, семена или клеточные стенки растения. Например, сигнальной последовательностью может быть N-концевая сигнальная последовательность, происходящая от восковидной кукурузы (waxy), N-концевая сигнальная последовательность, происходящая от γ-зеина, крахмалсвязывающий домен или С-концевой крахмалсвязывающий домен. Кроме того, настоящее изобретение охватывает полинуклеотид, который гибридизуется с последовательностью, комплементарной любой из последовательностей SEQ ID NO:2, 9 или 52, в условиях низкой степени жесткости, и кодирует полипептид, обладающий α-амилазной активностью; полинуклеотид, который гибридизуется с последовательностью, комплементарной любой из последовательностей SEQ ID NO:4 или 25, в условиях низкой степени жесткости, и кодирует полипептид, обладающий пуллуланазной активностью; полинуклеотид, который гибридизуется с последовательностью, комплементарной последовательности SEQ ID NO:6, и кодирует полипептид, обладающий α-глюкозидазной активностью; полинуклеотид, который гибридизуется с последовательностью, комплементарной любой из последовательностей SEQ ID NO:19, 21, 37, 39, 41 или 43, в условиях низкой степени жесткости, и кодирует полипептид, обладающий глюкозоизомеразной активностью; полинуклеотид, который гибридизуется с последовательностью, комплементарной любой из последовательностей SEQ ID NO:46, 48, 50 или 59, в условиях низкой степени жесткости, и кодирует полипептид, обладающий глюкоамилазной активностью.

Кроме того, настоящее изобретение относится к экспрессирующей кассете, содержащей полинуклеотид, (а) имеющий последовательность SEQ ID NO:2, 4, 6, 9, 19, 21, 25, 37, 39, 41, 43, 46, 48, 50, 52 или 59 или комплементарную последовательность, или полинуклеотид, который гибридизуется с последовательностью, комплементарной любой из последовательностей SEQ ID NO:2, 4, 6, 9, 19, 21, 25, 37, 39, 41, 43, 46, 48, 50, 52 или 59 или комплементарную последовательность в условиях низкой степени жесткости, и кодирует полипептид, обладающий α-амилазной, пуллуланазной, α-глюкозидазной, глюкозоизомеразной или глюкоамилазной активностью, или (b) кодирующий полипептид, содержащий последовательность SEQ ID NO:10, 13, 14, 15, 16, 18, 20, 24, 26, 27, 28, 29, 30, 33, 34, 35, 36, 38, 40, 42, 44, 45, 47, 49 или 51, или его ферментативно активный фрагмент. Предпочтительно, экспрессирующая кассета дополнительно содержит промотор, функционально присоединенный к полинуклеотиду, такой как индуцибельный промотор, тканеспецифический промотор или, предпочтительно, эндосперм-специфический промотор. Предпочтительным эндосперм-специфическим промотором является промотор γ-зеина кукурузы или промотор ADP-gpp кукурузы. В предпочтительном варианте осуществления изобретения промотор содержит последовательность SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:12. Кроме того, в другом предпочтительном варианте осуществления изобретения указанный полинуклеотид находится в смысловой ориентации по отношению к этому промотору. Экспрессирующая кассета согласно изобретению может дополнительно кодировать сигнальную последовательность, которая функционально присоединена к полипептиду, кодируемому указанным полинуклеотидом. Сигнальная последовательность предпочтительно нацеливает функционально присоединенный полипептид на вакуоль, эндоплазматический ретикулум, хлоропласт, крахмальные зерна, семена или на клеточные стенки растения. Предпочтительными сигнальными последовательностями являются N-концевая сигнальная последовательность, происходящая от восковидной кукурузы (waxy), N-концевая сигнальная последовательность, происходящая от γ-зеина, или крахмалсвязывающий домен.

Кроме того, настоящее изобретение относится к вектору или к клетке, содержащей экспрессирующие кассеты согласно изобретению. Клетка может быть выбрана из группы, состоящей из Agrobacterium, клетки однодольного растения, клетки двудольного растения, клетки растения семейства лилейных (Liliopsida), клетки растения семейства просовых (Panicoideae), клетки кукурузы и клетки злаков. Предпочтительной является клетка кукурузы.

Кроме того, настоящее изобретение охватывает растение, стабильно трансформированное векторами настоящего изобретения. Настоящее изобретение относится к растению, стабильно трансформированному вектором, содержащими α-амилазу, имеющую любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:1, 10, 13, 14, 15, 16, 33 или 35 или кодируемую полинуклеотидом, имеющим любую из последовательностей SEQ ID NO:2 или 9. Предпочтительной α-амилазой является гипертермофильная α-амилаза.

В другом варианте своего осуществления настоящее изобретение относится к растению, стабильно трансформированному вектором, содержащим пуллуланазу, имеющую любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:24 или 34 или кодируемую полинуклеотидом, содержащим последовательность SEQ ID NO:4 или 25. Кроме того, настоящее изобретение относится к растению стабильно трансформированному вектором, содержащими α-глюкозидазу, имеющую любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:26 или 27 или кодируемую полинуклеотидом, содержащим последовательность SEQ ID NO:6. Предпочтительной α-глюкозидазой является гипертермофильная α-глюкозидаза. Кроме того, настоящее изобретение относится к растению, стабильно трансформированному вектором, содержащим глюкозоизомеразу, имеющую любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:18, 20, 28, 29, 30, 38, 40, 42 или 44 или кодируемую полинуклеотидом, содержащим любую из последовательностей SEQ ID NO:19, 21, 37, 39, 41 или 43. Предпочтительной глюкозоизомеразой является гипертермофильная глюкозоизомераза. В другом варианте своего осуществления настоящее изобретение относится к растению, стабильно трансформированному вектором, содержащим глюкозоамилазу, имеющую любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:45, 47 или 49 или кодируемую полинуклеотидом, содержащим любую из последовательностей SEQ ID NO:46, 48, 50 или 59. Предпочтительно глюкозоамилаза является гипертермофильной.

Кроме того, настоящее изобретение относится к растительным продуктам, таким как семена, плоды или зерно, происходящее от стабильно трансформированных растений настоящего изобретения.

В другом варианте своего осуществления настоящее изобретение относится к трансформированному растению, геном которого пополнен за счет рекомбинантного полинуклеотида, кодирующего, по крайней мере, один процессирующий фермент, функционально присоединенный к промоторной последовательности, где последовательность указанного полинуклеотида оптимизирована для экспрессии в растении. Растением может быть однодольное растение, такое как кукуруза, или двудольное растение. Предпочтительным растением является злаковое растение или растение, культивируемое в коммерческих целях. Процессирующий фермент выбирают из группы, состоящей из α-амилазы, глюкоамилазы, глюкозоизомеразы, глюканазы, β-амилазы, α-глюкозидазы, изоамилазы, пуллуланазы, неопуллуланазы, изопуллуланазы, амилопуллуланазы, целлюлазы, экзо-1,4-β-целлобиогидролазы, экзо-1,3-β-D-глюканазы, β-глюкозидазы, эндоглюканазы, L-арабиназы, α-арабинозидазы, галактаназы, галактозидазы, маннаназы, маннозидазы, ксиланазы, ксилозидазы, протеазы, глюканазы, ксиланазы, эстеразы, фитазы и липазы. Предпочтительным процессирующим ферментом является крахмалпроцессирующий фермент, выбранный из группы, состоящей из α-амилазы, глюкоамилазы, глюкозоизомеразы, β-амилазы, α-глюкозидазы, изоамилазы, пуллуланазы, неопуллуланазы, изопуллуланазы и амилопуллуланазы. Более предпочтительно, указанный фермент выбирают из α-амилазы, глюкоамилазы, глюкозоизомеразы, α-глюкозидазы и пуллуланазы. Предпочтительно, чтобы процессирующий фермент был дополнительно гипертермофильным. В соответствии с этим аспектом настоящего изобретения ферментом может быть некрахмалразрушающий фермент, выбранный из группы, состоящей из протеазы, глюканазы, ксиланазы, эстеразы, фитазы и липазы. Кроме того, такие ферменты могут быть гипертермофильными. В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанный фермент аккумулируется в вакуоли, эндоплазматическом ретикулуме, хлоропласте, крахмальных зернах, семенах или в клеточных стенках растения. Кроме того, в другом варианте осуществления изобретения геном растения может быть дополнительно пополнен вторым рекомбинантным полинуклеотидом, содержащим негипертермофильный фермент.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к трансформированному растению, геном которого пополнен за счет рекомбинантного полинуклеотида, кодирующего, по крайней мере, один процессирующий фермент, выбранный из группы, состоящей из α-амилазы, глюкоамилазы, глюкозоизомеразы, α-глюкозидазы и пуллуланазы, и функционально присоединенному к промоторной последовательности, где последовательность указанного полинуклеотида оптимизирована для экспрессии в растении. Предпочтительно процессирующий фермент является гипертермофильным и происходит из кукурузы.

В другом своем варианте настоящее изобретение относится к трансформированному растению кукурузы, геном которого пополнен за счет рекомбинантного полинуклеотида, кодирующего, по крайней мере, один процессирующий фермент, выбранный из группы, состоящей из α-амилазы, глюкоамилазы, глюкозоизомеразы, α-глюкозидазы и пуллуланазы, и функционально присоединенному к промоторной последовательности, где последовательность указанного полинуклеотида оптимизирована для экспрессии в растении кукурузы. Предпочтительным процессирующим ферментом является гипертермофильный фермент.

Настоящее изобретение относится к трансформированному растению, геном которого пополнен за счет рекомбинантного полинуклеотида, имеющего последовательность SEQ ID NO:2, 9 или 52, и функционально присоединенному к промотору и к сигнальной последовательности. Кроме того, описано трансформированное растение, геном которого пополнен за счет рекомбинантного полинуклеотида, имеющего последовательность SEQ ID NO:4 или 25, и функционально присоединенному к промотору и к сигнальной последовательности. В другом своем варианте настоящее изобретение относится к трансформированному растению, геном которого пополнен за счет рекомбинантного полинуклеотида, имеющего последовательность SEQ ID NO:6, и функционально присоединенному к промотору и к сигнальной последовательности. Кроме того, описано трансформированное растение, геном которого пополнен за счет рекомбинантного полинуклеотида, имеющего последовательность SEQ ID NO:19, 21, 37, 39, 41 или 43. Описано трансформированное растение, геном которого пополнен за счет рекомбинантного полинуклеотида, имеющего последовательность SEQ ID NO:46, 48, 50 или 59.

В настоящей заявке также рассматриваются продукты трансформированных растений. Такими продуктами являются, например, семя, плод или зерно. Альтернативно, таким продуктом может быть процессирующий фермент, крахмал или сахар.

Описано также растение, полученное из стабильно трансформированных растений настоящего изобретения. В этом аспекте настоящего изобретения указанным растением может быть гибридное растение или инбредное растение.

В другом варианте осуществления изобретения крахмальная композиция включает, по крайней мере, один процессирующий фермент, которым является протеаза, глюканаза или эстераза. Предпочтительным ферментом является гипертермофильный фермент.

В другом варианте осуществления изобретения зерно содержит, по крайней мере, один процессирующий фермент, которым является α-амилаза, пуллуланаза, α-глюкозидаза, глюкоамилаза или глюкозоизомераза. Предпочтительным ферментом является гипертермофильный фермент.

В другом своем варианте настоящее изобретение относится к способу получения крахмальных зерен, включающему обработку зерна, которое содержит, по крайней мере, один не процессирующий крахмал фермент, в условиях, способствующих активации, по крайней мере, одного фермента; получение смеси, содержащей крахмальные зерна и некрахмальные продукты разложения, где указанное зерно получают из трансформированного растения, геном которого пополнен за счет экспрессирующей кассеты, кодирующей по меньшей мере один фермент; и выделение крахмальных зерен из смеси. Таким ферментом предпочтительно является протеаза, глюканаза, ксиланаза, фитаза или эстераза. Более того, указанный фермент, предпочтительно, является гипертермофильным. Зерно может быть раздроблено и/или обработано в условиях низкой или высокой влажности. Альтернативно, зерно может быть обработано диоксидом серы. Кроме того, настоящее изобретение может, предпочтительно, включать выделение некрахмальных продуктов из этой смеси. Далее также описаны крахмалопродукты и некрахмалопродукты, полученные этим способом.

В еще одном своем варианте настоящее изобретение относится к способу продуцирования сверхсладкой кукурузы, включающему в себя обработку трансформированного растения или его части, геном которого экспрессируется в эндосперме и пополнен за счет экспрессирующей кассеты, кодирующей по меньшей мере один крахмалразрушающий или крахмализомеризирующий фермент, в условиях, способствующих активации по меньшей мере одного фермента и, тем самым, превращению полисахаридов в сахар в этой кукурузе, и получение сверхсладкой кукурузы. Экспрессирующая кассета предпочтительно дополнительно содержит промотор, функционально присоединенный к полинуклеотиду, кодирующему фермент. Промотором может быть, например, конститутивный промотор, семяспецифический промотор или эндоспермспецифический промотор. Предпочтительным ферментом является гипертермофильный фермент. Более предпочтительным ферментом является α-амилаза. Используемая здесь экспрессирующая кассета может дополнительно содержать полинуклеотид, который кодирует сигнальную последовательность, функционально присоединенную к полинуклеотиду, кодирующему по меньшей мере один фермент. Сигнальная последовательность может направлять гипертермофильный фермент, например, в апопласт или в эндоплазматический ретикулум. Фермент предпочтительно включает в себя любую из последовательностей SEQ ID NO:13, 14, 15, 16, 33 или 35.

В своем наиболее предпочтительном варианте настоящее изобретение относится к способу продуцирования сверхсладкой кукурузы, включающему в себя обработку трансформированного растения кукурузы или его части, геном которого пополнен за счет экспрессирующей кассеты, причем указанная кассета, кодирующая α-амилазу, экспрессируется в эндосперме в условиях, способствующих активации по меньшей мере одного фермента и, тем самым, превращению полисахаридов в сахар в этой кукурузе; и получение сверхсладкой кукурузы. Предпочтительным ферментом является гипертермофильный фермент, и эта гипертермофильная α-амилаза содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:10, 13, 14, 15, 16, 33 или 35 или ее ферментативно активный фрагмент, обладающий α-амилазной активностью.

Описан способ получения раствора гидролизованного крахмалопродукта, включающий в себя обработку части растения, содержащей крахмальные зерна и по меньшей мере один процессирующий фермент в условиях, способствующих активации по меньшей мере одного фермента и, тем самым, процессингу крахмальных зерен, с образованием водного раствора, содержащего гидролизованный крахмалопродукт, где указанная часть растения получена из трансформированного растения, геном которого пополнен за счет экспрессирующей кассеты, кодирующей по меньшей мере один крахмалпроцессирующий фермент; и сбор водного раствора, содержащего гидрализованный крахмалопродукт. Гидрализованный крахмалопродукт может содержать декстрин, мальтоолигосахарид, глюкозу и/или их смеси. Предпочтительным ферментом является α-амилаза, α-глюкозидаза, глюкоамилаза, пуллуланаза, амилопуллуланаза, глюкозоизомераза или любая их комбинация. Более того, предпочтительным ферментом является гипертермофильный фермент. В другом аспекте настоящего изобретения геном части растения может быть дополнительно пополнен за счет экспрессирующей кассеты, кодирующей негипертермофильный крахмалпроцессирующий фермент. Негипертермофильный крахмалпроцессирующий фермент может быть выбран из группы, состоящей из амилазы, глюкоамилазы, α-глюкозидазы, пуллуланазы, глюкозоизомеразы или их комбинации. В еще одном аспекте настоящего изобретения процессирующий фермент, предпочтительно, экспрессируется в эндосперме. Предпочтительной частью растения является зерно, и этим зерном является зерно кукурузы, пшеницы, ячменя, ржи, овса, сахарного тростника или риса. При этом предпочтительно, чтобы по меньшей мере один процессирующий фермент был функционально присоединен к промотору и к сигнальной последовательности, которая нацеливает указанный фермент на крахмальные зерна или на эндоплазматический ретикулум, либо на клеточную стенку. Этот способ может дополнительно включать в себя выделение гидролизованного крахмалопродукта и/или ферментацию гидрализованного крахмалопродукта.

В другом аспекте настоящего изобретения описан способ получения гидролизованного крахмалопродукта, включающий обработку части растения, содержащей крахмальные зерна и, по крайней мере, один процессирующий фермент в условиях, способствующих активации, по крайней мере, одного фермента и, тем самым, процессингу крахмальных зерен с образованием водного раствора, содержащего гидролизованный крахмалопродукт, где указанная часть растения получена из трансформированного растения, геном которого пополнен за счет экспрессирующей кассеты, кодирующей по меньшей мере одну α-амилазу; и сбор водного раствора, содержащего продукт гидролизованного крахмала. Предпочтительно гипертермофильная α-амилаза, а более предпочтительно гипертермофильная α-амилаза содержит любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:1, 10, 13, 14, 15, 16, 33 или 35 или ее активный фрагмент, обладающий α-амилазной активностью. При этом предпочтительно, чтобы экспрессирующая кассета содержала полинуклеотид, выбранный из последовательностей SEQ ID NO:2, 9, 46 или 52 или комплементарных последовательностей, или полинуклеотид, который гибридизуется с любой из последовательностей SEQ ID NO:2, 9, 46 или 52 в условиях низкой степени жесткости и кодирует полипептид, обладающий α-амилазной активностью. Кроме того, настоящее изобретение также относится к геному трансформированного растения, который дополнительно содержит полинуклеотид, кодирующий нетермофильный крахмалпроцессирующий фермент. Альтернативно, часть растения может быть обработана негипертермофильным крахмалпроцессирующим ферментом.

Настоящее изобретение также относится к части трансформированного растения, содержащей, по крайней мере, один крахмалпроцессирующий фермент, присутствующий в клетках этого растения, где часть растения получают из трансформированного растения, геном которого пополнен за счет экспрессирующей кассеты, кодирующей по меньшей мере один крахмалпроцессирующий фермент. Предпочтительным ферментом является крахмалпроцессирующий фермент, выбранный из группы, состоящей из α-амилазы, глюкоамилазы, глюкозоизомеразы, β-амилазы, α-глюкозидазы, изоамилазы, пуллуланазы, неопуллуланазы, изопуллуланазы и амилопуллуланазы. Кроме того, указанный фермент является, предпочтительно, гипертермофильным. Растением может быть любое растение, предпочтительно кукуруза.

В другом своем варианте настоящее изобретение также относится к части трансформированного растения, содержащей по меньшей мере один крахмалпроцессирующий фермент, присутствующий в клеточных стенках или в клетках растения, где часть растения получают из трансформированного растения, геном которого пополнен за счет экспрессирующей кассеты, кодирующей по меньшей мере один не процессирующий крахмал фермент или по меньшей мере один фермент, процессирующий полисахарид, не являющийся крахмалом. Этот фермент, предпочтительно, является гипертермофильным. Более того, не процессирующий крахмал фермент предпочтительно выбирают из группы, состоящей из протеазы, глюканазы, ксиланазы, эстеразы, фитазы и липазы. Частью растения может быть любая часть растения, а предпочтительно, колос, семя, плод, зерно, кукурузная солома, чешуя злаков или багасса.

Настоящее изобретение также относится к частям трансформированного растения. Так, например, описана часть трансформированного растения, содержащая α-амилазу, имеющую любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:1, 10, 13, 14, 15, 16, 33 или 35, или кодируемую полинуклеотидом, содержащим любую из последовательностей SEQ ID NO: 2, 9, 46 или 52; часть трансформированного растения, содержащая α-глюкозидазу, имеющую любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:5, 26 или 27 или кодируемую полинуклеотидом, содержащим последовательность SEQ ID NO:6; часть трансформированного растения, содержащая глюкозоизомеразу, имеющую любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:28, 29, 30, 38, 40, 42 или 44 или кодируемую полинуклеотидом, содержащим любую из последовательностей SEQ ID NO:19, 21, 37, 39, 41 или 43; часть трансформированного растения, содержащая глюкоамилазу, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:45 или SEQ ID NO:47 или SEQ ID NO:49 или кодируемую полинуклеотидом, содержащим любую из последовательностей SEQ ID NO:46, 48, 50 или 59; часть трансформированного растения, содержащая пуллуланазу, кодируемую полинуклеотидом, содержащим любую из последовательностей SEQ ID NO:4 или 25.

В другом своем варианте настоящее изобретение относится к способу превращения крахмала в часть трансформированного растения, включающему активацию содержащегося в нем крахмалпроцессирующего фермента. Описаны также крахмал, декстрин, мальтоолигосахарид или сахар, продуцируемые в соответствии с этим способом.

Настоящее изобретение также относится к способу использования части трансформированн