Гены corynebacterium glutamicum, кодирующие белки, участвующие в синтезе мембран и мембранном транспорте

Гены corynebacterium glutamicum, кодирующие белки, участвующие в синтезе мембран и мембранном транспорте

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Родственные заявки

Данная заявка заявляет приоритет предварительной заявки на патент США №60/141031, поданной 25 июня 1999 года. Данная заявка заявляет также приоритет заявки на патент Германии №19931454.3, поданной 8 июля 1999 года, заявки на патент Германии №19931478.0, поданной 8 июля 1999 года, заявки на патент Германии №19931563.9, поданной 8 июля 1999 года, заявки на патент Германии №19932122.1, поданной 9 июля 1999 года, заявки на патент Германии №19932124.8, поданной 9 июля 1999 года, заявки Германии на патент №19932125.6, поданной 9 июля 1999 года, заявки Германии на патент №19932128.0, поданной 9 июля 1999 года, заявки на патент Германии №19932180.9, поданной 9 июля 1999 года, заявки на патент Германии №19932182.5, поданной 9 июля 1999 года, заявки на патент Германии №19932190.6, поданной 9 июля 1999 года, заявки на патент Германии №19932191.4, поданной 9 июля 1999 года, заявки на патент Германии №19932209.0, поданной 9 июля 1999 года, заявки на патент Германии №19932212.0, поданной 9 июля 1999 года, заявки на патент Германии №19932227.9, поданной 9 июля 1999 года, заявки на патент Германии №19932228.7, поданной 9 июля 1999 года, заявки на патент Германии №19932229.5, поданной 9 июля 1999 года, заявки на патент Германии №19932230.9, поданной 9 июля 1999 года, заявки на патент Германии №19932927.3, поданной 14 июля 1999 года, заявки на патент Германии №19933005.0, поданной 14 июля 1999 года, заявки на патент Германии №19933006.9, поданной 14 июля 1999 года, заявки на патент Германии №19940764.9, поданной 27 августа 1999 года, заявки на патент Германии №19940765.7, поданной 27 августа 1999 года, заявки на патент Германии №19940766.5, поданной 27 августа 1999 года, заявки на патент Германии №19940830.0, поданной 27 августа 1999 года, заявки на патент Германии №19940831.9, поданной 27 августа 1999 года, заявки на патент Германии №19940832.7, поданной 27 августа 1999 года, заявки на патент Германии №19940833.5, поданной 27 августа 1999 года, заявки на патент Германии №19941378.9, поданной 31 августа 1999 года, заявки на патент Германии №19941379.7, поданной 31 августа 1999 года, заявки на патент Германии №19941395.9, поданной 31 августа 1999 года, заявки на патент Германии №19942077.7, поданной 3 сентября 1999 года, заявки на патент Германии №19942078.5, поданной 3 сентября 1999 года, заявки на патент Германии №19942079.3, поданной 3 сентября 1999 года, и заявки на патент Германии №19942088.2, поданной 3 сентября 1999 года. Полные содержания всех вышеуказанных заявок включены здесь в виде ссылки.

Предпосылки изобретения

Некоторые продукты и побочные продукты природно встречающихся метаболических процессов в клетках имеют применение в широком списке отраслей промышленности, в том числе в кормовой, пищевой, косметической и фармацевтической отраслях промышленности. Эти молекулы, совокупно называемые "химическими продуктами тонкого органического синтеза", включают органические кислоты, как входящие в состав белков (протеиногенные), так и не входящие в состав белков (непротеиногенные) аминокислоты, нуклеотиды и нуклеозиды, липиды и жирные кислоты, диолы, углеводы, ароматические соединения, витамины и кофакторы и ферменты. Их получение наиболее удобно выполнять посредством крупномасштабной культуры бактерий, разработанной для продуцирования и секреции больших количеств одной или более желаемых молекул. Одним особенно применимым организмом для этой цели является Corynebacterium glutamicum, грамположительная, не патогенная бактерия. Посредством отбора штаммов был получен ряд мутантных штаммов, которые продуцируют ряд желаемых соединений. Однако, отбор штаммов, улучшенных в отношении продуцирования конкретной молекулы, является трудоемким процессом, отнимающим много времени.

Сущность изобретения

Данное изобретение представляет новые бактериальные молекулы нуклеиновых кислот, которые имеют множество применений. Эти применения включают идентификацию микроорганизмов, которые могут быть использованы для получения химических продуктов тонкого органического синтеза, модуляции образования химических продуктов тонкого органического синтеза в С. glutamicum или родственных бактериях, типирования или идентификации С. glutamicum или родственных бактерий, в качестве ссылочных точек для картирования генома С. glutamicum и в качестве маркеров для трансформации. Эти новые молекулы нуклеиновых кислот кодируют белки, называемые здесь белками конструирования мембран и мембранного транспорта (МСТ).

С. glutamicum является грамположительной, аэробной бактерией, которую обычно используют в промышленности для крупномасштабного получения множества химических продуктов тонкого органического синтеза, а также для расщепления углеводородов (например, в разливах нефти) и для окисления терпеноидов. Таким образом, молекулы нуклеиновых кислот МСТ данного изобретения могут быть использованы для идентификации микроорганизмов, которые могут быть использованы для получения химических продуктов тонкого органического синтеза, например, посредством ферментационных процессов. Модуляция экспрессии нуклеиновых кислот МСТ данного изобретения или модификация последовательности молекул нуклеиновых кислот МСТ данного изобретения может использоваться для модуляции образования одного или нескольких химических продуктов тонкого органического синтеза из микроорганизма (например, для улучшения выхода или получения одного или нескольких химических продуктов тонкого органического синтеза из видов Corynebacterium или Brevibacterium).

Нуклеиновые кислоты МСТ данного изобретения могут быть также использованы для идентификации организма как являющегося Corynebacterium glutamicum или близкородственной бактерией или для идентификации присутствия С. glutamicum или родственной бактерии в смешанной популяции микроорганизмов. Данное изобретение представляет последовательности нуклеиновых кислот ряда генов С. glutamicum; зондированием экстрагированной геномной ДНК культуры уникальной или смешанной популяции микроорганизмов при строгих условиях зондом, охватывающим участок гена С. glutamicum, который является уникальным в отношении этого организма, можно определить, присутствует ли данный организм. Хотя сама бактерия Corynebacterium glutamicum является непатогенной, она является родственной видам, патогенным в человеке, таким как Corynebacterium diphtheriae (возбудитель дифтерии); выявление таких организмов имеет важное клиническое значение.

Молекулы нуклеиновых кислот МСТ данного изобретения могут также служить в качестве ссылочных точек для картирования генома С. glutamicum или геномов родственных организмов. Подобным образом, эти молекулы, или их варианты или части, могут служить в качестве маркеров для генетически сконструированных видов Corynebacterium или Brevibacterium.

Белки МСТ, кодируемые новыми молекулами нуклеиновых кислот данного изобретения, способны, например, выполнять функцию, участвующую в метаболизме (например, биосинтезе или расщеплении) соединений, необходимых для биосинтеза мембран, или способствовать трансмембранному транспорту одного или большего количества соединений в клетку или из клетки. При условии доступности клонирующих векторов для применения в Corynebacterium glutamicum, таких как векторы, описанные в Sinskey et al., U.S. Patent №4649119, и способов для генетической манипуляции С. glutamicum и родственных видов Brevibacterium (например, lactofermentum) (Yoshihama et al., J. Bacteriol. 162: 591-597 (1985); Katsumata et al., J. Bacteriol. 159: 306-311 (1984) и Santamaria et al., J. Gen. Microbiol. 130: 2237-2246 (1984)), молекулы нуклеиновых кислот данного изобретения могут быть использованы в генетической инженерии этого организма, чтобы сделать его лучшим или более эффективным продуцентом одного или нескольких химических продуктов тонкого органического синтеза. Это улучшенное продуцирование или улучшенная эффективность продуцирования химического продукта тонкого органического синтеза могут быть обусловлены прямым действием манипулирования геном данного изобретения или могут быть обусловлены непрямым действием такого манипулирования.

Существует ряд механизмов, при помощи которых изменение белка МСТ данного изобретения может непосредственно влиять на выход, продуцирование и/или эффективность продуцирования химического продукта тонкого органического синтеза из штамма С. glutamicum, включающего в себя такой измененный белок. Белки МСТ, участвующие в экспорте молекул химических продуктов тонкого органического синтеза из клетки, могут быть увеличены в числе или усилены в активности, так что большие количества этих соединений секретируются во внеклеточную среду, из которой они более легко извлекаются. Подобным образом, белки МСТ, участвующие в импорте питательных веществ, необходимых для биосинтеза одного или нескольких химических продуктов тонкого органического синтеза (например, фосфатных, сульфатных, азотсодержащих соединений и т.д.), могут быть увеличенными в концентрации или активности, так что эти предшественники, кофакторы или промежуточные соединения увеличиваются в концентрации в клетке. Далее, жирные кислоты и липиды сами являются желательными химическими продуктами тонкого органического синтеза; посредством оптимизации активности или увеличения числа одного или нескольких белков МСТ данного изобретения, участвующих в биосинтезе этих соединений, или посредством нарушения активности одного или нескольких белков МСТ, участвующих в расщеплении этих соединений, можно увеличить выход, продуцирование и/или эффективность продуцирования молекул жирных кислот и липидов из С. glutamicum.

Мутагенез одного или нескольких генов МСТ данного изобретения может также приводить к белкам МСТ, имеющим измененные активности, которые опосредованно влияют на продуцирование одного или нескольких желательных химических продуктов тонкого органического синтеза из С. glutamicum. Например, белки МСТ данного изобретения, участвующие в экспорте отработанных продуктов клетки (возможно, увеличенных в количестве вследствие сверхпродуцирования желательного химического продукта тонкого органического синтеза), эффективно экспортируются, прежде чем они способны повредить нуклеотиды и белки в клетке (что уменьшало бы жизнеспособность данной клетки) или помешать биосинтетическим путям химических продуктов тонкого органического синтеза (что уменьшало бы выход, продуцирование или эффективность продуцирования желательного химического продукта тонкого органического синтеза). Далее, относительно большие внутриклеточные количества желательного химического продукта тонкого органического синтеза может само быть токсичным для клетки, так что посредством увеличения активности или числа переносчиков (транспортеров), способных экспортировать это соединение из клетки, можно увеличить жизнеспособность данной клетки в культуре, что, в свою очередь, приводит к большему числу клеток в культуре, продуцирующих желательный химический продукт тонкого органического синтеза. Белки МСТ данного изобретения могут быть подвергнуты манипулированию таким образом, что продуцируются относительно измененные количества различных молекул липидов и жирных кислот. Это может оказывать сильное влияние на состав липидов мембраны клетки. Поскольку каждый тип липида имеет различные физические свойства, изменение в липидном составе мембраны может существенно изменять текучесть мембраны. Изменения в текучести мембраны могут влиять на транспорт молекул через мембрану, а также на целостность клетки, причем оба эти свойства имеют сильное влияние на продуцирование химических продуктов тонкого органического синтеза из С. glutamicum в крупномасштабной ферментационной культуре.

Данное изобретение представляет новые молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют белки, называемые здесь белками МСТ, которые способны, например, участвовать в метаболизме соединений, необходимых для конструирования клеточных мембран в С. glutamicum или в транспорте молекул через эти мембраны. Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие белок МСТ, называют здесь молекулами нуклеиновых кислот МСТ. В предпочтительном варианте белок МСТ участвует в метаболизме соединений, необходимых для построения (конструирования) клеточных мембран в С. glutamicum или в транспорте молекул через эти мембраны. Примеры таких белков включают белки, кодируемые генами, представленными в таблице 1.

Таким образом, один аспект данного изобретения относится к выделенным молекулам нуклеиновых кислот (например, кДНК, ДНК или РНК), содержащим нуклеотидную последовательность, кодирующую белок МСТ или его биологически активные части, а также фрагментам нуклеиновых кислот, пригодным в качестве праймеров или гибридизационных зондов для обнаружения или амплификации МСТ-кодирующей нуклеиновой кислоты (например, ДНК или мРНК). В особенно предпочтительных вариантах выделенная молекула нуклеиновой кислоты содержит одну из нуклеотидных последовательностей, представленных в виде имеющих нечетные номера SEQ ID NO в Списке последовательностей (например, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7...), или кодирующий район или его комплемент одной из этих нуклеотидных последовательностей. В других особенно предпочтительных вариантах выделенная молекула нуклеиновой кислоты данного изобретения содержит нуклеотидную последовательность, которая гибридизуется с нуклеотидной последовательностью или является по меньшей мере на приблизительно 50%, предпочтительно по меньшей мере на приблизительно 60%, более предпочтительно по меньшей мере на приблизительно 70%, 80% или 90% и даже более предпочтительно по меньшей мере на приблизительно 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более гомологичной нуклеотидной последовательности, представленной в виде имеющих нечетные номера SEQ ID NO в Списке последовательностей (например, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7...), или ее части. В других предпочтительных вариантах выделенная молекула нуклеиновой кислоты кодирует одну из аминокислотных последовательностей, представленных в виде имеющих четные номера SEQ ID NO в Списке последовательностей (например, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8...). Предпочтительные белки МСТ данного изобретения также предпочтительно имеют по меньшей мере одну из описанных здесь активностей МСТ.

В другом варианте выделенная молекула нуклеиновой кислоты кодирует белок или его часть, причем этот белок или его часть включает аминокислотную последовательность, которая является достаточно гомологичной аминокислотной последовательности данного изобретения (например, последовательности, имеющей четный номер SEQ ID NO: в Списке последовательностей), например, достаточно гомологичной аминокислотной последовательности данного изобретения, так что этот белок или его часть сохраняет активность МСТ. Предпочтительно, белок или его часть, кодируемые этой молекулой нуклеиновой кислоты, сохраняют способность участвовать в метаболизме соединений, необходимых для конструирования клеточных мембран в С. glutamicum или в транспорте молекул через эти мембраны. В одном варианте белок, кодируемый указанной молекулой нуклеиновой кислоты, является по меньшей мере на приблизительно 50%, предпочтительно по меньшей мере на приблизительно 60% и более предпочтительно по меньшей мере на приблизительно 70%, 80% или 90% и наиболее предпочтительно по меньшей мере на приблизительно 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более гомологичным аминокислотной последовательности данного изобретения (например, полной аминокислотной последовательности, выбранной из аминокислотных последовательностей, имеющих четные номера SEQ ID NO: в Списке последовательностей). В другом предпочтительном варианте этот белок является полноразмерным белком С. glutamicum, который является по существу гомологичным полной аминокислотной последовательности данного изобретения (кодируемой открытой рамкой считывания, показанной в соответствующих имеющих нечетные номера SEQ ID NO в Списке последовательностей (например, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7...).

В другом предпочтительном варианте выделенная молекула нуклеиновой кислоты происходит из С. glutamicum и кодирует белок (например, слитый белок МСТ), который включает биологически активный домен, который по меньшей мере на приблизительно 50% или более гомологичен одной из аминокислотных последовательностей данного изобретения (например, последовательности одной из имеющих четные номера SEQ ID NO: в Списке последовательностей) и способен участвовать в метаболизме соединений, необходимых для конструирования клеточных мембран в С. glutamicum или в транспорте молекул через эти мембраны, или имеет одну или несколько активностей, представленных в таблице 1, и также включает гетерологичные последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие гетерологичные полипептид или регуляторные участки.

В другом варианте выделенная молекула нуклеиновой кислоты имеет длину по меньшей мере 15 нуклеотидов и гибридизуется при строгих условиях с молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность данного изобретения (например, последовательность, имеющая нечетный номер SEQ ID NO: в Списке последовательностей). Предпочтительно, выделенная молекула нуклеиновой кислоты соответствует природно встречающейся молекуле нуклеиновой кислоты. Более предпочтительно, выделенная нуклеиновая кислота кодирует природно встречающийся белок МСТ С. glutamicum или его биологически активную часть.

Другой аспект данного изобретения относится к векторам, например, рекомбинантным экспрессирующим векторам, содержащим молекулы нуклеиновых кислот данного изобретения, и клеткам-хозяевам, в которые были введены такие векторы. В одном варианте такую клетку-хозяина используют для получения белка МСТ культивированием клетки-хозяина в подходящей среде. Затем белок МСТ может быть выделен из этой среды или из клетки-хозяина.

Еще один аспект данного изобретения относится к генетически измененному микроорганизму, в котором ген МСТ был введен или изменен. В одном варианте геном микроорганизма был изменен введением молекулы нуклеиновой кислоты данного изобретения, кодирующей последовательность МСТ дикого типа или мутированную последовательность МСТ, в качестве трансгена. В другом варианте эндогенный ген МСТ в геноме микроорганизма был изменен, например, функционально нарушен, гомологичной рекомбинацией с измененным геном МСТ. В другом варианте эндогенный или введенный ген МСТ в микроорганизме был изменен одной или несколькими точковыми мутациями, делециями или инверсиями, но все еще кодирует функциональный ген белка МСТ. Еще в одном варианте один или несколько регуляторных участков (например, промотор, репрессор или индуктор) гена МСТ в микроорганизме был изменен (например, делецией, укорочением, инверсией или точковой мутацией), так что экспрессия гена МСТ является модулированной. В предпочтительном варианте этот микроорганизм принадлежит к роду Corynebacterium или Brevibacterium, причем особенно предпочтительным является Corynebacterium glutamicum. В предпочтительном варианте этот микроорганизм используют также для получения желаемого соединения, такого как аминокислота, причем особенно предпочтительным является лизин.

В другом аспекте данное изобретение представляет способ идентификации присутствия или активности Corynebacterium diphtheriae в субъекте. Этот способ включает обнаружение одной или нескольких последовательностей нуклеиновых кислот или аминокислотных последовательностей данного изобретения (например, последовательностей, представленных в Списке последовательностей в виде SEQ ID NO:1-676), в субъекте, детектированием тем самым присутствия или активности Corynebacterium diphtheriae в субъекте.

Еще один аспект данного изобретения относится к выделенным белку МСТ или его части, например, его биологически активной части. В предпочтительном варианте выделенные белок МСТ или его часть может участвовать в метаболизме соединений, необходимых для конструирования клеточных мембран в С. glutamicum или в транспорте молекул через эти мембраны. В другом предпочтительном варианте выделенные белок МСТ или его часть являются достаточно гомологичными аминокислотной последовательности данного изобретения (например, последовательности, имеющей четный номер SEQ ID NO: в Списке последовательностей), так что этот белок или его часть сохраняет способность участвовать в метаболизме соединений, необходимых для конструирования клеточных мембран в С. glutamicum или в транспорте молекул через эти мембраны.

Данное изобретение представляет также выделенный препарат белка МСТ. В предпочтительных вариантах белок МСТ содержит аминокислотную последовательность данного изобретения (например, последовательность, имеющая четный номер SEQ ID NO: Списка последовательностей). В другом предпочтительном варианте данное изобретение относится к выделенному полноразмерному белку, который является по существу гомологичным полной аминокислотной последовательности данного изобретения (например, последовательности, имеющей четный номер SEQ ID NO: Списка последовательностей) (кодируемому открытой рамкой считывания, приведенной в соответствующих имеющих нечетные номера SEQ ID NO: Списка последовательностей). Еще в одном варианте этот белок является по меньшей мере на приблизительно 50%, предпочтительно по меньшей мере на приблизительно 60% и более предпочтительно по меньшей мере на приблизительно 70%, 80% или 90% и наиболее предпочтительно по меньшей мере на приблизительно 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более гомологичным полной аминокислотной последовательности данного изобретения (например, последовательности, имеющей четный номер SEQ ID NO: Списка последовательностей). В других вариантах выделенный белок МСТ содержит аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на приблизительно 50% или более гомологичной одной из аминокислотных последовательностей данного изобретения (например, последовательности, имеющей четный номер SEQ ID NO: Списка последовательностей), и способен участвовать в метаболизме соединений, необходимых для конструирования клеточных мембран в С. glutamicum в транспорте молекул через клеточную мембрану, или имеет одну или несколько активностей, приведенных в таблице 1.

Альтернативно, выделенный белок МСТ может содержать аминокислотную последовательность, которая кодируется нуклеотидной последовательностью, которая гибридизуется, например, гибридизуется при строгих условиях, с нуклеотидной последовательностью, или является по меньшей мере на приблизительно 50%, предпочтительно по меньшей мере на приблизительно 60%, более предпочтительно по меньшей мере на приблизительно 70%, 80% или 90% и даже более предпочтительно по меньшей мере на приблизительно 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более гомологичной нуклеотидной последовательности одной из имеющих четные номера SEQ ID NO:, представленных в Списке последовательностей. Также предпочтительно, чтобы предпочтительные формы белков МСТ имели также одну или несколько из биологических активностей МСТ, описанных здесь.

Полипептид МСТ или его биологически активная часть могут быть функционально связаны с полипептидом не-МСТ с образованием слитого белка. В предпочтительных вариантах этот слитый белок имеет активность, которая отличается от активности одного белка МСТ. В других предпочтительных вариантах этот слитый белок участвует в метаболизме соединений, необходимых для конструирования клеточных мембран в С. glutamicum или в транспорте молекул через эти мембраны. В особенно предпочтительных вариантах интеграция этого слитого белка в клетку-хозяина модулирует продуцирование желаемого соединения из данной клетки.

В другом аспекте данное изобретение представляет способы скрининга молекул, которые модулируют активность белка МСТ, либо посредством взаимодействия с самим белком или субстратом или партнером связывания белка МСТ, либо посредством модуляции транскрипции или трансляции молекулы нуклеиновой кислоты МСТ данного изобретения.

Другой аспект данного изобретения относится к способу получения химического продукта тонкого органического синтеза. Этот способ предусматривает культивирование клетки, содержащей вектор, направляющий экспрессию молекулы нуклеиновой кислоты МСТ данного изобретения таким образом, что образуется химический продукт тонкого органического синтеза. В предпочтительном варианте этот способ дополнительно включает стадию получения клетки, содержащей такой вектор, в которой клетку трансфицируют вектором, направляющим экспрессию нуклеиновой кислоты МСТ. В другом предпочтительном варианте этот способ дополнительно предусматривает стадию извлечения химических продуктов тонкого органического синтеза из культуры. В особенно предпочтительном варианте эта клетка является клеткой из рода Corynebacterium или Brevibacterium или выбрана из штаммов, приведенных в таблице 3.

Другой аспект данного изобретения относится к способам модуляции продуцирования молекулы из микроорганизма. Такие способы включают контактирование клетки с агентом, который модулирует активность белка МСТ или экспрессию нуклеиновой кислоты МСТ, так что связанная с клеткой активность является измененной относительно той же самой активности в отсутствие этого агента. В предпочтительном варианте клетку модулируют в отношении одного или нескольких метаболических путей С. glutamicum для компонентов клеточной мембраны или модулируют в отношении транспорта соединений через такие мембраны, так что выходы или скорость продуцирования желательного химического продукта тонкого органического синтеза этим микроорганизмом улучшается. Агент, который модулирует активность белка МСТ, может быть агентом, стимулирующим активность белка МСТ или экспрессию нуклеиновой кислоты МСТ. Примеры агентов, стимулирующих активность белка МСТ или экспрессию нуклеиновой кислоты МСТ, включают небольшие молекулы, активные белки МСТ и нуклеиновые кислоты, кодирующие белки МСТ, которые были введены в клетку. Примеры агентов, ингибирующих активность МСТ или экспрессию, включают небольшие молекулы и антисмысловые молекулы нуклеиновых кислот МСТ.

Другой аспект данного изобретения относится к способам модуляции выходов желаемого соединения из клетки, включающим введение гена МСТ дикого типа или мутантного МСТ в клетку, либо сохраняемого на отдельной плазмиде, либо интегрируемого в геном клетки-хозяина. При интегрировании в геном такая интеграция может быть случайной или она может происходить посредством гомологичной рекомбинации, так что нативный ген заменяется вводимой копией, обусловливая модуляцию продуцирования желаемого соединения из этой клетки. В предпочтительном варианте указанные выходы увеличиваются. В другом предпочтительном варианте указанный химический продукт является химическим продуктом тонкого органического синтеза. В конкретном предпочтительном варианте указанный химический продукт тонкого органического синтеза является аминокислотой. В особенно предпочтительном варианте указанная аминокислота является L-лизином.

Подробное описание изобретения

Данное изобретение представляет молекулы нуклеиновой кислоты и белка МСТ, которые участвует в метаболизме соединений, необходимых для конструирования клеточных мембран в С. glutamicum или в транспорте соединений через эти мембраны. Молекулы данного изобретения могут быть использованы в модуляции получения химических продуктов тонкого органического синтеза из микроорганизмов, таких как С. glutamicum, непосредственно (например, когда сверхэкспрессия или оптимизация белка, участвующего в биосинтезе жирных кислот, оказывает прямое действие на выход, продуктивность и/или эффективность продуцирования жирных кислот из модифицированного С. glutamicum) или могут иметь опосредованное действие, которое тем не менее приводит к увеличению выхода, продуцирования и/или эффективности продуцирования желаемого соединения (например, когда модуляция метаболизма компонентов клеточной мембраны приводит к изменениям в выходе, продуцировании и/или эффективности продуцирования или составе клеточной мембраны, что, в свою очередь, влияет на продуцирование одного или большего количества химических продуктов тонкого органического синтеза). Аспекты данного изобретения дополнительно объясняются ниже.

I. Химические продукты тонкого органического синтеза

Термин «химический продукт тонкого органического синтеза» является признанным в данной области и включает молекулы, продуцируемые организмом, которые имеют применения в различных отраслях промышленности, таких как, но не только, фармацевтическая, сельскохозяйственная и косметическая отрасли промышленности. Такие соединения включают органические кислоты, такие как винная кислота, итаконовая кислота и диаминопимелиновая кислота, как протеиногенные, так и непротеиногенные аминокислоты, пуриновые и пиримидиновые основания, нуклеозиды и нуклеотиды (описанные, например, в Kuninaka, А. (1996) Nucleotides and related compounds, p.561-612, in Biotechnology vol.6, Rehm et al., eds. VCH: Weinheim, и содержащихся в них ссылках), липиды, насыщенные и ненасыщенные жирные кислоты (например, арахидоновая кислота), диолы (например, пропандиол и бутандиол), углеводы (например, гиалуроновая кислота и трегалоза), ароматические соединения (например, ароматические амины, ванилин и индиго), витамины и кофакторы (описанные в Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol.A27, "Vitamins", p.443-613 (1996) VCH: Weinheim и ссылках в них; и Ong, A.S., Niki, E. and Packer, L. (1995) "Nutrition, Lipids, Health, and Disease" Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia, and Society for Free Radical Research-Asia, held Sept.1-3, 1994 at Penang, Malaysia, AOCS Press, (1995)), ферменты, поликетиды (Cane et al., (1998) Science 282: 63-68) и все другие химические продукты, описанные в Gutcho (1983) Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation, ISBN: 0818805086 и имеющихся в этой работе ссылках. Метаболизм и применения некоторых из этих химических продуктов тонкого органического синтеза дополнительно раскрываются ниже.

А. Метаболизм и применения аминокислот

Аминокислоты составляют основные структурные единицы всех белков и как таковые являются важными для нормального клеточного функционирования во всех организмах. Термин «аминокислота» является признанным в данной области. Протеиногенные аминокислоты, которыми являются 20 видов, служат в качестве структурных единиц для белков, в которых они связаны пептидными связями, тогда как непротеиногенные аминокислоты (сотни которых известны) обычно не обнаруживаются в белках (см. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol.A2, p.57-97 VCH: Weinheim (1985)). Аминокислоты могут быть в D- или L-конфигурации, хотя L-аминокислоты являются обычно единственным типом, обнаруживаемым в природно встречающихся белках. Биосинтетические и пути разложения каждой из 20 протеиногенных аминокислот были хорошо охарактеризованы как в прокариотических, так и в эукариотических клетках (см., например, Stryer, L. Biochemistry, 3^rd edition, pages 578-590 (1988)). «Незаменимые» аминокислоты (гистидин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, треонин, триптофан и валин), названные так, поскольку они обычно являются необходимыми в питании вследствие сложности их биосинтеза, легко превращаются посредством простых биосинтетических путей в остальные 11 «не-незаменимых» аминокислот (аланин, аргинин, аспарагин, аспартат, цистеин, глутамат, глутамин, глицин, пролин, серин и тирозин). Высшие животные действительно сохраняют способность синтезировать некоторые из этих аминокислот, но незаменимые аминокислоты должны предоставляться из пищевого рациона, для того, чтобы имел место нормальный синтез белков.

Помимо их функции в биосинтезе белков, эти аминокислоты сами по себе представляют интерес, и было обнаружено, что многие из них имеют различные применения в кормовой, пищевой, химической, косметической, сельскохозяйственной и фармацевтической отраслях промышленности. Лизин является важной аминокислотой в питании не только человека, но также моногастрических животных (животных с однокамерным желудком), таких как домашняя птица и свинья. Глутамат наиболее часто используется в качестве вкусовой добавки (мононатрий-глутамат, MSG) и широко применяется в пищевой промышленности, так же как и аспартат, фенилаланин, глицин и цистеин. Глицин, L-метионин и триптофан используются в фармацевтической промышленности. Глутамин, валин, лейцин, изолейцин, гистидин, аргинин, пролин, серин и аланин применяют как в фармацевтической, так и в косметической промышленности. Треонин, триптофан и D/L-метионин являются общепринятыми пищевыми добавками (Leuchtenberger, W. (1996) Amino acids - technical production and use, p.466-502 in Rehm et al., (eds.) Biotechnology vol.6, chapter 14a, VCH: Weinheim). Кроме того, было обнаружено, что эти аминокислоты применимы в качестве предшественников для синтеза синтетических аминокислот и белков, таких как N-ацетилцистеин, S-карбоксиметил-L-цистеин, (S)-5-гидрокситриптофан и другие, описанные в Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol.A2, p.57-97 VCH: Weinheim, 1985.

Биосинтез этих природных аминокислот в организмах, способных их продуцировать, таких как бактерии, был хорошо охарактеризован (в отношении обзора бактериального биосинтеза аминокислот и его регуляции см., например, Umbarger, H.E. (1978) Ann. Rev. Biochem. 47: 533-606). Глутамат синтезируется восстановительным аминированием α-кетоглутарата, промежуточного продукта цикла лимонной кислоты. Глутамин, пролин и аргинин, каждый, образуются затем из глутамата. Биосинтез серина является трехстадийным процессом, начинающимся с 3-фосфоглицерата (промежуточного продукта в гликолизе) и приводящим к этой аминокислоте после стадий окисления, переаминирования и гидролиза. Как цистеин, так и глицин образуются из серина; первый посредством конденсации гомоцистеина с серином, а последний переносом β-углеродного атома боковой цепи к тетрагидрофолату, в реакции, катализируемой серин-трансгидроксиметилазой. Фенилаланин и тирозин синтезируются из предшественников гликолитического и пентозофосфатного пути эритрозо-4-фосфата и фосфоенолпирувата в 9-стадийном биосинтетическом пути, который отличается только на конечных двух стадиях после синтеза префената. Триптофан также образуется из этих двух исходных молекул, но его синтез является 11-стадийным путем. Тирозин может быть также синтезирован из фенилаланина, в реакции, катализируемой фенилаланингидроксилазой. Аланин, валин и лейцин - все являются биосинтетическими продуктами пирувата, конечного продукта гликолиза. Аспартат образуется из оксалоацетата, промежуточного продукта цикла лимонной кислоты. Аспарагин, метионин, треонин и лизин, каждый, образуются преобразованием аспартата. Изолейцин образуется из треонина. Сложный 9-стадийный путь приводит к образованию гистидина из 5-фосфорибозил-1-пирофосфата, активированного сахара.

Аминокислоты в превышающем потребности белкового синтеза клетки количестве не могут запасаться и вместо этого разрушаются с образованием промежуточных продуктов для основных метаболических путей клетки (в отношении обзора см. Stryer, L. Biochemistry 3^rd ed. Ch.21 "Amino Acid Degradation and. the Urea Cycle" p.495-516 (1998)). Хотя клетка способна превращать нежелательные аминокислоты в полезные метаболические промежуточные продукты, получение аминокислот является дорогостоящим в отношении энергии, молекул предшественников и ферментов, необходимых для их синтеза. Таким образом, неудивительно, что биосинтез аминокислот регулируется ингибированием по типу обратной связи, в котором присутствие конкретной аминокислоты служит для замедления или полной остановки ее собственного образования (в отношении обзора механизмов по типу обратной связи в путях биосинтеза аминокислот см. Stryer, L. Biochemistry 3^rd ed. Ch.24: "Biosynthesis of Amino Acids and Heme" p.575-600 (1988)). Таким образом, выход любой конкретной аминокислоты лимитирован количеством этой аминокислоты, присутствующим в клетке.

В. Метаболизм и применения витаминов, кофакторов и нутрацевтических веществ (пищевых добавок)

Витамины, кофакторы и нутрацевтические вещества (пищевые добавки) составляют другую группу молекул, которые высшие животные не синтезируют вследствие утраты способности их синтеза и которые, следовательно, должны приниматься животными с пищей, хотя они легко синтезируются другими организмами, такими как бактерии. Эти молекулы либо сами являются биологически активными веществами, либо они являются предшественниками биологически активных веществ, которые могут служить в качестве носителей электронов или промежуточных продуктов в многочисленных метаболических путях. Помимо их питательной ценности, эти соединения имеют также значительную промышленную ценность в качестве красящих агентов, антиоксидантов и катализаторов или других технологических вспомогательных средств. (В отношении обзора структуры, активности и промышленных применений этих соединений см., напри