Способ диагностики эстроген- и прогестеронзависимой патологии гениталий

Способ диагностики эстроген- и прогестеронзависимой патологии гениталий

Реферат

Изобретение относится к медицине, в частности к гинекологии.

Увеличение количества рецепторов эстрадиола и прогестерона в измененной ткани свидетельствует о гормональной зависимости патологического процесса.

Наиболее социально значимыми гормонозависимыми патологиями гениталий в настоящее время можно считать гиперплазии эндометрия, эндометриоз, миому матки (Серов В.Н. и соавт. Гинекологическая эндокринология. Москва: МЕД-прессинформ, 2004, 520 с.).

Современная диагностика гормонально-зависимых состояний гениталий включает в себя: ультразвуковое исследование (Манухин И.Б. и соавт. Клинические лекции по гинекологии. - М.: Мед. информационное агентство, 2001, 243 с.) регистрирует объемные образования, например, толщину эндометрия. По данным Манухина И.Б., нормальному эндометрию в фазе секреции соответствуют значения - 9,8±2,1 мм, гиперплазии эндометрия - 15,4±10,4 мм, аденокарциноме эндометрия - 20,12±2,04 мм. Этот метод определяет лишь объемные образования в ткани, но не позволяет судить об их гормональной зависимости.

Для подтверждения предварительного диагноза, основанного на данных М-ЭХО (УЗИ), используют:

- гистологическое исследование биоптата. Он позволяет поставить диагноз конкретной морфологической нозологии. Однако и этот метод не позволяет решить вопрос о гормональной зависимости патологического процесса.

- Определение гонадотропинов и половых стероидов в периферической крови (Сметник В.П., Тумилович Л.Г. Неоперативная гинекология. - М.: Мед. информационное агентство, 2000, 591 с.) необходимо для оценки гормонального фона заболевания, изменение которого зачастую инициирует и сопутствует патологическому процессу. Изменение гормонального фона (например, абсолютная или относительная гиперэстрогенемия) у пациентки служит косвенным подтверждением гормональной зависимости патологического процесса, но не отражает состояние рецепторного статуса самой патологически измененной ткани.

Наиболее близким к предлагаемому способу диагностики эстроген- и прогестеронозависимости патологии гениталий является определение уровня рецепторов эстрадиола и прогестерона в биоптате (Краснопольский В.И. и соавт. «Рецепция половых стероидов при гиперпластических процессах в эндометрии у женщин позднего репродуктивного возраста» / Ж. Росс. Вестник акушера-гинеколога. - М.: МедиаСфера, 2005, т.5, №2, стр.7-9). Недостатком метода является его инвазивность, а именно забор биоптата патологически измененной ткани.

Задача изобретения - неинвазивный способ диагностики эстроген- и прогестеронозависимости патологического процесса гениталий.

Поставленная задача решается способом диагностики эстроген- и прогестеронзависимой патологии гениталий, заключающимся в том, что определяют количество рецепторов эстрадиола и прогестерона в мононуклеарной фракции клеток периферической крови и при увеличении более 210 и 2050 рецепторов на клетку соответственно диагностируют эстроген- или прогестеронзависимую патологию.

Заявляемое изобретение не очевидно для специалистов, работающих в области эндокринологической гинекологии.

Методика. Мононуклеарные клетки периферической крови выделяют стандартным методом [Boyum A. Separation of leukocytes from blood and bone marrow // Scand. J. Clin. Lab. Investig. - 1968. - Vol.21 - Suppl. 97. p.1-9] из гепаринизированной крови (7-10 ME гепарина/мл) с модификациями. Кровь разводят физиологическим раствором (рН 7,2) в соотношении 1:2. Разведенную физиологическим раствором кровь (5 мл) наслаивают на подогретый до комнатной температуры фиколл (Pharmacia Fine Chemicals, Швеция, плотность 1, 077 г/мл, 3 мл в центрифужной пробирке) и центрифугируют при 400g в течение 30 мин, 4°С [Хейфиц Л.Б., Абалкин В.А. Разделение форменных элементов крови человека //Ж. Лаб. дело, 1973. - 10. - с.579-581]. Интерфазу отбирают стерильной стеклянной пипеткой и полученную мононуклеарную фракцию трижды отмывают бесцветным раствором Хенкса (клетки ресуспендируют в десятикратном объеме раствора Хенкса и центрифугируют 5 минут при 250 g). Последний осадок поднимают в 1 мл среды и подсчитывают в камере Горяева. После подсчета разводят средой до концентрации клеток 500 млн/100 мкл. Жизнеспособность клеток, определяемая по методу окрашивания с трипановым синим (Ланг Н.Р. Стимуляция лимфоцитов // М.: Медицина, 1976. - 288 с.), составила 96%.

Методика определения рецепторов прогестерона и эстрадиола в мононуклеарных клетках крови основана на известном методе определения указанных рецепторов в фракции плазматических мембран миоутероцитов [Бассалык. Рецепторы стероидных гормонов в опухолях человека. М., Медицина, 1987, стр.198-202]. Временные и концентрационные параметры насыщения связывания метки подобраны экспериментально. Для количественного определения рецепторов прогестерона и эстрадиола в мононуклеарных клетках готовят стерильный пластиковый планшет (96 круглодонных лунок): во все рабочие лунки вносят по 10 мкл спиртового раствора ³H-прогестерона или ³H-эстрадиола («Amersham» GB) из расчета получения в инкубационной среде конечных концентраций 20 и 5 нМ соответственно. С целью ингибирования специфического связывания стероидов используют двухсоткратный избыток немеченого прогестерона и диэтилстильбэстрола соотвественно («Merck», Германия), которые в спиртовом растворе вносят в лунки по стандартной схеме. 200-кратный избыток дексаметазона («Merck», Германия) добавляют в рабочие лунки с целью подавления перекрестного связывания глюкокортикоидов с рецепторами прогестерона. После внесения в лунки спиртовых растворов указанных стероидов спирт выпаривают в токе азота. За 30 минут до инкубации в лунки вносят по 50 мкл среды Хенкса. Во все подготовленные лунки планшета вносят по 50 мкл суспензии мононуклеарных клеток (500 млн клеток/100 мкл) и инкубируют 60 минут - для рецепторов прогестерона, 30 минут - для определения рецепторов эстрадиола при комнатной температуре. Для отделения несвязанной метки ресуспендированные клетки фильтруют через стеклянные фильтры (Whatman Glass Micro Fiber Filter GF/B - 25 mm dia.), которые отмывают 100-кратным избытком ледяного Хенкса и помещают в сцинтилляционные флаконы. После выпаривания фильтры заливают 5 мл сцинтилляционной жидкости и через 60 минут радиометрируют. Все исследования проводят в триплетах.

Подсчет специфического связывания производят по формуле:

[(T-NSB)·k/n]·N,

где Т - общее связывание, NSB - неспецифическое связывание, n -количество клеток в лунке, k - коэффициент пересчета cpm в фемтомоли ³H-стероида, N - число Авагадро.

Нижеследующие примеры иллюстрируют способ по изобретению.

Пример 1. Больная Б., 42 лет направлена в НКО МОНИИАГ 11.03.04 г. с диагнозом: рецидивирующая гиперплазия и полип эндометрия для определения дальнейшей тактики лечения. Гиперполименорея. В анамнезе 2 раздельных диагностических выскабливания (РДВ) в 05.03 г. и в 10.03 г. Данные гистологического заключения: железистая гиперплазия эндометрия и железисто-фиброзный полип эндометрия. Диагноз рецидивирующей гиперплазии эндометрия был подтвержден на основании клинических данных и результатов УЗИ на 7 день цикла: М-эхо 12 мм и в дне матки полип диаметром 10 мм. 13.04.04 г. произведена гистероскопия и РДВ. Эндометрий поздней стадии секреции с элементами базальной и микрожелезистой гиперплазии. Фрагменты фиброзно-железистого полипа эндометрия. Параметры рецепции женских половых стероидов в мононуклеарной фракции клеток периферической крови и биоптате эндометрия были проведены параллельно, при этом кровь забирали из локтевой вены у пациентки непосредственно перед выскабливанием.

При определении количества рецепторов эстрадиола и прогестерона в мононуклеарных клетках периферической крови получили следующие величины: для эстрадиола - 875 рец/клетке и для прогестерона - 2541 рец/клетке, что позволило нам диагностировать эстроген- и прогестеронзависимость патологического процесса. В биоптате эндометрия, полученном в ходе диагностического выскабливания, уровень цитозольных рецепторов эстрадиола и прогестерона составил 24,1 и 25,9 фмоль/мг белка цитозоля соответственно. Таким образом, результаты исследования рецепторного профиля и биоптата эндометрия подтвердили полученные нами, в ходе исследования МНК, данные о гормональной зависимости гиперплазии эндометрия у данной пациентки.

На основании приведенных данных была назначена и проведена противорецидивная гормональная терапия дюфастоном 20 мг/сутки с 5 по 25 день цикла 6 месяцев с положительным эффектом. В течение проводимой терапии и через 12 месяцев после ее окончания рецидива не было.

Пример 2. Пациентка К., 48 лет, обратилась в отделение гинекологической эндокринологии с жалобами на гиперполименорею и неоднократные дисфункциональные маточные кровотечения в течение 3-х лет. В анамнезе по поводу меноррагий по месту жительства произведено 2 РДВ. Гистологическое заключение: железистая гиперплазия с явлениями хронического эндометрита. По месту жительства получала гормональную терапию норколут и примолютнор в дозе 10 мг с 5 по 25 день цикла - без эффекта. За год до нашего исследования получала дюфастон 20 мг в сутки с 16 по 25 день цикла - без эффекта после отмены лечения повторные меноррагии, в связи с чем была направлена в МОНИИАГ. При УЗИ: толщина эндометрия (М-эхо) была 13 мм. В левом яичнике определена ретенционная киста диаметром 3,9 см. Заключение: гиперплазия эндометрия, аденомиоз, миома матки небольших размеров. Пациентке произведено раздельное диагностическое выскабливание под контролем гистероскопии. Гистологическое заключение: простая железистая гиперплазия эндометрия с признаками хронического воспаления. Проведены исследования: рецепторного профиля мононуклеарной фракции периферической крови и биоптатов эндометрия методами, описанными в примере 1. Результаты: рецепторы эстрадиола и прогестерона - 160 и 0 рец/клетке в МНК соотвественно; 7,6 и 0 фмоль/мг белка цитозоля биоптата эндометрия соответственно. Следовательно, патологический процесс в эндометрии не является гормонзависимым. Больной предложен и проведен альтернативный метод лечения - пангистерэктомия.

Нами показано, что параметры рецепторного профиля эстрадиола-17β и прогестерона в мононуклеарной фракции клеток (МНК) периферической крови соответствуют (тесно и положительно коррелируют r=0,77 и 0,9 соответственно) с аналогичными параметрами эндометрия пациенток с гиперплазиями (табл.1).

Таблица 1
Уровень рецепторов эстрадиола и прогестерона в мононуклеарных клетках (МНК) периферической крови и цитозоле эндометрия пациенток с гиперплазиями эндометрия.
	Рецепторы эстрадиола 17β	Рецепторы прогестерона
МНК (рецептор/клетка)	Цитозоль (фемтомоль/мг белка)	МНК (рецептор/клетка)	Цитозоль (фемтомоль/мг белка)
Норма	482	15,75	1418	12,9
Железистый полип	1187	158,0	4802	48,2
Простая железистая гиперплазия	728	19,1	2866	27,3
Приведены средние данные исследованных параметров.

Учитывая тесную положительную корреляцию между уровнем рецепторов половых стероидов в МНК и цитозоле биоптата эндометрия пациенток с гиперплазиями, считаем правомерным использование параметров рецепции эстрадиола и прогестерона в мононуклеарной фракции клеток периферической крови для оценки гормональной зависимости патологического процесса в эндометрии.

Сравнительный анализ уровня рецепторов половых стероидов в МНК и цитозоле эндометрия при гиперплазии показал, что пороговыми значениями гормональной зависимости можно считать количество рецепторов эстрадиола и прогестерона в МНК 210 и 2050 рец/кл (что соответствует ≈10 фмоль рецепторов эстрадиола и прогестерона в цитозоле эндометрия соответственно).

При проведении диагностики эстроген- и прогестеронзависимой патологии у 59 больных была подтверждена его возможность использования для целей диагностики и его высокая точность.

Способ диагностики эстроген- и прогестеронзависимой патологии гениталий путем исследования содержания рецепторов эстрадиола и прогестерона в биологическом материале, отличающийся тем, что определяют содержание рецепторов в мононуклеарной фракции клеток периферической крови и при величине более 210 и 2050 рецепторов на клетку соответственно диагностируют эстроген- и прогестеронзависимую патологию гениталий.