Композиция для профилактики или лечения аллергического заболевания с использованием экстракта черного риса и ее терапевтическое применение

Композиция для профилактики или лечения аллергического заболевания с использованием экстракта черного риса и ее терапевтическое применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к композиции для профилактики или лечения аллергических заболеваний с использованием экстракта черного риса и к ее терапевтическому применению. Точнее, настоящее изобретение относится к композиции для профилактики или лечения аллергических заболеваний, содержащей пеларгонидин, цианидин гликозид или экстракт черного риса, содержащий пеларгонидин и цианидин гликозид, в качестве эффективного ингредиента и к ее терапевтическому применению.

Уровень техники

В целом известно, что аллергическое заболевание вызывается аллергическим воспалением в дыхательных путях или тканях, таких как бронхи, и тому подобное. В частности, аллергическое заболевание развивается следующим образом: аллергены (антигены), такие как пыль, пыльца растений, грибы, различные пищевые продукты и лекарственные средства, и тому подобное, поступают внутрь организма через органы дыхания, органы пищеварения или кожу, а затем объединяются с IgE антителами, прикрепленными на поверхности тучных клеток в тканях. Затем тучные клетки секретируют гистамин. Гистамин, наиболее важный химический медиатор, вызывающий аллергическую реакцию в слизистой носоглотки, вызывает отек слизистой носоглотки посредством увеличения проницаемости сосудов и вызывает первичные аллергические реакции, такие как слезы, насморк и прурит, и тому подобное, посредством стимулирования окончаний сенсорных нервов. В дополнение к гистамину химические медиаторы с хемотаксисом, такие как эозинофильный хемотаксический фактор и лейкотриен, секретируются из тучных клеток в тканях. Эозинофилы перемещаются в область развития аллергии (хемотаксис) посредством хемотаксического фактора, вызывая поздние аллергические реакции, такие как повреждение тканей, воспалительная реакция и гиперчувствительность, и тому подобное.

Астма, аллергический ринит и атопический дерматит являются примерами аллергических заболеваний, которые становятся более частыми по мере увеличения загрязнения воздуха сажей и т.п. К настоящему времени никакого эффективного терапевтического агента для удовлетворительного лечения аллергических заболеваний не разработано. После прекращения лечения симптомы возвращаются через несколько дней или недель, требуя улучшений безопасности и эффективности обычных агентов для лечения.

В настоящее время главными терапевтическими агентами для лечения аллергических заболеваний являются кортикостероиды, просто облегчающие симптомы, что не только далеко от фундаментального лечения заболевания посредством устранения причины, но также вызывает серьезные побочные эффекты (Rabe KF, et. al., Eur Respir J Suppl., 34:34s-40s, 2001). Большинство обычных терапевтических агентов для лечения аллергических заболеваний имеют лишь функцию ингибирования гистамина, так что они не могут ингибировать поздние реакции под действием аккумулирования эозинофилов в тканях, которые представляют собой главную причину для воспаления, приводя к возникновению хронических аллергических симптомов. По этой причине, является срочной и важной необходимость в разработке нового противоаллергического лекарственного средства, преодолевающего проблемы обычных терапевтических агентов для лечения аллергических заболеваний.

Черный рис (Oryza sativa L.) - рис, содержащий много антоцианинов, представляет собой здоровый пищевой продукт, содержащий кальций, витамины, ниацин и тому подобное в количествах, гораздо больших, чем белый рис. Известно, что черный рис улучшает регуляторную гомеостатическую функцию организма человека и улучшает иммунную функцию. Кроме того, известно, что черный рис обладает профилактическим, антиоксидантным, противораковым воздействием и, в особенности, понижает уровень холестерина.

Антоцианины представляют собой пигментные гликозиды, находящиеся в красных частях цветов или кожуре фруктов. Антоцианины представляют собой соединения, в которых конкретная гидроксильная группа глюкозы является связанной с функциональной группой спирта, фенола, альдегида и тому подобное посредством эфирной связи. В настоящее время обнаружены более 200 антоцианинов, включая дельфинидин, цианидин, пеларгонидин, пеонидин и мальфидин. Антоцианины участвуют в противовоспалительном действии, противомикробной активности и в понижении уровня холестерина и, в частности, имеют антиоксидантную активность, в 5-7 большую, чем у токоферола, природного антиоксиданта (Tedesco I, et. al., J. Nutr. Biochem., (9):505-511, 2001; Youdim KA, et. al., Biochim. Biophys. Acta. 1523 (1):117-122, 2000). Однако конкретное воздействие каждого соединения из антоцианинов еще не объяснено.

Подробное описание изобретения

Авторы настоящего изобретения осуществили исследования с целью разработки терапевтического агента для эффективного лечения аллергических заболеваний посредством ингибирования воспаления, вызываемого эозинофилами, которое представляет собой одну из поздних реакций аллергических заболеваний. В результате, они подтвердили, что экстракт черного риса, среди многих других лекарственных средств китайской народной медицины и природных веществ, может эффективно ингибировать астму, одно из наиболее широко распространенных аллергических заболеваний. Кроме того, авторы настоящего изобретения завершили настоящее изобретение подтверждением того, что антоцианины, включенные в экстракт черного риса, в частности, пеларгонидин и цианидин гликозид, ингибируют аккумуляцию эозинофилов и воспаление в тканях и, тем самым, могут излечивать аллергические заболевания, включая астму.

Целью настоящего изобретения является создание способа профилактики или лечения аллергических заболеваний с использованием экстракта черного риса.

Целью настоящего изобретения также является осуществление нового терапевтического применения экстракта черного риса.

Кроме того, целью настоящего изобретения является создание способа профилактики или лечения аллергических заболеваний с использованием пеларгонидина или цианидин гликозида.

Другой целью настоящего изобретения является создание способа ингибирования аккумуляции эозинофилов в клетках, тканях или организме с использованием пеларгонидина или цианидин гликозида.

Также объектом настоящего изобретения является новое терапевтическое применение пеларгонидина или цианидин гликозида.

Кроме того, целью настоящего изобретения является создание композиции для профилактики или лечения аллергических заболеваний, содержащей один или несколько агентов, выбранных из группы, состоящей из экстракта черного риса, пеларгонидина и цианидин гликозида.

Для достижения указанных выше целей настоящее изобретение относится к способу профилактики или лечения аллергических заболеваний, включающему в себя введение эффективного количества экстракта черного риса, пеларгонидина или цианидин гликозида индивидууму, нуждающемуся в этом.

Для достижения другой цели настоящего изобретения настоящее изобретение относится к способу ингибирования аккумуляции эозинофилов в клетках, в тканях или в организме, включающему в себя введение пеларгонидина или цианидин гликозида индивидууму, нуждающемуся в этом.

Для достижения другой цели настоящего изобретения настоящее изобретение относится к применению экстракта черного риса, пеларгонидина или цианидин гликозида для получения терапевтического агента для профилактики или лечения аллергических заболеваний.

Кроме того, для достижения другой цели настоящего изобретения настоящее изобретение относится к применению пеларгонидина или цианидин гликозида для получения терапевтического агента для ингибирования аккумуляции эозинофилов.

Настоящее изобретение будет описано ниже.

Настоящее изобретение относится к композиции для профилактики или лечения аллергических заболеваний, содержащей экстракт черного риса.

Настоящее изобретение также относится к композиции для профилактики или лечения аллергических заболеваний, содержащей пеларгонидин (3,5,7-тригидрокси-2-(4-гидроксифенил)-1-бензопирилий хлорид), представленный формулой 1, его фармацевтически приемлемые соли или гликозиды, в качестве эффективного ингредиента.

<Формула 1>

Настоящее изобретение также относится к композиции для профилактики или лечения аллергических заболеваний, содержащей цианидин гликозид (цианидин 3-O-β-глюкопиранозид), представленный формулой 2, или его фармацевтически приемлемые соли, в качестве эффективного ингредиента.

<Формула 2>

Настоящее изобретение также относится к композиции для профилактики или лечения аллергических заболеваний, содержащей один или несколько агентов, выбранных из группы, состоящей из экстракта черного риса, пеларгонидина или цианидин гликозида в качестве эффективного ингредиента.

Экстракт черного риса по настоящему изобретению включает в себя пеларгонидин (3,5,7-тригидрокси-2-(4-гидроксифенил)-1-бензопирилий хлорид), представленный формулой 1, или цианидин гликозид (цианидин 3-O-β-глюкопиранозид), представленный формулой 2.

Черный рис (Oryza sativa L.) в настоящем изобретении представляет собой рис черного цвета, содержит много антоцианинов и является легко коммерчески доступным.

Экстракт черного риса, включенный в композицию для профилактики или лечения аллергических заболеваний по настоящему изобретению, может быть получен из Oryza sativa L. с помощью соответствующих обычных способов экстракции, хорошо известных в настоящей области. Способы экстракции включают в себя, без ограничения, экстракцию спиртом, водную экстракцию, экстракцию органическим растворителем и экстракцию сверхкритической жидкостью, и тому подобное. Предпочтительно, могут использоваться вода и органические растворители, такие как C_1-4 низшие спирты, ацетон, метилацетат, этилацетат, глицерин, пропиленгликоль, 1,3-бутиленгликоль, н-гексан, простой диэтиловый эфир, бензол и метиленхлорид, или их смесь. Черный рис диспергируют, к нему добавляют один из указанных выше растворителей. Осадки удаляют посредством фильтрования. Отфильтрованный раствор концентрируют с использованием вакуумного испарителя и при перемешивании. Растворитель удаляют, и концентрированный раствор сушат вымораживанием, делая его мелкодисперсным.

Предпочтительная температура экстракции равна 15-80°C, а более предпочтительно, 25-60°C. Время экстракции зависит от температуры экстракции, но, как правило, составляет 5-24 час, а предпочтительно, 7-12 часов. Если для экстракции используют шейкер, эффективность экстракции может увеличиться.

В одном из вариантов осуществления по настоящему изобретению к черному рису добавляют этанол, что приводит к экстракции при 35°C в течение 7 часов. Затем экстрагированный раствор выпаривают досуха, что приводит к получению порошкообразного экстракта черного риса (смотри пример 1).

Пеларгонидин, представленный формулой 1, включенный в композицию для профилактики или лечения аллергических заболеваний по настоящему изобретению, как предполагается, обладает сильной антиоксидантной активностью, хотя конкретный механизм его действия еще не объяснен. В частности, пеларгонидин является менее токсичным, но легче поглощается, что делает его блестящим терапевтическим агентом, пригодным для введения людям (Ross JA, et. al., Annu Rev Nutr., 2002; 22:19-34. Review). Несмотря на это, к настоящему времени не известно никаких других применений, кроме как в качестве антиоксидантного агента.

Цианидин гликозид (цианидин 3-O-β-глюкопиранозид), представленный формулой 2, включенный в композицию для профилактики или лечения аллергических заболеваний по настоящему изобретению, представляет собой природное вещество, принадлежащее к антоцианинам, и, как сообщается, обладает сильной антиоксидантной активностью.

Пеларгонидин, представленный формулой 1, цианидин гликозид, представленный формулой 2, которые включаются в композицию для профилактики или лечения аллергических заболеваний по настоящему изобретению, могут либо быть куплены, либо быть получены с помощью обычного способа синтеза (Nakajima N. et al. Biosci. Biotechnol. Biochem., 61(11): 1926-1928, 1997, Amorini AM, et al. Free Radic. Res., 35 (6): 953-966). Предпочтительно, они могут выделяться и очищаться из природных веществ. Более предпочтительным является выделение их из черного риса. Пеларгонидин или цианидин гликозид могут выделяться и очищаться из черного риса посредством обычного способа, хорошо известного в настоящей области. В частности, эффективные ингредиенты черного риса могут экстрагироваться с использованием воды или органических растворителей. Затем осуществляют хроматографию для разделения и очистки ингредиентов, тем самым получая чистые целевые соединения.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения астму вызывают у мышей посредством сенсибилизации овальбумином, при этом исследуют ингибирование воспаления, общего симптома аллергического заболевания, с помощью экстракта черного риса. В результате экстракт черного риса по настоящему изобретению заметно ингибирует воспаление в легких мышей при астме, индуцированной овальбумином (смотри фиг.1).

В другом варианте осуществления по настоящему изобретению исследовали, какие антоцианины, главные компоненты экстракта черного риса, могли бы ингибировать воспаление и аккумуляцию эозинофилов в тканях, общие симптомы аллергических заболеваний. Главные антоцианины, такие как пеларгонидин, дельфинидин, пеонидин и цианидин гликозид вводятся мышам с астмой, индуцированной овальбумином. В результате, подтверждено, что пеларгонидин и цианидин гликозид заметным образом ингибируют аккумуляцию эозинофилов, клеток, индуцирующих воспаление в дыхательных путях и воспаление в легких (смотри фиг.2 - фиг.4, таблицу 1). Дельфинидин, среди многих антоцианинов, не обладает воздействиями. Пеонидин демонстрирует небольшое воздействие. Но подтверждается, что пеларгонидин и цианидин гликозид ингибируют аккумуляцию эозинофилов в дыхательных путях и воспаление в легких, что говорит о том, что пеларгонидин и цианидин гликозид могут эффективно использоваться в качестве композиции для профилактики или лечения аллергических заболеваний. По этой причине композиция, содержащая экстракт черного риса, пеларгонидин или цианидин гликозид по настоящему изобретению может эффективно использоваться для профилактики или лечения аллергического заболевания, выбранного из группы, состоящей из бронхиальной астмы, хронического обструктивного заболевания легких, сенной лихорадки, вазомоторного ринита, гипертрофического ринита, аллергического бронхита, преходящей легочной инфильтрации, аллергического гастрита, аллергической диареи, аллергического стоматита, кишечной пурпуры, узелкового периартериита, окклюзивного эндартериита, стенокардии, эндокардита, крапивницы, ангионевротического отека, узловатой эритемы, пурпуры, атопического дерматита, фликтены, симпатической офтальмии, аллергического конъюнктивита и аллергического кератита у млекопитающих, в частности, у людей.

Эффективное количество в настоящем изобретении означает количество соединения или экстракта, демонстрирующее профилактическое или лечебное воздействие, когда оно вводится пациенту. Как правило, экстракт черного риса может вводиться в количестве 1-100 мг/кг в день, а предпочтительно, 10-30 мг/кг в день. Пеларгонидин, представленный формулой 1, вводится в количестве 0,1-10 мг/кг в день, а предпочтительно, 0,5-2 мг/кг в день. Цианидин гликозид, представленный формулой 2, может вводиться в количестве 1-30 мг/кг в день, а предпочтительно, 5-20 мг/кг в день. Соединения и экстракты могут вводиться либо один, либо несколько раз в день, в пределах возможного эффективного количества. Величина введенного количества экстракта черного риса, пеларгонидина или цианидин гликозида может изменяться в зависимости от способа введения, возраста, пола, массы тела пациента, степени заболевания и других индивидуальных отличий пациента. Композиция, содержащая экстракт черного риса, пеларгонидин или цианидин гликозид по настоящему изобретению, не ограничивается формой дозировки, способом или режимом введения при условии, что она сохраняет воздействия по настоящему изобретению.

Индивидуум здесь означает млекопитающих, включая человека. Индивидуум включает в себя пациента, нуждающегося в лечении.

Композиция по настоящему изобретению может получаться и вводиться во многих формах и посредством различных способов. Например, является возможным любое из перорального, ректального, местного, внутрибрюшинного, интраокулярного, интрапульмонарного и интраназального введения. И композиция может приготавливаться в виде различных стандартных дозированных форм, такие как таблетка, драже, дисперсия, суспензия, жидкий препарат, капсула, крем, мазь и аэрозоль.

Композиция по настоящему изобретению, содержащая пеларгонидин, включает в себя пеларгонидин и его фармацевтически приемлемые соли или его гликозиды в качестве активного ингредиента и может дополнительно содержать фармацевтически приемлемые носители и другие терапевтические компоненты. Композиция по настоящему изобретению, содержащая цианидин гликозид, содержит цианидин гликозид и его фармацевтически приемлемые соли и дополнительно может содержать фармацевтически приемлемые носители и другие терапевтические компоненты. Фармацевтически приемлемая соль здесь означает соль, полученную из фармацевтически приемлемого нетоксичного основания или кислоты (включаются неорганическое основание или неорганическая кислота и органическое основание или органическая кислота).

Композиции для перорального, ректального, местного, гиподермического, парентерального, включая внутримышечное и внутривенное, интраокулярного, интрапульмонарного (назальная ингаляция или пероральная ингаляция) или интраназального введения являются пригодными в рамках настоящего изобретения и наиболее пригодный для использования способ введения выбирается из указанных выше в соответствии с характеристиками и тяжестью заболевания и характеристиками активных ингредиентов. Композиция может быть приготовлена в виде стандартной дозированной формы согласно общему способу приготовления, хорошо известному в области фармацевтики.

Что касается ингаляции, соединения или экстракт по настоящему изобретению переносятся в виде спрея аэрозоля с использованием упаковки под давлением или распылителя. Соединения или экстракт по настоящему изобретению могут также переноситься как порошкообразная форма, которая может ингалироваться через устройство для ингаляции порошка с аэрированием. Предпочтительная система переноса для ингаляции представляет собой аэрозоль с отмериваемой дозировкой ингаляции (MDI), который может приготавливаться в форме раствора или суспензии посредством смешивания одного из пропеллентов, такого как фторуглерод или углеводород, с экстрактом черного риса или соединениями формулы 1 и формулы 2.

Трансдермальный препарат, аэрозоль, крем, мазь, лосьон и спрей представляют собой хорошие примеры препарата для местного введения из экстракта черного риса, пеларгонидина или цианидин гликозида.

В качестве активного ингредиента, экстракт черного риса, пеларгонидин или цианидин гликозид могут смешиваться с фармацевтически приемлемыми носителями посредством общей фармацевтической технологии для практического введения. Носитель может варьировать в зависимости от способа введения (например, пероральное или парентеральное введение, включая внутривенное введение). Для приготовления жидких препаратов для перорального введения, таких как суспензии, эликсиры и растворы, могут использоваться общие фармацевтические наполнители, такие как вода, гликоль, масло, спирт, ароматизирующие агенты, антисептики и окрашивающие агенты. Твердые препараты для перорального введения включают в себя порошки, капсулы и таблетки. Эти твердые препараты приготавливают посредством смешивания одного или нескольких пригодных для использования наполнителей, таких как крахмал, глюкоза, микрокристаллическая целлюлоза, разбавителей, гранулирующих агентов, смазывающих материалов, связывающих агентов и разрыхляющих агентов, и тому подобное. Твердые препараты являются предпочтительными по сравнению с жидкими препаратами для перорального введения. Таблетки и капсулы представляют собой наиболее удобные формы для перорального введения, для которых используются твердые фармацевтические носители. Если это требуется, на таблетки может наноситься покрытие в соответствии со стандартной водной технологией или неводной технологией. Носители для парентерального введения включают в себя воду, соответствующее масло, солевой раствор, водорастворимую глюкозу или гликоль и тому подобное. И стабилизаторы, и консерванты могут включаться дополнительно. Антиоксиданты, такие как бисульфит натрия, сульфит натрия и аскорбиновая кислота, являются пригодными в качестве стабилизаторов. Бензалконий хлорид, метил- или пропилпарабен и хлорбутанол представляют собой примеры консервантов. Другие фармацевтически приемлемые носители, перечисленные в следующих документах, также являются доступными (Remington's Pharmaceutical Sciences, 19 th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).

Указанный выше экстракт черного риса, пеларгонидин или цианидин гликозид могут быть получены в форме композиции пищевого продукта для профилактики и лечения аллергических заболеваний. Композиция пищевого продукта по настоящему изобретению включает в себя все возможные типы, такие как функциональный пищевой продукт, пищевые добавки, здоровый пищевой продукт и пищевые добавки, и тому подобное. Такая композиция пищевого продукта может быть получена в различных формах, в соответствии с обычными способами, хорошо известными в данной области. Например, в качестве здорового продукта, экстракт по настоящему изобретению, сам по себе, может приниматься либо в форме чая, сока или напитка, либо в форме гранулы, капсулы и порошка.

Для производства функционального пищевого продукта экстракт или соединения по настоящему изобретению могут добавляться к напиткам (включая алкогольные напитки), фруктам и пищевым продуктам, полученным путем их переработки (например, консервированным фруктам в жестяных банках, пищевому продукту в стеклянной таре, джему, мармеладу, и т.п.), рыбе, мясу и пищевым продуктам, полученным путем их переработки (например, ветчине, сосискам, говяжьей солонине, и т.п.), хлебу и лапше (пшеничной лапше, гречневой лапше, лапше ramyun, спагетти, макаронам, и т.п.), фруктовым сокам, различным напиткам, печенью, пшеничной клейковине, молочным продуктам (например, маслу, сыру, и т.п.), растительному маслу, маргарину, растительному белку, пищевому продукту в герметичной упаковке, замороженному пищевому продукту и различным приправам (например, соевой пасте, соевому соусу, соусу, и т.п.) и так далее.

Для использования в качестве пищевой добавки экстракт или соединения по настоящему изобретению предпочтительно приготавливают в форме порошка или концентрата.

Предпочтительное содержание экстракта или соединения по настоящему изобретению в композиции пищевого продукта по настоящему изобретения составляет 1-90 мас.% от общей массы композиции. 10-50 мас.% являются более предпочтительными. Как объясняется выше, экстракт черного риса, пеларгонидин или цианидин гликозид ингибирует аккумуляцию эозинофилов, клеток, индуцирующих воспаление и воспаление в тканях, так что композиция здорового пищевого продукта, содержащего указанные выше агенты, может эффективно использоваться в качестве добавки для профилактики или лечения аллергических заболеваний.

Настоящее изобретение также относится к терапевтическому применению экстракта черного риса, пеларгонидина или цианидин гликозида. В частности, настоящее изобретение относится к применению пеларгонидина или цианидин гликозида для получения терапевтического агента для ингибирования аккумуляции эозинофилов в клетках, тканях или у индивидуума, нуждающегося в этом. Терапевтический агент может дополнительно содержать фармацевтически приемлемые носители в дополнение пеларгонидину или цианидин гликозиду. Примеры фармацевтически приемлемых носителей приведены выше.

Настоящее изобретение также относится к применению экстракта черного риса, пеларгонидина или цианидин гликозида для приготовления терапевтического агента для профилактики и лечения аллергических заболеваний. Примеры аллергических заболеваний приведены выше.

Краткое описание чертежей

Фиг.1 представляет себе набор микрофотографий, показывающих ингибирование воспаления в легких мышей, после лечения экстрактом черного риса мышей с астмой, индуцированной овальбумином.

A: Мыши дикого типа,

B: Мыши с астмой, индуцированной овальбумином,

C: Мыши, которых лечат экстрактом черного риса (10 мг/кг).

Фиг.2 представляет собой график, показывающий каждую из долей ингибирования аккумуляция эозинофилов в дыхательных путях мышей, после лечения антоцианинами мышей с астмой, индуцированной овальбумином.

1: Мыши дикого типа,

2: Мыши с астмой, индуцированной овальбумином,

3: Мыши, которых лечат пеларгонидином (0,5 мг/кг),

4: Мыши, которых лечат пеларгонидином (1,25 мг/кг),

5: Мыши, которых лечат пеонидином (0,5 мг/кг),

6: Мыши, которых лечат пеонидином (1,25 мг/кг),

7: Мыши, которых лечат дельфинидином (0,5 мг/кг),

8: Мыши, которых лечат дельфинидином (1,25 мг/кг).

Фиг.3 представляет собой набор микрофотографий, показывающих ингибирование воспаления в легких мышей после лечения пеларгонидином мышей с астмой, индуцированной овальбумином.

A: Мыши дикого типа,

B: Мыши с астмой, индуцированной овальбумином,

C: Мыши, которых лечат пеларгонидином (1,25 мг/кг),

D: Мыши, которых лечат дельфинидином (1,25 мг/кг).

Фиг.4 представляет собой набор микрофотографий показывающих ингибирование воспаления в легких мышей, после лечения цианидин гликозидом мышей с астмой, индуцированной овальбумином.

A: Мыши дикого типа,

B: Мыши с астмой, индуцированной овальбумином,

C: Мыши, которых лечат цианидин гликозидом (1,5 мг/кг),

D: Мыши, которых лечат цианидин гликозидом (4,5 мг/кг).

ПРИМЕРЫ

Настоящее изобретение будет описываться посредством следующих далее примеров более подробно. Однако примеры, приведенные ниже, приводятся только для иллюстрации настоящего изобретения; рамки настоящего изобретения не должны рассматриваться как ограниченные ими.

<Пример 1> Приготовление экстракта черного риса

Черный рис (домашнее производство, рынок Kyungdong, Seoul, Korea) диспергируют, к нему добавляют 100% этанол с последующей экстракцией при 35°C в течение 7 часов. Полученный экстракт выпаривают и остаток сушат замораживанием, что приводит к получению экстракта черного риса порошкообразного типа.

<Пример 2> Исследование воздействия экстракта черного риса по ингибированию астмы

В этом примере осуществляют эксперименты по исследованию того, может ли экстракт черного риса ингибировать аллергическую астму посредством ингибирования воспаления у мышей с астмой, индуцированной овальбумином.

Сначала для получения животных моделей астмы осуществляют инъекцию 200 мкл раствора овальбумина (200 мкг овальбумина и 1000 мкг алюмогеля растворяют в физиологическом растворе) в каждую абдоминальную полость двенадцати самок мышей в возрасте 10 недель (C57BL/6, Damul Science, Daejeon, Korea). Через две недели 200 мкл раствора овальбумина (2 мас.%/объем) распыляют над каждой мышью для ее сенсибилизации. 200 мкл 1% раствора овальбумина опять распыляют на 21-й, 22-й и 23-й день и 10% раствора овальбумина распыляют опять на 25-й день для сенсибилизации.

Указанные выше мыши с астмой, индуцированной посредством сенсибилизации 10% овальбумином, разделяются на две группы; одну используют в качестве группы отрицательного контроля, которую ничем не лечат, а другую лечат 10 мг/кг экстракта черного риса. Экстракт черного риса вводится посредством внутрибрюшинной инъекции и инъекцию осуществляют дважды, на 24-й и на 25-й день после обработки овальбумином.

Через 48 часов после лечения экстрактом черного риса, мышей умерщвляют с использованием эфира. Исследуют воспаление в легких каждой мыши. В результате, как показано на фиг.1, воспаление в бронхах мышей с астмой, индуцированной овальбумином, антигеном, индуцирующим астму, сильно возрастает (см. фиг.1B) по сравнению с нормальными мышами дикого типа (см. фиг.1A). Однако воспаление в бронхах заметно уменьшается посредством введения экстракта черного риса (см. фиг.1C). Следовательно, подтверждается, что экстракт черного риса мог бы эффективно ингибировать астму.

<Пример 3> Воздействие пеларгонидина, содержащегося в экстракте черного риса, на аккумуляцию эозинофилов в дыхательных путях

Главные компоненты экстракта черного риса, имеющие указанное выше воздействие по ингибированию астмы, представляют собой антоцианины. В настоящем примере, осуществляют эксперименты для исследования того, могут ли антоцианины, главные активные компоненты экстракта черного риса, ингибировать астму и какие конкретно антоцианины могли бы ингибировать астму.

Мыши с астмой, индуцированной таким же способом, который используется в указанном выше примере 2, разделяют на четыре группы: одну из них используют в качестве отрицательного контроля, а три другие группы используют как экспериментальные группы и лечат пеонидином, дельфинидином и пеларгонидином (0,5 мг/кг, 1,25 мг/кг), соответственно. Каждое соединение вводится посредством внутрибрюшинной инъекции, и инъекцию осуществляют дважды, на 24-й и на 25-й день после обработки овальбумином.

На второй день после лечения каждую мышь умерщвляют с использованием эфира. Затем к трахее присоединяют микротрубку. PBS (фосфатный солевой буфер, 0,8 мл) нагнетают и извлекают через микротрубку, что повторяют дважды, получая в результате бронхоальвеолярную промывную жидкость (BALF). Жидкость центрифугируют для разделения клеток в просвете дыхательных путей и различных белков, секретируемых из клеток и легких.

Выделенные клетки фиксируют на предметном стекле, с использованием цитоспина и окрашивают красящим раствором Diff-Quick. Фотографии делают с помощью цифровой камеры, закрепленной на микроскопе Carl Zeiss (модель: AXIOVERT 25-CEL). 5 случайных участков на каждый образец выбирают для счета эозинофилов, и процент эозинофилов в каждом образце показан на фиг.2.

Как показано на фиг.2, процент эозинофилов в дыхательных путях мышей, экспонированных для овальбумина, составляет 58%. В противоположность этому, аккумуляция эозинофилов в дыхательных путях является ингибированной у всех групп, которых лечили антоцианинами, такими как пеларгонидин, пеонидин и дельфинидин. В частности, в случае введения пеларгонидина по 0,5 мг/кг и 1,25 мг/кг, соответственно, процент эозинофилов в дыхательных путях уменьшался до 30% и 20% каждый. Подтверждается, что пеларгонидин мог бы более эффективно ингибировать аккумуляцию эозинофилов в дыхательных путях, чем другие антоцианины.

<Пример 4> Ингибиторное воздействие пеларгонидина на воспаление при астме

В этом примере осуществляют эксперименты по исследованию того, может ли пеларгонидин, который, как показано ранее, замечательно ингибирует аккумуляцию эозинофилов в дыхательных путях, ингибировать аллергическую астму посредством ингибирования воспаления в легких.

Мыши с астмой, индуцированной 10% овальбумином, совершенно так же, как и в приведенном выше примере 2, разделяются на три группы; группу 1 используют в качестве отрицательного контроля, который не лечат ничем, группу 2, использующуюся в качестве положительного контроля, лечат 1,25 мг/кг дельфинидина, и группу 3 лечат 1,25 мг/кг пеларгонидина. Каждое соединение вводится посредством внутрибрюшинной инъекции и инъекцию осуществляют дважды, на 24-й и на 25-й день после обработки овальбумином.

Через 48 часов после лечения каждым соединением мышей умерщвляют с использованием эфира и исследуют воспаление в легких у каждой мыши. В результате, как показано на фиг.3, воспаление в бронхах мышей заметно увеличивается под действием овальбумина (фиг.3B), антигена, индуцирующего астму, по сравнению с нормальными мышами дикого типа (фиг.3A). С другой стороны, воспаление заметно уменьшается путем введения пеларгонидина (фиг.3C). Воздействие по ингибированию воспаления у пеларгонидина является выдающимся в обеих группах, которые лечили 1,25 мг/кг пеларгонидина и лечили 0,5 мг/кг пеларгонидина (данные не показаны). В противоположность этому, воспаление в бронхах не ингибируется сильно посредством дельфинидина (1,25 мг/кг), другого антоцианина (фиг.3D).

<Пример 5> Ингибиторное воздействие цианидин гликозида, содержащегося в экстракте черного риса, на аккумуляцию эозинофилов в дыхательных путях и воспаление при астме

В этом примере исследуют воздействие цианидин гликозида, содержащегося в экстракте черного риса, на аккумуляцию эозинофилов в дыхательных путях и его способность к ингибированию астмы.

Для получения животных моделей с астмой, производят инъекцию 0,5 мл раствора овальбумина (500 мкг овальбумина и 10 мг алюмогеля растворяют в 1 мл PBS) в абдоминальные полости двенадцати самок мышей в возрасте 5 недель (Balb/c, Orient, Seoul), в первый и 10-й день эксперимента. Раствор овальбумина распыляют над каждой мышью на 21-й, 22-й и 23-й день для индуцирования астмы.

Мыши (n=15) с астмой, индуцированной овальбумином, разделяются на три группы: одну используют в качестве отрицательного контроля, который ничем не лечат, а две другие группы используют как экспериментальные группы, каждую из которых лечат цианидин гликозидом, 1,5 мг/кг и 4,5 мг/кг, соответственно. Цианидин гликозид вводиться перорально раз в день, последовательно, от 2-го дня до 23-го дня.

Через 24 часа после конечной сенсибилизации каждую мышь умерщвляют с использованием эфира и присоединяют к трахее микротрубку. 0,8 мл PBS нагнетают и извлекают через микротрубку, это повторяют дважды. Полученную бронхоальвеолярную промывную жидкость (BALF) центрифугируют для разделения клеток в просвете дыхательных путей и различных белков, секретируемых из клеток и легких.

Выделенные клетки фиксируют на предметном стекле с использованием цитоспина и окрашивают красящим раствором Diff-Quick. Фотографии делают с помощью цифровой камеры, закрепленной на микроскопе Carl Zeiss (модель: AXIOVERT 25-CEL). 5 случайных участков на каждый образец выбирают для счета эозинофилов, и процент эозинофилов в каждом образце представлен в таблице 1.

Таблица 1
	Концентрация	Количество животных	Процент эозинофилов
Группа мышей дикого типа	-	5	0,1±0,0
Группа отрицательного контроля	-	5	62,7±4,3
Группа, которую лечили цианидин гликозидом	1,5 мг/кг	5	49,5±5,8*
Группа, которую лечили цианидин гликозидом	4,5 мг/кг	5	38,2±6,2*
*: Значимое различие (p<0,05)

Как показано в таблице 1, процент эозинофилов в дыхательных путях мышей, экспонированных для овальбумина (отрицательный контроль), составляет 63%, но аккумуляция эозинофилов в дыхательных путях, как показано, ингибируется путем введения цианидин гликозида. Конкретно, когда концентрация цианидин гликозида увеличивается, процент эозинофилов в дыхательных путях уменьшается до 49% и 38%, для каждой группы, по сравнению с отрицательным контролем. Подтверждается, что аккумуляция эозинофилов в дыхательных путях эффективно ингибируется посредством цианидин гликозида. Воспаление в клетках легких умерщвленных мышей также исследуют, и результат представлен на фиг.4. Как показано на фиг.4, воспаление в бронхах мышей заметно увеличивается посредством овальбумина (фиг.4B), антигена, индуцирующего астму, по сравнению с нормальными мышами дикого типа (фиг.4A). Однако воспаление заметно уменьшается посредством введения цианидин гликозида (фиг.4C и фиг.4D).

<Пример 6> Производство композиции напитка, содержащего экстракт черного риса по настоящему изобретению

Композицию напитка приготавливают посредством смешивания вместе экстракта черного риса (25%), полученного в примере 1 выше, вит