Комбинации антител, обладающих селективностью по отношению к рецептору лиганда, индуцирующему апоптоз, ассоциированный с фактором некроза опухоли, и других терапевтических средств

Комбинации антител, обладающих селективностью по отношению к рецептору лиганда, индуцирующему апоптоз, ассоциированный с фактором некроза опухоли, и других терапевтических средств

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Приоритетная справка

В настоящей заявке заявлен приоритет в соответствии с предварительной заявкой США 60/391478, поданной 24 июня 2002 г., и предварительной заявкой США 60/346402, поданной 1 ноября 200 г., и испрашивается приоритет в соответствии с заявкой РСТ/US01/14151, поданной в мае 2001 г. и находящейся в настоящее время на рассмотрении. В РСТ/US01/14151 заявлен приоритет предварительной заявки США 60/201344, поданной 2 мая 2000 г. Заявки, которые являются приоритетными по отношению к настоящему изобретению, во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки.

Настоящее изобретение было создано при поддержке Федерального правительства, выделенные в соответствии с грантом NCI P50 СА 89019-01, выданном Национальным институтом рака, и в соответствии с грантом NIH R03-AR44982, выданном Национальным институтом по лечению артрита, заболеваний скелетных мышц и кожных болезней. Правительство имеет определенные права на данное изобретение.

Область, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к антителу, способному специфически связываться с одним типом рецептора для лиганда (далее обозначаемого "TRAIL"), индуцирующего апоптоз, ассоциированный с фактором некроза опухоли (далее обозначаемым TNF), а более конкретно к моноклональному антителу, индуцирующему апоптоз клеток in vivo и in vitro, экспрессирующих указанный один тип рецептора, и к терапии, основанной на использовании этого антитела.

Предпосылки создания изобретения

TRAIL является членом семейства белков TNF, которое также включает TNF-α и Fas-лиганд (1). Эти белки являются сильными индукторами апоптоза. В настоящее время идентифицированы пять рецепторов для TRAIL, два из которых, DR4 (TRAIL-R1) и DR5 (TRAIL-R2) (2-7), способны передавать сигналы апоптоза, тогда как три других рецептора, DcR1 (TRAIL-R3), DcR2 (TRAIL-R4) и остеопротегерин (OPG), не являются медиаторами передачи сигнала апоптоза (8-12). Все пять рецепторов для TRAIL имеют значительную гомологию в своих внеклеточных лиганд-связывающих доменах. Аналогично рецептору Fas и рецептору TNF I (далее называемому "TNFRI") внутриклеточные сегменты DR4 и DR5 содержат домен гибели и передают сигнал апоптоза по пути, в котором участвует Fas-ассоциированный белок, содержащий домен гибели (далее обозначаемый "FADD"), и каспаза 8 (6, 7). Помимо передачи сигнала апоптоза, рецепторы DR4 и DR5 могут также активировать каскад реакций с участием NF-κb (6, 7).

Было продемонстрировано, что биологические функции TRAIL включают его способность селективно индуцировать апоптоз трансформированных опухолевых клеток, при этом нормальные клетки являются относительно резистентными к TRAIL-опосредованному апоптозу (13-15). Такая селективность дает основание предполагать, что в отличие от лиганда Fas введение TRAIL ассоциируется с очень низкими уровнями токсичности, как было продемонстрировано при системном введении TRAIL животному-модели, и не приводит к значительному индуцированию токсичности (13). Таким образом, было предположено, что TRAIL является сильным индуктором апоптоза и может быть использован в качестве терапевтического средства для лечения рака и других заболеваний, ассоциированных с аномальной пролиферацией клеток. Также было предположено, что TRAIL является сильным индуктором апоптоза и может быть использован для лечения аутоиммунных и воспалительных заболеваний. Было продемонстрировано, что TRAIL-опосредованный апоптоз приводит к гибели Т-клеток, индуцируемой активацией, а поэтому действует по альтернативному механизму, отличающемуся от механизма действия лиганда Fas (16, 17). TRAIL-опосредованный апоптоз может также индуцировать апоптоз Т-клеток и других воспалительных клеток (18) и играет определенную роль в цитолитической активности NK-клеток (19-21) и в иммуномодулирующей функции дендритных клеток (22, 23). Таким образом, TRAIL-опосредованный апоптоз может также обеспечивать иммунную предпочтительность и осуществление иммунологического надзора.

Система TRAIL-рецепторов является сложной и включает, по крайней мере, два рецептора гибели, DR4 и DR5, и, по крайней мере, два неапоптотических рецептора, DcR1 и DcR2. Все эти рецепторы не только имеют высокую степень гомологии аминокислотных последовательностей, но также обладают аналогичной аффинностью связывания с TRAIL (2-12). Способность рецепторов DcR1 и DcR2 конкурировать за связывание с TRAIL без индуцирования апоптоза дает основание предполагать, что они могут действовать как рецепторы-ловушки, которые блокируют или модулируют активность лиганда TRAIL. Кроме того, сообщалось, что нетрансформированные клетки экспрессируют более высокие уровни рецепторов-ловушек, чем трансформированные клетки. Таким образом, предполагается, что дифференциальная модуляция экспрессии рецепторов гибели и рецепторов-ловушек может представлять собой ключевой регуляторный механизм, который определяет чувствительность клеток к TRAIL-опосредуемому апоптозу, но при отсутствии рецептор-специфических антител (2). Хотя были проведены интенсивные исследования экспрессии и функции DR4 и DR5, однако прогресса в этой области пока не наблюдается из-за отсутствия рецептор-специфических моноклональных антител. Пока не было представлено каких-либо данных относительно экспрессии DR5 на клеточной поверхности. Сообщалось, что для стимуляции перекрестного связывания была генерирована панель антител против рецепторов TRAIL, способных индуцировать апоптоз клеток меланомы in vitro, но только после иммобилизации этих антител, а в некоторых случаях требовалось культивирование этих клеток с актиномицином D (24). Было генерировано несколько антител против DR5 (24). Однако эти ранее генерированные моноклональные антитела против DR5 обладали низкой апопотоз-индуцирующей активностью in vitro даже в условиях перекрестного связывания. О какой-либо in vivo-активности не сообщалось. Эти антитела не были использованы для оценки экспрессии TRAIL-рецепторов на клеточной поверхности (24). Таким образом, необходимо получить моноклональное антитело, которое является селективным по отношению к каждому специфическому TRAIL-рецептору и которое не только способно связываться с рецептором клеточной поверхности, но также способно сильно индуцировать как in vivo, так и in vitro апоптоз аномальных клеток различных типов, включая опухолевые клетки, не требуя при этом перекрестного связывания или иммобилизации. Такое антитело должно служить не только потенциальным терапевтическим агентом, но также и диагностическим инструментом для функционального анализа рецептора TRAIL. Существует крайняя необходимость в продуцировании антитела, специфичного против каждого из рецепторов DR4 и DR5, индуцирующих гибель клеток.

При развитии или прогрессировании многих заболеваний часто случается, что клетки не элиминируются. При многих аутоиммунных заболеваниях и воспалительных состояниях выжившие активированные клетки атакуют нормальные ткани или клетки. Кроме того, прогрессирование онкогенеза и развитие пролиферативного паннуса ревматоидного артрита характеризуется неконтролируемой пролиферацией клеток. Таким образом, недостаточный апоптоз приводит к развитию заболевания, а использование апоптоз-индуцирующего лиганда или моноклонального антитела-агониста для усиления апоптоза рассматривается как возможная терапевтическая стратегия для элиминации таких нежелательных клеток.

Так, например, ревматоидный артрит (далее обозначаемый "РА") является распространенным аутоиммунным заболеванием человека. Современное представление о патофизиологии РА заключается в том, что аутоиммунные Т-клетки и В-клетки инициируют воспалительный ответ в суставах, который приводит к гиперпролиферации синовиоцитов. Гиперпролиферация синовиальных клеток приводит к сверхпродуцированию металлопротеиназ (далее обозначаемых "ММР"), что вызывает эрозивную деструкцию хряща и кости, которая характерна для РА (25). Таким образом, регуляция гиперпролиферации воспалительных синовиальных клеток является ключевой стадией лечения РА. Молекулярные механизмы, приводящие к гиперпролиферации синовиальных клеток, пока неизвестны. Хотя гиперпролиферативные синовиальные клетки не являются злокачественными и не трансформируются, однако многие исследования дают основание предполагать, что они имеют некоторые общие признаки с трансформированными клетками (46). Эти клетки, так называемые "трансформированные на вид синовиоциты", характеризуются плотным шероховатым эндоплазматическим ретикулумом, множеством ядер неправильной формы и изменениями в нормальной веретенообразной форме цитоскелета. Было высказано предположение, что включение онкогенов и вирусных генов может быть главной причиной появления синовиальных РА-клеток, имеющих вид трансформированных клеток (46).

По крайней мере, два аспекта РА позволяют предположить, что нарушение регуляции апоптоза может вносить свой вклад в патологический процесс и что терапевтическая стимуляция апоптоза может оказаться эффективным лечением; то есть неспособность активированных Т-клеток к элиминации позволяет предположить, что в данном случае имеет место индуцированная недостаточной активацией гибель этих Т-клеток, которая представляет собой процесс с участием Fas-опосредованного апоптоза и TRAIL-опосредованного апоптоза, а гиперпролиферативная природа синовиальных РА-клеток является стимулирующим фактором на более поздних стадиях патофизиологии РА. Действительно, было показано, что введение антитела против Fas в воспаленный сустав ингибирует развитие хронического артрита у tax-трансгенных мышей, которые служат моделью человеческого РА (26). Кроме того, локализованная трансдукция гена лиганда fas аденовирусным вектором является эффективной для предупреждения коллаген-индуцированного артрита (27). В обоих случаях наблюдается ингибирование пролиферации воспалительных синовиальных клеток путем усиления Fas-индуцированного апоптоза. Хотя лиганд Fas является сильным индуктором апоптоза в синовиальных клетках РА, применение опосредованного лигандом Fas апоптоза в качестве терапевтического средства для лечения человека ограничено его летальной токсичностью для печени. Таким образом, в отличие от апоптоза, индуцированного лигандом Fas, апоптоз, индуцированный TRAIL-рецептором, представляет собой более безопасное и более эффективное терапевтическое средство для лечения РА.

Индуцированный TRAIL-рецептором апоптоз также представляет собой более безопасное и более эффективное терапевтическое средство для лечения рака, чем апоптоз, индуцированный лигандом Fas. Известно, что TRAIL-опосредованный апоптоз специфически индуцирует апоптоз трансформированных опухолевых клеток и не оказывает негативного влияния на нормальные клетки. Было показано, что системное введение тримеризованного растворимого TRAIL не вызывает токсикоза у экспериментальных животных и даже может индуцировать регрессию имплантированных опухолей (13, 28). Возможность его применения в качестве дополнительной терапии при традиционном лечении появилась благодаря недавнему обнаружению того факта, что экспрессия DR5 и чувствительность TRAIL-опосредованного апоптоза клеток рака молочной железы усиливается при облучении, что дает основание предположить, что при противораковой терапии в комбинации с облучением эффективность TRAIL должна увеличиваться (29).

Кроме того, ген, кодирующий TRAIL-рецептор DR5, был картирован на хромосоме 8р21-22, то есть в локусе с высокой частотой мутации в некоторых раковых клетках (30). Сообщалось, что, по крайней мере, у двух видов опухолевых клеток, мелкоклеточного рака легких (31) и рака головы и шеи (32), обнаруживались мутации в гене домена гибели DR5. Таким образом, исследования рака в целях определения влияния, которое оказывает изменение эпитопа рецептора на развитие и прогрессирование рака, привели к необходимости продуцировать антитело против DR5. Кроме того, функциональность мутаций TRAIL-рецептора должна подтвердить эффективность такого клинического диагностического инструмента при его использовании в сочетании с другими биомаркерами для обнаружения рака на ранней стадии, а также в качестве прогностического фактора агрессивности опухоли.

Краткое описание изобретения

В одном из своих вариантов настоящее изобретение относится к антителу, которое распознает TRAIL-рецептор DR5 и которое индуцирует апоптоз в DR5-экспрессирующей клетке in vivo или in vitro. Кроме того, описано антитело, которое распознает DR5, но не распознает DR4, DcR1 или DcR2. Особенно подробно описано моноклональное анти-DR5 антитело, продуцированное гибридомой.

В другом своем варианте настоящее изобретение относится к антителу, которое распознает TRAIL-рецептор DR4 и которое индуцирует апоптоз в DR4-экспрессирующей клетке in vivo или in vitro. Кроме того, описано антитело, которое распознает DR4, но не распознает DR5, DcR1 или DcR2. Особенно подробно описано моноклональное анти-DR4 антитело, продуцированное гибридомой.

Способ настоящего изобретения позволяет индуцировать апопотоз клеток-мишеней или ингибировать пролиферацию клеток-мишеней посредством контактирования клетки с терапевтическим количеством антитела, способного связываться с DR5 или DR4. В некоторых вариантах этого способа может быть индуцирован апоптоз либо может быть ингибирована пролиферация клеток посредством контактирования этих клеток-мишеней с антителами против других рецепторов, ответственных за гибель клеток.

Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, которая содержит терапевтическое количество моноклонального антитела, обладающего активностью против DR5, фармацевтически приемлемый носитель и, необязательно, контейнер, включающий указанное антитело и указанный носитель. Кроме того, настоящее изобретение относится к применению антитела, распознающего DR5, или антитела, распознающего DR4, в целях получения терапевтического средства для селективного апоптоза аномальных или разрегулированных клеток.

Антитело настоящего изобретения взаимодействует с рецептором лиганда, индуцирующего апопотоз, ассоциированный с фактором некроза опухоли, то есть с таким рецептором, как DR4, DR5, DcR1, DcR2 и OPG, что приводит к индуцированию апоптоза клетки, экспрессирующей указанный рецептор. Описано антитело настоящего изобретения, способное селективно связываться с эпитопом агонистического или антагонистического рецептора лиганда фактора некроза опухоли.

Настоящее изобретение относится к лечению ассоциированного с апоптозом заболевания, рака, воспалительного заболевания или аутоиммунного заболевания способом, предусматривающим контактирование ткани-мишени, пораженной данным заболеванием, с терапевтическим количеством антитела настоящего изобретения, вводимого отдельно или в комбинации с другими апопотоз-индуцирующими антителами и/или с другими терапевтическими агентам или терапиями.

Кроме того, описан гибридный белок, который включает аминокислотную последовательность антигенного рецептора TRAIL, имеющую, по крайней мере, десять оснований, присоединенных к белку иммуноглобулина или к его фрагменту, способному вырабатывать иммунный ответ у индивидуума.

Настоящее изобретение относится к способу генотерапии, в котором клетку-мишень трансфецируют нуклеиновокислотной последовательностью рецептора TRAIL, присутствующей в экспрессирующем векторе, так, чтобы указанный рецептор TRAIL экспрессировался на указанной клетке-мишени. Затем указанную клетку-мишень обрабатывают антителом, которое селективно связывается с указанным рецептором TRAIL.

Описаны аминокислотные последовательности и последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие тяжелую и легкую иммуноглобулиновые цепи антитела, обладающего селективностью по отношению к DR5. Также подробно описаны последовательности антитела, которое селективно связывается с DR4. Кроме того, подробно описаны векторы, включающие последовательность нуклеиновой кислоты настоящего изобретения, и клетки-хозяева, трансформированные вектором настоящего изобретения.

Настоящее изобретение относится к гуманизированному антителу против DR5 (например, TRA-8) и к гуманизированному антителу против DR4 (например, 2Е12), а также к трансфецированной клетке, продуцирующей гуманизированное антитело против DR5, и к трансфецированной клетке, продуцирующей гуманизированное антитело против DR4.

Описан способ продуцирования гуманизированного антитела против DR5 или антитела против DR4, предусматривающий трансформацию хозяина последовательностями нуклеиновой кислоты, кодирующими легкую цепь гуманизированного иммуноглобулина и тяжелую цепь гуманизированного иммуноглобулина, и последующее инкубирование трансформированного хозяина в течение заранее определенного периода времени.

Также описан способ индуцирования апоптоза клеток-мишеней или индуцирования пролиферации клеток, который включает контактирование клетки-мишени с фармацевтически эффективным количеством гуманизированного антитела против DR5, гуманизированного антитела против DR4 или комбинации антитела против DR5 и антитела против другого рецептора гибели (например, антитела против DR4) в присутствии или в отсутствие других терапевтических агентов и в комбинации с другой терапией.

Также рассматривается коммерчески доступный набор для индуцирования апоптоза, который включает гуманизированное селективное антитело TRA-8 против DR5 или гуманизированное селективное антитело против DR4 (например, гуманизированное антитело 2Е12) и который упакован в соответствующий контейнер, содержащий, но необязательно, инструкции по его использованию.

Краткое описание графического материала

Фиг.1. Характеризация TRA-8. (а). Специфическое связывание TRA-8: Вестерн-блот-анализ (верхняя панель): рекомбинантные гибридные белки семейства TNFR, зондированные антителом TRA-8 или антителом против IgG человека. Дорожка 1: гибридный белок DR5/hIgG1 (иммуноген); дорожка 2: DR4/hIgG1 (TRAIL-R1); дорожка 3: DR5/hIgG1; дорожка 4: TRAIL-R3 (DcR-1)/hIgG1; дорожка 5: TRAIL-R4 (DcR-2)/hIgG1; дорожка 6: СD95/hIgG1; дорожка 7: растворимый TNFRI. ELISA-анализ (нижняя панель): номера лунок совпадают с номерами лунок для Вестерн-блот-анализа, за исключением лунки 8, которая относится к мышиному гибридному белку DR5/hIgG1. (b). Активность связывания растворимого TRAIL и TRA-8 с DR5 и DR4: ELISA-планшеты покрывали DR5/hIgG1 (левая панель) или DR4/hIgG1 (средняя панель), а затем инкубировали с TRAIL или TRA-8. (с). Проточный цитометрический анализ экспрессии DR5 на клеточной поверхности. Клетки Cos-7 трансфецировали экспрессирующим вектором pcDNA3, содержащим полноразмерную кДНК DR5 (заштрихованная гистограмма) или кДНК DR4 (незаштрихованная гистограмма, сплошная линия), либо пустым вектором (незаштрихованная гистограмма, пунктирная линия). Через сорок восемь часов после трансфекции клетки окрашивали TRA-8, а затем PE-конъюгированным антителом против мышиного IgG1. (d). Иммуногистохимическая реактивность in situ для DR5: Через 48 часов после трансфекции предметные стекла с клетками Cos-7, трансфецированными DR5-экспрессирующим или контрольным вектором, окрашенным TRA-8. (е). Цитолитическая активность TRA-8: клетки Jurkat инкубировали с указанными концентрациями TRA-8. После культивирования в течение ночи определяли жизнеспособность клеток с помощью эксклюзионных анализов ATPLite, МТТ и PI. Результаты анализов ATPLite и МТТ выражали в процентах от контроля (среда), а результат анализа PI выражали в процентах по сравнению с PI-негативными клетками. (f). Вестерн-блот-анализ на активацию каспазы: клетки Jurkat инкубировали с 500 нг/мл TRA-8 в течение указанного интервала времени. Клеточные лизаты разделяли с помощью электрофореза в 15% ПААГ с ДСН, подвергали блот-анализу и зондировали антителами против каспазы. Стрелки указывают на расщепленные субъединицы каждой каспазы. (g). Анализ на ингибирование каспазы: клетки Jurkat инкубировали с 50 нг/мл TRA-8 в течение ночи в присутствии различных концентраций указанных ингибиторов каспазы. Жизнеспособность клеток определяли с помощью анализа ATPLite.

Фиг.2. Экспрессия DR5 на клеточной поверхности и восприимчивость к DR5-опосредованному апоптозу. Нормальные Т- и В-клетки, только что выделенные из периферической крови, Т-клетки (а и а'), клетки глиомы (b и b'), раковые клетки предстательной железы (с) и В-клетки (d) инкубировали с антителом TRA-8 или с контрольным антителом против мышиного изотипа IgG1, а затем с PE-конъюгированным козьим антителом против мышиного IgG1. Незаштрихованные гистограммы представляют изотип контрольного антитела, а сплошные гистограммы представляют TRA-8-окрашивание. Апоптоз определяли с помощью анализа ATPLite после инкубирования в течение ночи с растворимым TRAIL (незаштрихованные кружки) или с TRA-8 (заштрихованные кружки), как показано в а, b' и d.

Фиг.3а'. Т-клеточную линию U937 инкубировали с TRA-8 или с контрольным мышиным антителом изотипа IgG1. Апоптоз определяли с помощью анализа ATPLite после инкубирования в течение ночи с растворимым TRAIL (незаштрихованные кружки) или с TRA-8 (заштрихованные кружки).

Фиг.3. Клеточные линии глиомы (b) и рака предстательной железы (с) инкубировали с TRA-8 или с контрольным мышиным антителом изотипа IgG1. Апоптоз определяли с помощью анализа ATPLite после инкубирования в течение ночи с растворимым TRAIL (незаштрихованные кружки) или с TRA-8 (заштрихованные кружки).

Фиг.4 представляет собой серию графиков, иллюстрирующих жизнеспособность человеческих клеток Jurkat после обработки указанными концентрациями (А) антитела типов TRA-1, -8 и -10, и (В) TRAIL в присутствии фиксированной концентрации антител настоящего изобретения типов, указанных на фиг.4А.

Фиг.5. Экспрессия DR5 в нормальных и раковых тканях: гомогенаты нормальных и раковых тканей зондировали антителом TRA-8 и оценивали на развитие хемилюминесценции. (а). Вестерн-блот-анализ белка DR5 в нормальных тканях: дорожка 1: печень, дорожка 2: головной мозг, дорожка 3: легкие, дорожка 4: почки, дорожка 5: селезенка, дорожка 6: яички, дорожка 7: яичник, дорожка 8: сердце, дорожка 9: поджелудочная железа. (b). Вестерн-блот-анализ белка DR5 в раковых тканях. Зондировали блот раковой ткани, содержащий раковые клетки яичника (дорожка 1), легкого (дорожка 2), печени (дорожка 3), прямой кишки (дорожка 4), шейки матки (дорожка 5), кожи (дорожка 6), яичек (дорожка 7), щитовидной железы (дорожка 8), матки (дорожка 10), желудка (дорожка 11), носоглотки (дорожка 12) и поджелудочной железы (дорожка 13). Проводили иммуногистохимический анализ in situ нормальных тканей (с) и раковых тканей (d) человека. Замороженные срезы подвергали иммуноокрашиванию TRA-8.

Фиг.6. Опухолецидная активность TRA-8. Мышей SCID подкожно инокулировали клетками 1321N1. Мышам внутривенно вводили одну дозу 100 мкг TRA-8 на второй день после инокуляции опухоли (а) или три дозы 100 мкг TRA-8, начиная с 7-го дня после инокуляции опухоли (b). Рост опухоли определяли по ее массе и гистологически оценивали по окрашиванию Н&E. Фотографии указывают на рост жизнеспособных опухолевых клеток у контрольных мышей, но не у TRA-8-обработанных мышей (с, верхняя панель) и на Н&E-окрашивание опухоли (с, нижняя панель). Мышам SCID внутривенно инъецировали 10⁶ клеток Jurkat и этих мышей обрабатывали одной дозой TRA-8 на второй день после инъекции. Через 7 дней клетки селезенки собирали, окрашивали антителом против человеческого CD3 и анализировали с помощью проточной цитометрии (d) или иммуногистохимии (е).

На фиг.7 проиллюстрирована экспрессия DR5 на поверхности синовиальных клеток при РА (А) и ОА (В). 1×10⁶ первичных культивированных синовиальных клеток окрашивали аффинноочищенным TRA-8, а затем PE-конъюгированным козьим антителом против мышиных IgG1. 10000 жизнеспособных клеток анализировали с использованием программы FACSvantage.

Фиг.8 представляет собой серию графиков, иллюстрирующих жизнеспособность клеток и выражающих зависимость концентрации TRAIL и TRA-8, индуцирующей апоптоз репрезентативных штаммов синовиальных клеток РА (А) и ОА (В), от различных концентраций рекомбинантного растворимого TRAIL (незаштрихованные кружки) или аффинноочищенного TRA-8 (заштрихованные кружки). Жизнеспособность клеток выражали в процентах им/мин обработанных клеток по отношению к им/мин необработанных клеток.

Фиг.9 представляет собой серию графиков, иллюстрирующих зависимость DR5-опосредованного апоптоза синовиальных РА-клеток от каспазы. Синовиальные клетки РА (RA512) инкубировали с 50 нг/мл растворимого лиганда Fas (незаштрихованные квадраты), с анти-Fas антителом (СН-11) (заштрихованные квадраты), с растворимым TRAIL (незаштрихованные кружки) или с анти-DR5 антителом (TRA-8) (заштрихованные кружки) в присутствии различных концентраций ингибиторов каспазы. После культивирования в течение ночи жизнеспособность клеток определяли с помощью ATPLite.

Фиг.10А иллюстрирует анализ электрофоретического сдвига в геле, указывающий на активацию NF-κb. Клетки RA1016 инкубировали с 20 нг/мл TNF-α, с 50 нг/мл растворимого TRAIL или с 50 нг/мл TRA-8 в течение указанных промежутков времени, а затем подвергали электрофорезу. Фиг.10В и С представляют собой графики, иллюстрирующие продуцирование ММР-1 и ММР-3. 1×10⁶/мл указанных синовиальных РА-клеток инкубировали с указанными концентрациями TNF-α (незаштрихованные кружки), TRAIL (незаштрихованные треугольники) или TRA-8 (заштрихованные кружки). После культивирования в течение ночи собирали супернатанты культуры. Уровни ММР в супернатантах культуры определяли с помощью ELISA.

Фиг.11. TRA-8 не индуцирует гепатоцеллюлярную токсичность. (а). Нормальные ткани печени не экспрессируют DR5. Парафиновые срезы двух нормальных тканей печени, одной ткани гепатоцеллюлярной карциномы и центрифугированный препарат клеток НерG2 получали для Н&E-окрашивания и соответствующие замороженные срезы окрашивали TRA-8. (b). Проточный цитометрический анализ экспрессии DR5 на клеточной поверхности. Гепатоциты, выделенные из двух нормальных тканей печени и из ткани гепатоцеллюлярной карциномы, и клетки НерG2 окрашивали TRA-8, анти-Fas антителом (DХ2) или изотипическим контрольным антителом. Заштрихованные гистограммы указывают на TRA-8- или DХ2-окрашивание, а незаштрихованные гистограммы относятся к соответствующим изотипическим контролям.

Фиг.12. TRAIL, но не TRA-8 индуцирует гепатоцеллюлярную токсичность. Свежие нормальные гепатоциты человека выдерживали в среде для культивирования гепатоцитов. (а). Апоптоз гепатоцитов индуцировали с использованием 1 мкг/мл растворимого TRAIL и перекрестно-связывающего агента или TRA-8 в указанное время. Жизнеспособность клеток определяли с помощью анализа ATPLite. Результаты представлены как процент жизнеспособных клеток по отношению к контролю (среда). Затененные столбцы относятся к TRAIL, а черные столбцы относятся к TRA-8. (b). Конденсированные ядра гепатоцитов окрашивали Hoechst 33352 и анализировали с помощью проточной цитометрии. (с). Влияние циклогексимида на апоптоз гепатоцитов. Гепатоциты культивировали в контрольной среде или в среде с 1 мкг/мл TRAIL или TRA-8 в присутствии (заштрихованные столбцы) или в отсутствие (незаштрихованные столбцы) 1 мкг/мл циклогексимида в течение 8 часов. Жизнеспособность клеток определяли с помощью ATPLite. Результаты представлены как среднее значение ± среднеквадратичное отклонение для культур, полученных с тремя повторениями в двух экспериментах. (d). Сравнение чувствительности нормальных гепатоцитов к DR5- и Fas-опосредованному апоптозу. Свежевыделенные гепатоциты инкубировали с указанными концентрациями растворимого TRAIL, TRA-8, растворимого FasL или анти-Fas mAb СН11 в течение 6 часов. Жизнеспособность клеток определяли с помощью ATPLite. Результаты представлены как процент жизнеспособных клеток по отношению к контролю (среда). Для нормальных гепатоцитов представлены средние значения ± среднеквадратичное отклонение для четырех нормальных индивидуумов. Результаты для клеток гепатоцеллюлярной карциномы, взятых от одного пациента, и для клеток НерG2 представлены как средние значения для культур, полученных с тремя повторениями.

Фиг.13. TRAIL индуцирует гепатит. Мышей В6 внутривенно инокулировали 10⁹ б.о.е. аденовирусного вектора, кодирующего полноразмерный TRAIL человека под контролем транскрипционного элемента "Tet-on". Экспрессию TRAIL индуцировали указанной дозой тетрациклина. (а). Нозерн-блот-анализ экспрессии человеческого TRAIL в печени. Через 24 часа после инокуляции вектора и индуцирования тетрациклином полноразмерную РНК выделяли из печени и зондировали с использованием кДНА человеческого TRAIL или β-актина. (b). Сывороточные уровни AST. Через 24 часа после трансдукции TRAIL определяли сывороточные уровни AST. (с). TRAIL-опосредованная гибель гепатоцитов, инфицированных аденовирусным вектором: мышей В6 внутривенно инокулировали тетрациклин-индуцибельным аденовирусным вектором. Через 48 часов после инокуляции гепатоциты от инокулированных и неинокулированных контрольных мышей выделяли и инкубировали с указанными концентрациями TRAIL в течение 8 часов (левая панель). Жизнеспособность гепатоцитов определяли с помощью анализа ATPLite. Затем, через 48 часов, мышам, инокулированным вышеупомянутым аденовирусным вектором, внутривенно инъецировали 10 мкг растворимого человеческого TRAIL. Через 24 часа после инъекции TRAIL определяли сывороточные уровни AST (правая панель). (d и е). Гистологический анализ на повреждение печени, индуцированное TRAIL. Через 24 часа (d) или на 7-й день (е) после введения TRAIL печень вырезали. Парафиновые срезы окрашивали Н&E и фотографировали при 100× (верхняя панель) и 400× (нижняя панель).

Фиг.14 представляет серию графиков, на которых показано, что активированные Т-клетки и В-клетки, выделенные из человеческих МКПК, экспрессируют повышенные уровни DR5, как было определено с помощью проточной цитометрии для покоящихся (незаштрихованные) и активированных (заштрихованные) клеток.

Фиг.15 представляет графики, иллюстрирующие жизнеспособность в зависимости от концентрации TRA-8 для очищенных Т-клеток и В-клеток, представленных на фиг.14, которые были стимулированы анти-CD3 или анти-μ антителом в течение 48 часов, при этом активированные и бластные клетки были собраны при различной плотности Фиколл-Пак. Жизнеспособность клеток определяли с помощью анализа ATPLite.

Фиг.16 представляет собой гистограмму и графики проточной цитометрии, иллюстрирующие экспрессию CD3 в популяции лимфоцитов, отобранных в клеточном сортере с дискриминационным окном, для мышей NOD/SCID с дефицитом NK-клеток, которым были инъецированы МКПК и TRA-8 или IgG (контроль).

Фиг.17 иллюстрирует CD3- и TUNEL-окрашенные клеточные микрографики для ткани мышиной селезенки, как подробно описано в примере 13.

Фиг.18 представляет график цитотоксичности для клеток хронического лимфолейкоза (ХЛЛ) и для нормальных В-клеток человека в присутствии TRA-8, BISVIII и их комбинации.

Фиг.19(а). Специфическое связывание 2Е12 с DR4. ELISA-планшеты покрывали растворимой формой гибридного белка "рецептор человеческого TRAIL - Fc человеческого IgG1", как указано, и инкубировали с указанной концентрацией mAb 2Е12, а затем с HRP-конъюгированным антителом против мышиных IgG1. Реакцию проявляли субстратным буфером ТМВ и величины OD измеряли при 450/650 нМ.

Фиг.19(b). 2Е12 связывается с клеточной поверхностью DR4. Клетки Cos-7 трансфецировали вектором, содержащим полноразмерную кДНК для DR4 (заштрихованная гистограмма) или контрольным вектором (незаштрихованная гистограмма). Трансфецированные клетки окрашивали 10 мкг/мл 2Е12 и HRP-конъюгированным антителом против мышиных IgG1. Клетки анализировали с помощью проточной цитометрии.

Фиг.19(с). Апоптоз-индуцирующая активность 2Е12. Клетки человеческой лимфомы Ramos B инкубировали в течение ночи с указанными концентрациями 2Е12 в присутствии 2 мкг/мл антитела против мышиных IgG1. Жизнеспособность клеток определяли с помощью анализа ATPLite. (d). Активация каспазы, индуцированная 2Е12. Клетки Ramos обрабатывали 2Е12 и антителом против мышиных IgG в течение указанных промежутков времени. Активацию каспазы и расщепление PARP определяли с помощью Вестерн-блот-анализа с использованием специфических антител против каспазы или PARP.

Фиг.20. Действие 2Е12 и адриамицина у бестимусных "голых" мышей, несущих ксенотрансплантаты рака молочной железы. Клетки 2LMP (3×10⁷) подкожно инъецировали бестимусным "голым" мышам на день 0. Двум группам мышей внутрибрюшинно инъецировали 200 мкг 2Е12 в дни 7, 10, 14, 17, 21 и 24. Двум группам мышей вводили i.v. адриамицин (6 мг/кг) в дни 8, 12 и 16. Одной группе мышей антитело не вводили. Данные выражали как среднее изменение размера опухоли по отношению к размеру опухоли на день 7 (n=8 мышей/группу).

Фиг.21. Действие TRA-8, 2Е12 и адриамицина у бестимусных "голых" мышей, несущих ксенотрансплантаты рака молочной железы. Клетки 2LMP (3×10⁷) s.c. инъецировали бестимусным "голым" мышам на день 0. Двум группам мышей i.p. инъецировали 200 мкг TRA-8 и 2Е12 в дни 7, 10, 14, 17, 21 и 24. Двум группам мышей вводили i.v. адриамицин (6 мг/кг) в дни 8, 12 и 16. Одной группе мышей антитело не вводили. Данные выражали как среднее изменение размера опухоли по отношению к размеру опухоли на день 7 (n=8 мышей/группу).

Подробное описание изобретения

Неспособность клеток к элиминации обусловлена нарушениями в апоптоз-индуцирующей системе, которая ассоциируется с некоторыми дефектами, включая, например, нарушение экспрессии или функции лиганда, рецептора или внутриклеточных регуляторных или эффекторных молекул. Настоящее изобретение относится к способу коррекции дефицитной апоптоз-индуцирующей системы, а также выявления конкретных дефектов, присущих данной дефицитной апоптоз-индуцирующей системе.

Настоящее изобретение относится к новому классу моноклональных антител, которые обладают селективной in vivo и in vitro апоптоз-индуцирующей активностью против специфических TRAIL-рецепторов, включая DR5, DR4, DcR1 и DcR2. Так, например, антитела настоящего изобретения специфически связываются с одним из TRAIL-рецепторов. Термин "селективное связывание" или "специфическое распознавание" означает, что данное антитело связывается только с одним TRAIL-рецептором и обнаруживает незначительное связывание или вообще не связывается с другими типами TRAIL-рецепторов в традиционном Вестерн-блот-анализе. Анти-DR5 антитело настоящего изобретения селективно связывается с DR5, а уровень его связывания с DR4, DcR1 или DcR2 не превышает фоновый уровень примерно более чем в 1,5 раза. Аналогичным образом анти-DR4 антитело настоящего изобретения селективно связывается с DR4, а уровень его связывания с DR5, DcR1 или DcR2 не превышает фоновый уровень примерно более чем в 1,5 раза. Антитело настоящего изобретения может быть использовано в качестве реагента для исследования передачи сигнала апоптоза, а также в качестве терапевтически эффективного средства против клеток, экспрессирующих TRAIL-рецепторы, включая, например, раковые клетки широкого класса, клетки, обнаруживающие нарушение регуляции системы апоптоза, активированные лимфоциты или другие активированные иммунные клетки (например, лимфоидные клетки и миелоидные клетки), вирус-инфицированные клетки и аномально пролиферирующиеся синовиальные клетки (например, синовиальные клетки ревматодного артрита, включая воспалительные синовиальные клетки, активированные лимфоидные и миелоидные клетки в синовильной жидкости, макрофаг-подобные синовиоциты и фибробласт-подобные синовиоциты), ассоциированные с аутоиммунными заболеваниями. Антитела настоящего изобретения специфически связываются с TRAIL-рецепторами конкретного типа независимо от степени гомологии между ними. Антитела настоящего изобретения направлены на апоптоз только тех клеток, которые экспрессируют нужный TRAIL-рецептор или, альтернативно, блокируют TRAIL-апоптоз клеток, экспрессирующих нужный рецептор.

Моноклональное антитело против DR5 или моноклональное антитело против DR4 настоящего изобретения служит сильным индуктором апоптоза клеток, экспрессирующих DR5 или DR4, соответственно, in vitro, и сильным индуктором апоптоза in vivo. Гуманизированные фрагментарные CDR-последовательности, привитые к каркасам гуманизированных антител, и гибридный белок анти-DR5 или анти-DR4 антител настоящего изобретения обладают аналогичными апоптотическими свойствами.

До настоящего времени не было получено моноклонального антитела, которое связывается с DR5 клеточной поверхности и которое, даже при низких концентрациях, индуцирует апоптоз клеток, экспрессирующих DR5 как in vitro, так и in vivo в отсутствие перекрестно-связывающего агента. Настоящее изобретение относится к анти-DR5 антителу, де