Конкатемер пептида, индуцирующего выработку антител против аполипопротеина в-100, вакцина для лечения ожирения, способ получения конкатемера, полинуклеотид, экспрессирующий вектор

Конкатемер пептида, индуцирующего выработку антител против аполипопротеина в-100, вакцина для лечения ожирения, способ получения конкатемера, полинуклеотид, экспрессирующий вектор

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Настоящее изобретение относится к вакцине для лечения ожирения. Конкретнее, настоящее изобретение относится к вакцине, которая включает миметический пептидный эпитоп аполипопротеина В-100, его конкатемеры или модифицированные пептиды.

Предпосылки изобретения

Липиды сыворотки крови включают холестерин, триглицериды (TG), свободные жирные кислоты, фосфолипиды и тому подобное, и находятся в кровяном русле в форме липопротеина, который представляет комплекс липида и аполипопротеина.

Из этих липопротеинов липопротеин низкой плотности (LDL) является основным носителем TG и холестерина. Значительно возросло число пациентов, страдающих артериосклерозом, заболеванием коронарных артерий или инфарктом миокарда, вызванных повышенным содержанием LDL-холестерина в крови, за счет изменения рациона или других факторов.

Следовательно, предпринимались различные исследования для снижения уровня LDL-холестерина и установления причины вышеуказанных заболеваний для лечения пациентов, страдающих вышеуказанными заболеваниями.

LDL-холестерин, основной этиологический фактор при заболеваниях у взрослых, связанных с метаболизмом липидов, может превращаться под действием макрофагов в липопротеин высокой плотности (HDL). Кроме того, LDL-холестерин может также превратиться в другое вещество или превратиться в желчную кислоту в печени (Brown M.S. and Goldstein J.L., 1983, Annu. Rev. Biochem., 52:223-261).

Аполипопротеин В-100 представляет основную белковую часть LDL и находится также в липопротеине очень низкой плотности (VLDL) и хиломикроне. LDL-холестерин в крови можно удалить посредством фагоцитоза с участием макрофагов в случае, когда стимулируется образование антител, распознающих аполипопротеин В-100, поскольку аполипопротеин В-100 приводит к тому, что частицы LDL связываются с LDL-рецепторами, расположенными на поверхности клеток (Dalum I. et al., 1997, Mol. Immunol., 34(16-17): 1113-20).

В случае, когда макромолекула такая, как антитело, связывается с аполипопротеином В-100, который находится на поверхности LDL, липаза такая, как липопротеинлипаза, не может гидролизовать TG и тому подобное, за счет стерического несоответствия, вызванного тем, что макромолекула связана с аполипопротеином В-100. Следовательно, образование свободных жирных кислот, основного фактора для возникновения ожирения, можно ингибировать с помощью антител, которые могут связываться с аполипопротеином В-100.

Недавно было предпринято несколько исследований с целью снижения уровня LDL-холестерина и подавления возникновения артериосклероза с использованием вакцины на различных моделях на животных, таких как мышь или кролик. Например, C.R.Alving сообщил, что холестерин можно модифицировать метаболитами или его окислением и что модифицированный холестерин в некоторых случаях может быть сильным антигенным детерминантом (Alving C.R. et al., 1989, Biochem. Soc. Trans., 17(4): 637-9; Alving C.R. et al., 1996, J. Lab. Clin. Med., 127: 40-49; Alving C.R. et al., 1996, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 210: 181-6).

Кроме того, сообщалось, что в сыворотке крови имеются эндогенные антитела к холестерину (Wu J.T., L.L., 1997, Clin. Lab. Med., 17(3): 595-604, Review). Также сообщалось, что в опыте, в котором у кроликов индуцировался артериосклероз и гиперхолестеринемия при скармливании содержащего холестерин корма, проявление гиперхолестеринемии и артериосклероза у кроликов, иммунизированных введением содержащих холестерин липосом, подавлялось или заметно снижалось по сравнению с контрольной группой.

Таким антителом, индуцированным вакциной к холестерину, является иммуноглобулин М (IgM), который связывается с VLDL, липопротеином промежуточной плотности (IDL) и LDL. Основываясь на вышесказанном, полагается, что возможно создание вакцины для лечения или профилактики гиперлипидемии или артериосклероза, вызванных высоким уровнем холестерина (Bailey J.M., 1994, Science, 264: 1067-1068; Palinski W. et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 92(3): 821-5: Wu R. et al., 1999, Hypertension, 33(1): 53-9).

Заявители установили, что ожирение можно эффективно предотвратить миметическим пептидным эпитопом аполипопротеина В-100, и, основываясь на вышесказанном, разработали вакцину для лечения ожирения.

Раскрытие изобретения

Следовательно, целью настоящего изобретения является обеспечение миметического пептида для эпитопа аполипопротеина В-100, его конкатемера и модифицированных пептидов.

Другой целью настоящего изобретения является обеспечение способа получения вышеуказанного миметического пептида для эпитопа аполипопротеина В-100, его конкатемера и модифицированных пептидов.

Еще одной целью настоящего изобретения является обеспечение вакцины для лечения или профилактики ожирения, которая включает вышеуказанный миметический пептид для эпитопа аполипопротеина В-100, его конкатемер и модифицированные пептиды.

Цель настоящего изобретения достигается обеспечением миметического пептида для эпитопа аполипопротеина В-100, его конкатемера и модифицированных пептидов.

В настоящем изобретении использовалась библиотека пептидов фага для скрининга эпитопа человеческого аполипопротеина В-100, связанного с моноклональными антителами (MabB23). Подвергнутые скринингу вышеуказанные пептиды представляли миметические пептиды, в структурном отношении близкие к антигенной детерминанте, которая может распознаваться антителами, и данные миметические пептиды были синтезированы согласно аминокислотной последовательности подвергнутых скринингу пептидов.

Библиотека пептидов представляет способ поиска трехмерной формы антигенной детерминанты. То есть, фрагменты ДНК, которые кодируют произвольно секвенированные пептиды, вставляют в ДНК, которая кодирует минорный белок оболочки фага, и затем вставляют в RF (рамку считывания) ДНК и трансформируют в E.coli для их экспрессии. Экспрессированные на поверхности E.coli пептиды подвергают взаимодействию с антигеном для того, чтобы отобрать пептиды, структурно близкие к антигенной детерминанте.

Для того, чтобы получить антисыворотку, мышей иммунизируют введением вышеуказанных миметических пептидов. Было доказано, что полученная таким образом антисыворотка распознает первоначальный аполипопротеин В-100 и одновременно миметические пептиды и LDL (Identification of Antigenic Determinants for the Murine Monoclonal Antibodies Against Apolipoprotein A-1 and Apolipoprotein B-100 by using Phage-displayed Random Peptide library, Chi-Hoon Kim, Hanyang Univ., 1997).

Миметический пептид для эпитопа аполипопротеина В-100 по настоящему изобретению можно выбрать из пептидов с последовательностями SEQ.ID. № 1, SEQ.ID. № 2, SEQ.ID. № 3 или их комбинаций.

Миметические пептиды по настоящему изобретению можно использовать в форме конкатемера для того, чтобы улучшить их антигенную детерминанту. В качестве осуществления настоящего изобретения можно связать два или более миметических пептида друг с другом. Желателен конкатемер, состоящий из трех (3) - пятнадцати (15) пептидов. Более предпочтительно конкатемер по настоящему изобретению включает четыре (4) пептида с последовательностью SEQ.ID. № 1.

«Конкатемер» вышеуказанного миметического пептида по настоящему изобретению относится к полимеру, в котором концы вышеуказанных миметических пептидов связаны друг с другом.

«Модифицированный пептид» вышеуказанного миметического пептида по настоящему изобретению относится к вариантам миметических пептидов, которые могут распознаваться моноклональными или поликлональными антителами к аполипопротеину В-100. Такие варианты включают замены, делеции, добавления и химические замены одной или более аминокислот в миметическом пептиде по настоящему изобретению.

Еще одной целью настоящего изобретения является обеспечение способа получения миметического пептида, его конкатемера и модифицированных пептидов, который включает: i) стадию вставки ДНК, которая кодирует вышеуказанный миметический пептид, его конкатемер или модифицированный пептид, в вектор; ii) стадию трансформации вышеуказанного вектора в клетки-хозяева и затем их инкубацию и iii) стадию выделения вышеуказанного миметического пептида, его конкатемера или модифицированных пептидов из клеток-хозяев.

Приготовление вакцины можно проводить любым общепринятым способом с миметическим пептидом, его конкатемером или модифицированными пептидами по настоящему изобретению. Предпочтительно, чтобы в способе получения вышеуказанного препарата композиция, в которой активное соединение смешано или разбавлено иммунным адъювантом, препаратом для усиления иммунитета, носителем, наполнителем или разбавителем, была выбрана из группы, состоящей из таблетки, пилюли, гранулы, порошка, облатки, суспензии, эмульсии, жидкости, сиропа, аэрозоля, мягкой или твердой желатиновой капсулы, стерильного раствора для инъекций, стерильного порошка и тому подобное.

Иммунный адъювант, который можно использовать в композиции по настоящему изобретению, представляет вид белков, содержащих эпитоп Т-клеток (например, поверхностный белок вируса гепатита В), инертный носитель, такой как соль алюминия, бентонит, латекс, акриловую частицу и тому подобное; гидрофобный антиген (например, липид), эмульсии вода-масло и масло-вода, образователь депо (например, полисахарид), активатор Т-клеток, такой как PPD, полиаденин, полиурацил и тому подобное; активатор В-клеток (например, В-клеточный митоген), поверхностно-активное вещество, такое как сапонин, лизолецитин, ретинал, квил А (quil A), липосому и тому подобное; вещество для усиления активности макрофагов и активаторы альтернативного пути комплемента, такие как инулин, зимозан, эндотозин, лебамизол, С. parvum и тому подобное.

«Белок-носитель» по настоящему изобретению означает фармацевтически приемлемое вещество, такое как белок или соль алюминия, которые могут транспортировать миметический пептид, его конкатемер и модифицированные пептиды по настоящему изобретению, по кровяному руслу.

В качестве подходящих носителей, наполнителей или разбавителей в композиции по настоящему изобретению можно использовать соль алюминия, феноксиэтилэтанол, воду, физиологический раствор, лактозу, декстрозу, сахарозу, сорбит, маннит, силикат кальция, целлюлозу, метилцеллюлозу, аморфную целлюлозу, поливинилпирролидон, метилгидроксибензоат, пропилгидроксибензоат, тальк, стеарат магния и минеральное масло.

Кроме того, композиция по настоящему изобретению дополнительно может включать наполнитель, антикогезивный агент, лубрикант, увлажнитель, ароматизатор, эмульгатор и антисептик.

Композиция по настоящему изобретению может быть составлена обычным способом, хорошо известным в данной области, для индукции иммунного ответа у млекопитающего при одном (1) или более введениях.

Вакцину для лечения ожирения по настоящему изобретениюможно вводить различными путями, такими как оральное, накожное, внутрикожное, внутривенное или внутримышечное введение, предпочтительно внутрикожное введение.

Эффективная доза вакцины по настоящему изобретению составляет 0,1-10 мкг (активного пептида) на кг массы тела, предпочтительно 0,5-1,0 мкг на кг. Однако реальную дозу активного вещества вакцины можно определить в зависимости от нескольких факторов, таких как иммунный статус, пути введения, состояние пациента, возраст, пол, масса тела и тому подобное. Следовательно, пределы указанных доз никоим образом не ограничивают объем настоящего изобретения.

Основным фармацевтическим действием вакцины по настоящему изобретению является профилактика или лечение ожирения посредством механизма, при котором антитела, индуцированные миметическим пептидом, его конкатемером или модифицированными пептидами, связываются с эпитопом аполипопротеина В-100 на поверхности LDL и тем самым стерически препятствуют и ингибируют липазу, которая участвует в образовании жирных кислот, являющихся основным этиологическим фактором ожирения.

Кроме того, вакцина по настоящему изобретению обладает действием подавлять гиперлипидемию посредством механизма, при котором LDL обнаруживается и легко удаляется макрофагом с помощью опсонизации, вызванной человеческими антителами, индуцированными миметическим пептидом, его конкатемером или модифицированными пептидами и конъюгированными с эпитопом аполипопротеина В-100 на поверхности LDL.

Другим фармацевтическим действием композиции по настоящему изобретению является профилактика или лечение ожирения путем подавления накопления липидов, таких как холестерин свободных жирных кислот в клетке, посредством механизма, при котором человеческие антитела, индуцированные миметическим пептидом, его конкатемером или модифицированными пептидами, связываются с эпитопом аполипопротеина В-100 на поверхности LDL, и тем самым препятствуют специфическому связыванию LDL с LDL-рецептором, расположенным на поверхности клеток.

Краткое описание фигур

Вышеуказанные цели и другие преимущества настоящего изобретения станут более понятными при подробном описании его предпочтительного осуществления при обращении к прилагаемым фигурам, на которых:

На фигурах 1а-1d представлены структуры и состав вектора для экспрессии миметического пептида по настоящему изобретению. На фиг. 1а представлена структура лидерной кассеты, на фиг. 1d представлена структура кассеты LB, на фигуре 1с представлена структура кассеты BL и на фигуре 1d представлена структура вектора экспрессии рВХ4.

На фигуре 2 представлены способы получения вектора рВХ1 и рВХ4 для экспрессии миметического пептида по настоящему изобретению.

На фигуре 3 представлены результаты электрофореза в полиакриламидном геле (PAGE), проведенного для идентификации кассеты LB.

На фигуре 4 представлены результаты PAGE, проведенного для идентификации кассеты BL, включенной в плазмиду pBlue-BL.

На фигуре 5 представлены результаты PAGE, проведенного для подтверждения направления и числа копий ДНК, вставленной в плазмиду pBX1 и pBX3.

На фигуре 6 представлены результаты вестерн-блоттинга, проведенного для идентификации экспрессированного пептида PBl₄.

На фигуре 7 представлены результаты PAGE с добавлением додецилсульфата натрия (SDS), проведенного для подтверждения очищенного пептида PBl₄.

На фигуре 8 представлены результаты вестерн-блоттинга, проведенного для подтверждения реакционной способности очищенного пептида PBl₄ против анти-PBl₄-сыворотки.

На фигуре 9 представлены результаты ELISA, проведенного для определения авидности мышиных антител, индуцированных пептидом PBl₄.

На фигуре 10 представлен график, который показывает подавляющее действие PBl₄ на увеличение массы тела мыши.

На фигурах 11а и 11b представлены графики, показывающие изменение массы тела мышей в зависимости от введения вакцины PBl₄ по настоящему изобретению через 20 недель после введения препарата, который может нарушить функцию гипоталамуса.

На фигуре 12 представлен график, который представляет влияние на концентрацию липидов в сыворотке крови при введении вакцины PBl₄.

Наилучший способ осуществления настоящего изобретения

В последующем настоящее изобретение будет описано подробнее. Однако настоящее изобретение, поясняемое ниже, представлено только для пояснения осуществления настоящего изобретения и не предназначено для ограничения объема настоящего изобретения.

Пример 1: синтез и отжиг олигонуклеотида

Олигонуклеотиды получали химическим синтезом в Genemed Synthesis (San Francisco, CA, США) по последовательности, предоставленной настоящими заявителями. Для фосфорилирования 5'-конца олигонуклеотидов, 50 мкл 100 пмоль/мкл олигонуклеотида инкубировали с 10 мкл 10 мМ АТФ, 3 мкл 10 Е/мкл полинуклеотидкиназы Т4 (Takara, Otsu, Япония) и 7 мкл 10Х буфера для киназы в течение двух (2) ч при 37°С.

Каждую аликвотную пробу объемом 10 мкл вышеуказанных фосфорилированных олигонуклеотидов смешивали вместе, нагревали при 80°С в течение 5 мин и затем медленно охлаждали до комнатной температуры, проводя таким образом отжиг с получением специфической конъюгации комплементарных цепей.

Пример 2: лигирование

Смесь для проведения лигирования готовили смешением 1 мкл ДНК-вектора, 5 мкл ДНК-вставки, 1 мкл ДНК-лигазы Т4 (NEB, Beverly, MA, США), 1 мкл 10Х буферного раствора для ферментной реакции (NEB, Beverly, MA) и 2 мкл дистиллированной воды, затем инкубировали при 16°С в течение ночи.

Пример 3: конструирование экспрессирующего вектора рВХ для экспрессии миметического пептида аполипопротеина В-100

Стадия 1: планирование вектора

Плазмида-вектор для экспрессии миметического пептида обычно включает лидерную кассету и один или более генов пептида PBl. Как показано на фигуре 1, плазмиду рВХ1, которая включает один (1) ген PBl, получали клонированием лидерной кассеты (фиг. 1а) в сайт для поликлонирования плазмиды pQE30 (Qiagen, Hilden, Германия). Полученную плазмиду расщепляли HindIII и SalI и небольшой фрагмент замещали кассетой LB (фиг. 1b) с получением плазмиды рВХ1, которая подходит для удобной вставки множественных количеств кассеты BL (фиг. 1с).

Между тем, плазмиду pBluescript II SK+ расщепляли SalI и XhoI и лигировали с кассетами BL, где имели место производные единичные-множественные вставки кассеты BL. Отбирали предполагаемые повторы генов пептида PBl в плазмиде pBlue-BL, вырезали и субклонировали в pBX1 (фиг. 1d).

Стадия 2: получение вектора для экспрессии монопептида PBl

Лидерную кассету готовили отжигом олигонуклеотидов с последовательностями SEQ.ID. № 10 и SEQ.ID. № 11, синтезированных таким же способом, как в примерах 1 и 2. Затем вектор рQE30 (Qiagen, Hilden, Германия), который был расщеплен SalI и BamHI, лигировали с вышеуказанной лидерной кассетой для получения плазмиды pQE-лидер. В результате экспрессии вышеуказанного вектора pQE30 дополнительно включали шесть остатков гистидина в N-конец экспрессированного белка для удобной очистки белка. Вышеуказанную лидерную кассету конструировали с включением сайта узнавания (DDDDKI; SEQ.ID. № 12) для энтерокиназы для уменьшения до минимума дополнительных аминокислот.

По способу примера 1 синтезировали четыре олигонуклеотида, последовательности которых представлены SEQ.ID. № 4-7, фосфорилировали и затем отжигали соответственно с комплементарными олигонуклеотидами для синтеза кассеты LB, представленной на фигуре 1b (SEQ.ID. № 13 и 14). 40 мкл отожженных олигонуклеотидов смешивали с 3 мкл 1 Е/мкл ДНК-лигазы Т4, 5 мкл 10Х буфера для фермента и 2 мкл дистиллированной воды с получением смеси для лигирования. Затем смесь для лигирования инкубировали в течение ночи для связывания олигонуклеотидов друг с другом.

После завершения реакции реакционную смесь наносили на 20% полиакриламидный гель и проводили электрофорез. Кассету LB (олигонуклеотиды размером 52 п.о.) (фиг. 3) идентифицировали при окрашивании геля этидиумом бромидом (EtBr).

На фигуре 3 полоса М является ступенчатым фрагментом ДНК размером 20 п.о., и полоса 1 представляет реакционный раствор. Кассету LB извлекали из геля с помощью набора для экстракции из геля QIAEX II (Qiagen, Hilden, Германия).

Вышеуказанную плазмиду pQE30-лидер расщепляли HindIII и SalI и затем лигировали с вышеуказанной кассетой LB, следуя способу в примере 2, с получением вектора для экспрессии миметического пептида PBl. Полученный экспрессирующий вектор называли рВХ1 и пептид, экспрессированный вектором, называли пептидом PBl₁ (смотри фиг. 2).

Стадия 3: получение вектора для экспрессии конкатемера пепетида PBl₁

По способу примера 1 синтезировали четыре олигонуклеотида, последовательности которых представлены SEQ.ID. № 4, 5, 8 и 9, фосфорилировали и затем отжигали соответственно с комплементарными олигонуклеотидами для синтеза кассеты BL на фигуре 1с (SEQ.ID. № 15 и 16). Затем данные олигонуклеотиды лигировали друг с другом по способу стадии 2 и затем наносили на 20% полиакриламидный гель для электрофореза. Идентифицировали олигонуклеотиды размером 55 п.о. (лидерная кассета) при окрашивании геля EtBr. Кассету BL извлекали из геля с помощью набора для экстракции из геля QIAEX II и расщепляли SalI и XhoI.

Между тем, плазмиду pBluescript II SK (Stratagene, La Jolla, CA, США) расщепляли SalI и XhoI. Вектор подвергали электрофорезу в 0,8% агарозном геле и извлекали с помощью набора для экстракции из геля QIAEX II (Qiagen, Hilden, Германия).

Проводили такую же реакцию лигирования, как в примере 2, для получения плазмиды pBlue-BL с использованием 5 мкл ДНК-кассеты BL и 1 мкл вышеуказанного вырезанного ДНК-вектора.

pBlue-BL расщепляли SalI и XhoI и экстрагировали кассету BL. Плазмиду рВХ2 получали вставкой данной кассеты BL в сайт SalI вектора рВХ1, полученного на стадии 2. Кроме того, получали векторы рВХ3 и рВХ4, приготовленные изменением числа кассет BL, которые вставляли в сайт SalI вектора рВХ1, с двух (2) до трех (3) (смотри фиг. 2).

Пептиды, экспрессированные векторами рВХ2, рВХ3 и рВХ4, представляли конкатемер, который включал два (2) - четыре (4) пептида PBl. Они были названы соответственно PBl_2, PBl₃ и PBl₄.

Стадия 4: идентификация вставки

Клетки-хозяева (E.coli M15 [pREP4]; Qiagen, Hilden, Германия) трансформировали плазмидой pBlue-BL и высевали на чашку с 1% агаром и затем инкубировали в течение 16 ч при 37°С для того, чтобы могли образоваться колонии E.coli. Одну из колоний, образовавшихся на чашке с агаром, вносили в 10 мл среды LB и инкубировали при встряхивании при 37°С в течение шестнадцати (16) ч и затем выделяли плазмиду с помощью системы для очистки ДНК (Wizard PLUS SV DNA miniprep DNA purification system; Promega, Madison, Wl, США). Плазмиду, выделенную из трансформированной E.coli, инкубировали с рестриктазами SalI и XhoI для расщепления при 37°С в течение одного (1) ч и анализировали 20% PAGE (фиг. 4). На фигуре 4 полоса М является ступенчатым фрагментом ДНК размером 20 п.о., полоса 1 представляет олигонуклеотидный продукт, полученный на стадии 3, полоса 2 представляет ДНК кассеты BL, выделенной 20% PAGE на стадии 3, и полоса 3 представляет рекомбинантную плазмиду pBlue-BL, обработанную рестриктазами. Как представлено на фигуре 4, было подтверждено, что плазмида pBlue-BL содержала кассету BL.

E.coli (М15[pREP4]) трансформировали плазмидой рВХ1 или рВХ3 и ДНК плазмиды выделяли, как пояснено выше, для подтверждения числа и ориентации вставок в ДНК кассеты. Выделенную плазмиду расщепляли рестриктазами SalI и HindIII и анализировали 20% PAGE (фиг. 5). На фигуре 5 полоса М является ступенчатым фрагментом ДНК размером 20 п.о., полосы 1 и 3 представляют плазмиду рВХ1, содержащую кассету LB, но не BL, полоса 2 представляет плазмиду, несущую одну кассету LB и две BL с нужным направлением. С другой стороны, полоса 4 представляет плазмиду, имеющую одну кассету LB и две BL, однако, в обратном направлении. Как показано на фигуре 5, по тому, как много кассет В (кассет BL или LB) было вставлено и в каком направлении они были вставлены в вектор рВХ, можно получить карту воздействия рестриктаз.

Кроме того, было подтверждено, что последовательность ДНК кассет В, включенных в плазмиду, которая была получена из трансформированной E.coli, идентична желаемым последовательностям. Плазмиды получали с помощью набора Wizard PLUS DNA miniprep и секвенировали с использованием набора для секвенирования ДНК Sequennase (Ver. 2.1) (Amersham, Cleveland, Великобритания).

Пример 4: экспрессия пептида PBl₄ в E.coli и его выделение

Стадия 1: подтверждение экспрессии пептида PBl₄

Для подтверждения экспрессии пептида PBl₄ три вида трансформированных E.coli М15[pREP4] культивировали в бульонном агаре LB, содержащем ампициллин и канамицин. Один вид E.coli М15[pREP4] трансформировали плазмидой рВХ4, другой - ложно трансформировали pQE30, и еще один представлял нетрансформированную E.coli М15[pREP4]. Каждую из образовавшихся колоний переносили с твердой среды соответственно в жидкую среду LB, которая содержала 100 мкл/мл ампициллина и 25 мкл/мл канамицина, и инкубировали в течение ночи. Культуру инкубировали при 37°С в течение одного (1) часа при встряхивании, пока оптическая плотность при 600 нм не достигала пределов 0,5-0,7. Затем в культуральную среду вносили 1 мМ изопропилтио-β-галактопиранозида (IPTG) для усиления экспрессии рекомбинантного белка и дополнительно культивировали при 37°С в течение пяти (5) ч. Отбирали 1 мл культуральной среды и центрифугировали при 14000 об/мин в течение двух (2) мин для осаждения бактериальных клеток. Клеточный осадок, полученный при центрифугировании, суспендировали в 50 мкл 2Х раствора SDS [100 мМ Трис-Cl, рН 6,8, 20% глицерина (мас./об.), 4% SDS (мас./об), 2% 2-меркаптоэтанола, 0,001% бромфенола синего] для проведения SDS-PAGE. Суспендированный раствор нагревали при 95°С в течение пяти (5) мин, и затем 10 мкл раствора вносили в лунку залитого геля и проводили электрофорез при 20 мА в течение пяти (5) ч (Mighty Small II, Hoefer, США). Концентрация акриламида в концентрирующем геле и разделяющем геле, которые использовали, соответственно равнялась 5% и 15%, и использовали в качестве стандарта белка-маркера размера предварительно окрашенный стандарт SeeBlue (250 kDa - 4 kDa; NOVEX, San Diego, CA, США) и стандарт с широким пределом Mark12 (200 kDa - 2,5 kDa). После проведения электрофореза гель окрашивали кумасси бриллиантовым синим R-250 в течение одного (1) ч и краситель удаляли обесцвечивающим раствором (5% метанола и 7% уксусной кислоты) в течение десяти (10) ч.

Для подтверждения того, что экспрессированный белок представлял собой пептид PBl₄, белки в геле для электрофореза подвергали вестерн-блоттингу с использованием кроличьих анти-РВ1-антител (фиг. 6). Антисыворотку получали иммунизацией яичным белком, конъюнгированным с пептидом PBl, полученным химическим синтезом в Bio-Synthesis, Inc. (Lewisville, TX, США). На фигуре 6 полоса М является меткой предварительно окрашенного стандарта SeeBlue, полоса 1 представляет среду, использованную для инкубации E.coli М15[pREP4], которую не трансформировали, полоса 2 представляет среду, использованную для инкубации E.coli М15[pREP4], которую трансформировали вектором рQE30, полоса 3 представляет среду, использованную для инкубации E.coli М15[pREP4], которую трансформировали вектором рВХ4.

Как представлено на фигуре 6, только трансформированная pВХ4 E.coli экспрессировала рекомбинантный пептид RBl₄, обладающий специфическим иммунитетом в отношении мышиной анти-PBl-сыворотки.

Стадия 2: определение растворимости экспрессированного пептида

E.coli М15[pREP4], которая была трансформирована вектором рВХ4, инкубировали таким же способом, как на стадии 1. Отбирали 10 мл культуральной среды и центрифугировали для сбора клеток. Клеточный осадок, полученный при центрифугировании, суспендировали в 5 мл раствора для лизиса клеток (300 мМ NaCl, 50 мМ NaH₂PO₄, 10 мМ имидазола, рН 8,0) с получением естественного белка из клеток. После охлаждения раствор с суспендированным осадком обрабатывали ультразвуком при 20 циклах для лизиса клеток. Супернатант получали центрифугированием при 4°С, 10000 об/мин в течение 30 мин. С раствором смешивали такой же объем 2Х раствора SDS и проводили SDS-PAGE таким же способом, как описано на стадии 1. Затем каждый раствор прогревали при 95°С в течение 5 мин. В результате проведения SDS-PAGE было подтверждено, что пептид PBl₄ можно выделить и очистить из растворимого экстракта А, входящего в состав нерастворимого неочищенного экстракта В.

Стадия 3: очистка пептида PBl₄

Стадия 3-1: аффинная хроматография

Для очистки рекомбинантного пептида, полученного на стадии 1, использовали смолу Ni-NTA для очистки His-меченых белков. Аффинная хроматография с использованием силы притяжения между насыщенным в смоле Ni⁺ и остатков гистидина на конце экспрессированного белка является хорошо известным методом удобной очистки интересующего белка.

Прежде всего, E.coli М15[pREP4], которую трансформировали рВХ4, вносили в 1 л культуральной среды LB и инкубировали при 37°С до того, как оптическая плотность при 600 нм была выше 0,6. Соотношение культуральной среды LB и вектора рВХ4 составляло пятьдесят (50) к одному (1). IPTG добавляли до конечной концентрации 1 мМ и вновь инкубировали в течение пяти (5) ч. После инкубации клеточный осадок получали центрифугированием культуральной среды при 6000g в течение 30 мин, и осадок хранили при -70°С в течение ночи. Осадок, оттаявший на льду, суспендировали в растворе для растворения (300 мМ NaCl, 50 мМ NaH₂PO₄, 10 мМ имидазола, рН 8,0), при этом использовали 5 мл раствора для растворения на 1 г осадка. Клетки лизировали обработкой ультразвуком таким же способом, как на стадии 2, и затем центрифугировали при комнатной температуре при 10000g в течение 30 мин. Такой же объем буфера (8М мочевины, 0,1 М NaH₂PO₄, 0,01 М Трис-HCl, рН 8,0), как и осадок, добавляли к клеточному дебрису для ресуспендирования и для денатурации белков в них, и раствор суспендированного осадка обрабатывали ультразвуком для того, чтобы больше белков могло раствориться в буфере. Суспензию центрифугировали при 8000 об/мин в течение 30 мин для удаления клеточного дебриса, который не солюбилизировался в 8М мочевине. К 4 мл вышеуказанного супернатанта добавляли 1 мл смолы Ni-NTA при 4°С и встряхивали при 200 об/мин в течение 2 ч для захвата белков, включающих His-метку.

Данный супернатант, содержащий комплекс белок/Ni-NTA осторожно наносили на хроматографическую колонку (размеры: 2 см (внутренний диаметр) × 2,7 см (высота)). После оседания смолы при открытии крышки пропускали избыток буфера. Колонку промывали 20 мл буфера для создания рН среды (8М мочевины, 0,1 М NaH₂PO₄, 0,01 М Трис-HCl, рН 8,0) и затем 20 мл другого буфера (8М мочевины, 0,1М NaH₂PO₄, 0,01 М Трис-HCl, рН 6,3) для вымывания белков, которые не были специфически связаны со смолой Ni-NTA. Целевые белки, содержащие His-метку, элюировали два (2) раза 5 мл буфера с низким рН (8М мочевины, 0,1 М NaH₂PO₄, 0,01 М Трис-HCl, рН 5,9), затем четыре (4) раза 5 мл сильно кислого буфера (8М мочевины, 0,1 М NaH₂PO₄, 0,01 М Трис-HCl, рН 4,5) и затем использовали SDS-PAGE для подтверждения элюированных целевых белков с использованием 15% акриламидного геля (фиг. 7). На фигуре 7 полоса М является предварительно окрашенным маркером размера SeeBlue, и полоса 7 представляет очищенный пептид PBl₄.

Вышеуказанные очищенные белки диализовали против PBS (8 г/л NaCl, 0,2 г/л KCl, 1,44 г/л NaH₂PO₄, 0,24 г/л KH₂PO₄) для восстановления их первоначальной конформации. Использованные пробирки для диализа были с ограничением молекулярной массы 3500 Da. Во время диализа вначале в течение 5 ч использовали 3 л PBS, содержащего 2М мочевины, и затем использовали два (2) раза в течение ночи 5 л PBS без мочевины.

Стадия 3-2: гиброфобная хроматография

Гидрофобную хроматографию проводили для повышения чистоты пептида PBl₄, который получали на стадии 3-1.

Сульфат аммония постепенно добавляли до конечной концентрации, равной 20%, к раствору, содержащему пептид PBl₄, который элюировали со смолы Ni-NTA на стадии 3-1, и затем рН доводили до 7,0. Раствор выдерживали в течение трех или более часов, после того как полностью расплавилось 10% сульфата аммония, и затем раствор наносили на колонку с фенилсефарозой [наполнение: фенилсефарозная смола для быстрого элюирования (Pharmacia, Швеция); размеры колонки: 1 см (внутренний диаметр) × 3 см (высота)].

Каждую фракцию, которую элюировали из колонки пропусканием элюента (8М мочевины, 0,1 М NaH₂PO₄, 0,01 М Трис-HCl, рН 6,3) через колонку со скоростью элюента 0,5 мл/мин при обращенном градиенте сульфата аммония от 10% до 0%, наносили на гель для SDS-PAGE. Собирали фракцию, содержащую пептид PBl₄, и диализовали в буферном растворе для обессоливания, и в то же самое время удаляли мочевину, которую использовали в качестве денатурирующего агента.

Стадия 3-3: удаление His-метки

2М мочевину добавляли к буферному раствору (50 мМ NaCl, 20 мМ Трис-HCl, 2 мМ CaCl₂, рН 7,4), который был пригоден для удаления денатурирующего агента и имидазола и т.д. из очищенного His-меченого белка и также активации энтерокиназы. Диализованный пептид PBl₄, полученный на стадии 3-2, вновь диализовали с использованием указанного содержащего мочевину буфера для обессоливания пептида PBl₄, и во время чего концентрацию мочевины постепенно снижали повторным диализом против буфера с пониженным содержанием мочевины. К раствору, содержащему пептид PBl₄, в котором буфер заменяли на указанный второй буфер, добавляли 3 Е/мл энтерокиназы и инкубировали при 23°С. Раствор отбирали каждый час, затем анализировали при помощи SDS-PAGE для проверки удаления His-метки из His-меченого пептида PBl(PBl₄ ^+his).

Стадия 3-4: ионообменная хроматография

Нежелательные белки и пептиды, которые образовались в результате обработки энтерокиназой, удаляли ионообменной хроматографией.

Раствор, содержащий пептид PBl₄ ^-his, который получали на стадии 3-3, диализовали в буфере для диализа (2М мочевины, 0,1 М NaH₂PO₄, 0,01 М Трис-HCl, рН 7,0) и буфер в значительной степени обменивался. Раствор, который диализовали, наносили на смолу с DEAE-сефарозой (Phamacia, Uppsala, Швеция). Затем колонку уравновешивали буфером для уравновешивания (50 мМ натриевого фосфатного буфера, 2М мочевины, рН 7,0) и пептид элюировали в градиенте концентрации NaCl от 0 до 1М с использованием другого буфера (50 мМ натриевого фосфатного буфера, 2М мочевины, 1М NaCl)(скорость элюента: 0,5 мл/мин). Получали каждую фракцию и накапливали содержащую целевой белок фракцию. Присутствие пептида PBl₄ ^-his подтверждали с помощью SDS-PAGE после концентрирования отсеков.

Стадия 4: количественный анализ PBl₄

Очищенный пептид PBl₄, который получали таким же способом, как на стадии 3, анализировали количественно колориметрическим методом с использованием реагента ВСА для микроанализа (Pierce, Rockford, США).

Стадия 5: подтверждение свойств рекомбинантного пептида PBl₄

Чистоту пептидов PBl₄, которые выделяли на стадии 3, и их иммуногенность против антисыворотки, которую получали с использованием синтетического пептида PBl₄ в качестве антигена, определяли вестерн-блоттингом с помощью ECL (Amersham, Cleveland, Великобритания). После SDS-PAGE (пример 2, стадия 1) гель инкубировали вместе с мембраной PVDF в буфере (0,3% Трис, 1,5% глицина, 20% метанола) при постоянном напряжении 60 В в течение трех (3) ч для переноса белка с геля на мембрану PVDF. Затем блоттированную мембрану инкубировали с 5 мл блокирующего раствора (TBS, рН 7,5, 5% сухого обезжиренного молока (мас./об.), 0,02% Твин-20) в течение 1,5 ч и затем три раза промывали TTBS (забуференный Трисом физиологический раствор, содержащий 0,1% Твина-20) соответственно в течение 15 мин, 5 мин и 5 мин. Антисыворотку против пептида PBl (смотри стадию 1 в примере 2) разбавляли раствором TTBS в соотношении один (1) к пяти тысячам (5000) и затем инкубировали с мембраной в течение 1,5 ч. Для подтверждения чистоты пептида PBl₄ использовали антисыворотку против пептида PBl₄ (пример 3). После промывания геля TTBS три раза соответственно в течение 15 мин, 5 мин и 5 мин, мембрану инкубировали в течение 1,5 ч при комнатной температуре с раствором, в котором конъюгированный с щелочной фосфатазой F(ab)'₂-козий антимышиный IgG (Н+L) (Zymed, San Fransisco, CA) разбавляли раствором TTBS в соотношении один (1) к одной тысяче (1000). Мембрану вновь промывали три раза TTBS и затем окрашивали при добавлении BCIP/NBT (5-бром-4-хлор-3-индолил фосфата/нитросинего тетразолия (Sigma)). Раствор BCIP/NBT удаляли с использованием раствора TTBS после окрашивания. В результате вестерн-блоттинга экспрессированный пептид PBl₄ можно было распознать с помощью анти-PBl₄-сыворотки.

В случае ECL, мембрану PVDF (Gelman Science, BioTrace^R) использовали вместо нитроцеллюлозной мембраны. Кроме того, первые антитела использовали в соотношении один (1) к десяти тысячам (10000) и HRP-конъюгированный кроличий антимышиный IgG (Pierce, Rockford, IL, США) использовали в качестве вторых антител в соотношении один (1) к десяти тысячам (10000). 1 мл раствора А реагента для вестерн-блоттинга ECL+Plus (Amersham) на 25 мл раствора В использовали в цветной реакции. Когда окраска в достаточной мере развивалась, мембрану вставляли в пленочную кассету соответственно на 5, 10, 20 и 30 сек для воздействия пленки, чтобы полосы на геле можно было детектировать (фиг 8). На фигуре 8 полоса М является ECL детектирующей меткой (Gibco BRL), и полоса 1 представляет пептид PBl₄. Как следует из фиг. 8, экспрессированный пептид PBl₄ можно было распознавать с помощью анти-PBl₄-сыворотки.

Кроме того, вестерн-блоттинг, при котором пептид PBl₄ с использованием поликлональных антител, выделенных из кроличьей сыворотки, при применении колонки с белком G (Bio-Rad, США) давал те же результаты.

Пример 5: получение мышиных анти-пептид PBl₄-антител

Использованный в данном случае пептид PBl₄ представлял пептид PBl₄ ^-his, из которого была удалена his-метка на стадии 3-3 примера 2.

Стадия 1: лигирование пептида PBl₄ и OVA

В качест