Антитело, селективное в отношении рецептора лиганда, индуцирующего апоптоз и связанного с фактором некроза опухоли, и его применение

Антитело, селективное в отношении рецептора лиганда, индуцирующего апоптоз и связанного с фактором некроза опухоли, и его применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Предисловие

В соответствии с настоящей заявкой заявляется преимущество предварительной заявки номер 60/346 402, поданной 1 ноября 2001 г, и испрашивается приоритет по РСТ/US01/14151, поданной в мае 2001 г., которая в настоящее время находится на рассмотрении. В соответствии с РСТ/US01/14151 заявляется преимущество временной заявки номер 60/201 344, поданной 2 мая 2000 г. Заявки, преимущество которых заявляется в соответствии с настоящей заявкой, приведены полностью в качестве ссылок в данном описании.

Настоящее изобретение было сделано при поддержке правительственного гранта NCI P50 CA 89019-01, предоставленного Национальным Институтом по изучению злокачественных опухолей, и при поддержке гранта NIH R03-AR44982, предоставленного Национальным Институтом по изучению артрита и скелетно-мышечных и кожных заболеваний (National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases). Правительство обладает определенными правами на настоящее изобретение.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к антителу, которое способно специфически связываться с одним типом ассоциированного с фактором некроза опухоли (далее называемым как TNF) рецептора лиганда, индуцирующего апоптоз (далее называемого как TRAIL), более конкретно, настоящее изобретение относится к моноклональному антителу, которое индуцирует in vivo и in vitro апоптоз клеток, экспрессирующих один тип рецептора, и к способам лечения на его основе.

Предпосылки создания изобретения

TRAIL представляет собой член семейства белков TNF, которое включает в себя TNF-α и Fas-лиганд [1]. Указанные белки являются индукторами апоптоза. К настоящему времени идентифицировано пять рецепторов TRAIL, два из которых, DR4 (TRAIL-R1) и DR5 (TRAIL-R2), способны к передаче апоптозного сигнала [2-7], тогда как другие три, DcR1 (TRAIL-R3), DcR2 (TRAIL-R4) и остеопротегерин (OPG), не способны к передаче апоптозного сигнала [8-12]. Все пять рецепторов для TRAIL характеризуются наличием существенной гомологии во внеклеточных доменах, связывающихся с лигандом. Аналогично Fas и рецептору-I TNF (далее называемому как TNFRI), внутриклеточные сегменты DR4 и DR5 содержат домен гибели и передают апоптозный сигнал по механизму, в котором участвуют ассоциированный с Fas белок, содержащий домен гибели (далее называемого как FADD), и каспазы 8 [6, 7]. В дополнение к передаче апоптозного сигнала рецепторы DR4 и DR5 могут также активировать путь, вовлекающий NFkb [6, 7].

Было показано, что биологические функции TRAIL включают его способность селективно индуцировать апоптоз трансформированных опухолевых клеток, тогда как нормальные остаются относительно устойчивыми к TRAIL-опосредованному апоптозу [13-15]. Указанная селективность позволяет предполагать, что, в отличие от Fas-лиганда, введение TRAIL сопровождается очень низким уровнем токсичности, как было показано при системном введении TRAIL животным моделям без индукции значительной токсичности [13]. Так, было сделано предположение о том, что TRAIL является мощным средством, индуцирующим апоптоз, которое может стать подходящим лекарственным средством для лечения злокачественных опухолей и других заболеваний, ассоциированных с аномальной пролиферацией клеток. Было также высказано предположение о том, что TRAIL является мощным апоптоз-индуцирующим средством, которое может стать подходящим лекарственным средством для лечения аутоиммунных и воспалительных заболеваний. Было показано, что TRAIL-опосредованный апоптоз участвует в индуцируемой активацией гибели Т-клеток, выполняя, таким образом, функцию механизма, альтернативного Fas-лиганду [16, 17]. TRAIL-опосредованный апоптоз может также действовать в плане индукции апоптоза Т-клеток и других воспалительных клеток [18] и играть роль в активности NK-клеток по уничтожению клеток [19-21] и в иммуномодулирующей функции дендритных клеток [22, 23]. Так, TRAIL-опосредованный апоптоз может также функционировать при иммунокомпетентности (immunoprivilege) и иммунном контроле.

Рецепторная система для TRAIL является сложной и включает по меньшей мере два рецептора, вызывающих гибель клеток, DR4 и DR5, и по меньшей мере два неапоптозных рецептора, DcR1 и DcR2. Все указанные рецепторы не только характеризуются гомологией с точки зрения сходства аминокислотной последовательности, но также демонстрируют аналогичную связывающую аффинность в отношении TRAIL [2-12]. Способность рецепторов DcR1 и DcR2 конкурировать за связывание с TRAIL без индукции апоптоза дает основание полагать, что они могут действовать в качестве ложных рецепторов, блокирующих или модулирующих активность TRAIL-лиганда. Кроме того, имеется сообщение о том, что нетрансформированные клетки экспрессируют более высокие уровни ложных рецепторов, чем это делают трансформированные клетки. Таким образом, было высказано предположение о том, что дифференцированная модуляция экспрессии рецепторов, вызывающих гибель клеток, и ложных рецепторов может представлять собой ключевой механизм, который определяет чувствительность клеток к TRAIL-опосредованному апоптозу, в случае отсутствия специфичных к рецептору антител [2]. Несмотря на то что экспрессия и функционирование DR4 и DR5 интенсивно изучались, прогресс сдерживался недостатком моноклональных антител, специфичных к рецептору. Относительно экспрессии DR5 на клеточной поверхности нет опубликованных данных. Сообщалось о том, что была получена совокупность антител к рецептору TRAIL, которые способны индуцировать апоптоз в клетках меланомы in vitro, но только при иммобилизации антител, которая усиливает их сшивку и в ряде случаев требуется культивирование клеток с актиномицином D [24]. Было получено несколько антител против DR5 [24]. Однако ранее полученные моноклональные антитела против DR5 обладают низкой активностью по индукции апоптоза in vitro даже в условиях наличия поперечных сшивок. При этом отсутствуют сообщения об их активности in vivo. Указанные антитела не использовались для изучения экспрессии рецепторов TRAIL на клеточной поверхности [24]. Таким образом, имеется потребность в моноклональном антителе, селективном для данного специфического рецептора TRAIL, которое не только было бы способно связываться с рецептором клеточной поверхности, но также могло в значительной мере индуцировать апоптоз в различных типах аномальных клеток, включая опухолевые клетки, как in vivo так и in vitro, без потребности в сшивании или иммобилизации. Такое антитело могло бы не только представлять собой потенциальное терапевтическое средство, но также стать диагностическим инструментом для проведения функционального анализа рецептора TRAIL. Таким образом, существует определенная потребность в антителе, специфичном к каждому из рецепторов DR4 и DR5, способных индуцировать гибель клеток.

При развитии или прогрессировании многих заболеваний часто имеют место случаи, когда клетки не удаляются. При многих аутоиммунных заболеваниях и воспалительных состояниях выживающие активированные клетки атакуют нормальные ткани или клетки. Далее прогрессирование опухолегенеза и формирование пролиферативного состояния при ревматоидном артрите характеризуется отсутствием контроля пролиферации клеток. Таким образом, недостаточный апоптоз приводит к развитию заболевания, а варианты использования лиганда, индуцирующего апоптоз, или агонистического моноклонального антитела, усиливающего апоптоз, рассматриваются как потенциальные терапевтические подходы для устранения таких нежелательных клеток.

Так, например, ревматоидный артрит (называемый в описании РА) представляет собой распространенное аутоиммунное заболевание человека. В настоящее время представление о патофизиологии РА сводится к тому, что аутоиммунные Т-клетки и В-клетки инициируют воспалительную реакцию в суставах, которая ведет к гиперпролиферации синовиоцитов. Вследствие гиперпролиферации синовиальных клеток металлопротеиназы (называемые в описании как «МП») образуются в избыточных количествах, что ведет к характерной для РА эрозивной деструкции хряща и кости [25]. Таким образом, контроль гиперпролиферации синовиальных клеток при воспалении является ключевой стадией при лечении РА. Молекулярные механизмы, ведущие к гиперпролиферации синовиальных клеток, все еще неизвестны. Хотя гиперпролиферирующие синовиальные клетки не являются злокачественными и не являются трансформированными, в ряде исследований высказывалось предположение о том, что они характеризуются некоторыми общими особенностями с трансформированными клетками [46]. Указанные клетки, так называемые «синовиоциты, похожие на трансформированные», характеризуются наличием плотного шероховатого эндоплазматического ретикулюма, многочисленными ядрами неправильной формы и изменениями нормальной веретенообразной формы клеток. Было высказано предположение, что включение онкогенов и генов вирусного происхождения может быть первичным механизмом запуска появления трансформированной формы синовиальных клеток при РА [46].

По меньшей мере два аспекта, свойственные РА, позволяют предположить, что нерегулируемый апоптоз может вносить определенный вклад в развитие заболевания и что изучение возможностей терапевтического применения апоптоза может стать эффективным способом лечения: недостаточное удаление активированных Т-клеток дает основание предполагать наличие дефекта в пути уничтожения указанных Т-клеток, индуцированных активацией, который представляет собой процесс, вовлекающий Fas-опосредованный апоптоз и TRAIL-опосредованный апоптоз, а гиперпролиферативная природа синовиальных клеток при РА представляет собой фактор, действующий на более поздних стадиях патофизиологии РА. Фактически было показано, что введение антитела против Fas в воспаленный сустав подавляет развитие хронического артрита у трансгенных мышей tax, которые представляют собой модель животных для изучения РА человека [26]. Более того, локализованная трансдукция гена fas-ligand с помощью аденовирусного вектора является эффективной с точки зрения профилактики артрита, вызванного коллагеном [27]. В обоих случаях наблюдается подавление пролиферации воспаленных синовиальных клеток за счет усиления Fas-опосредованного апоптоза. Хотя Fas-лиганд является сильным индуктором апоптоза в синовиальных клетках при РА, применение апоптоза, опосредованного Fas-лигандом, для лечения людей ограничено его летальной гепатотоксичностью. Таким образом, апоптоз, индуцированный рецептором TRAIL, представляет более безопасный и более эффективный терапевтический подход для лечения РА, чем апоптоз, индуцированный Fas-лигандом. Апоптоз, индуцированный рецептором TRAIL, также представляет более безопасный и более эффективный терапевтический подход для лечения злокачественной опухоли, чем апоптоз, индуцированный Fas-лигандом. Известно, что TRAIL-опосредованный апоптоз специфически индуцирует апоптоз трансформированных опухолевых клеток, не затрагивая нормальные клетки. Было показано, что системное введение тримеризованного растворимого TRAIL не вызывает токсичности у экспериментальных животных, когда он уже обладает способностью индуцировать регрессию имплантированных опухолей [13, 28]. Его потенциал в качестве средства для вспомогательной терапии в традиционных курсах лечения был пересмотрен в свете последних результатов, согласно которым экспрессия DR5 и чувствительность к TRAIL-индуцированному апоптозу клеток рака молочной железы усиливается при облучении, что дает основание полагать, что в случае объединения с облучением эффективность TRAIL может быть усилена при терапии злокачественной опухоли [29].

Кроме того, ген, кодирующий TRAIL-рецептор DR5, был картирован на хромосоме в локусе 8p21-22, который отличается высокой частотой мутации в некоторых злокачественных клетках [30]. Имеются сообщения о том, что по меньшей мере два вида опухолевых клеток, мелкоклеточный рак легкого [31] и рак головы и шеи [32], демонстрируют мутации в домене гена DR5, связанном с уничтожением клеток. Таким образом, в рамках исследования злокачественной опухоли существует потребность в антителе против DR5 для определения эффекта вариаций в эпитопе рецептора на развитие и прогрессирование злокачественной опухоли. Далее, функциональная значимость мутаций TRAIL-рецептора могла бы обеспечить полезный инструмент для клинической диагностики, а в сочетании с другими биологическими маркерами использоваться для ранней диагностики злокачественной опухоли и прогнозирования агрессивности опухоли.

Краткое описание сущности изобретения

В одном варианте настоящее изобретение относится к антителу, которое распознает TRAIL-рецептор DR5 и которое индуцирует апоптоз DR5-экпрессирующей клетки in vivo или in vitro. Далее описывается антитело, которое распознает DR5, но не DR4, DcR1 или DcR2. Конкретно, подробно описывается моноклональное антитело DR5, продуцируемое гибридомой.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к антителу, которое распознает TRAIL-рецептор DR4 и которое индуцирует апоптоз DR4-экпрессирующей клетки in vivo или in vitro. Далее описывается антитело, которое распознает DR4, но не DR5, DcR1 или DcR2. Конкретно подробно описывается моноклональное антитело DR4, продуцируемое гибридомой.

Предлагаемый способ представляет собой индукцию апоптоза в целевых клетках или ингибирование пролиферации целевой клетки путем контакта клетки с терапевтическим количеством антитела, способного связываться с DR5 или DR4. В различных вариантах реализации указанного способа апоптоз может быть индуцирован или пролиферация клеток может быть подавлена путем контакта целевых клеток с обоими видами антител.

Описывается также фармакологическая композиция, которая включает терапевтическое количество моноклонального антитела, активного против DR5 или DR4, фармацевтически приемлемый носитель и необязательно контейнер, включающий указанное антитело и носитель. Далее в изобретении предлагается использование антитела, распознающего DR5, или антитела, распознающего DR4, для изготовления лекарственного средства, применяемого с целью селективного апоптоза аномальных или нерегулируемых клеток.

Антитело по настоящему изобретению взаимодействует с индуцирующим апоптоз рецептором лиганда, связанным с фактором некроза опухоли, таким как DR4, DR5, DrR1, DrR2 или OPG, индуцирующим апоптоз в клетке, экспрессирующей такой рецептор. Описываемое в настоящем изобретении антитело представляет собой антитело, способное селективно связываться с эпитопом рецептора лиганда агонистического или антагонистического фактора некроза опухоли.

Настоящее изобретение относится к лечению связанного с апоптозом заболевания, такого как злокачественная опухоль, воспалительное заболевание или аутоиммунное заболевание, с использованием способа, который включает контактирование целевой ткани, подверженной заболеванию, с терапевтическим количеством антитела по настоящему изобретению, одним или в сочетании с другими антителами, индуцирующими апоптоз, и/или другими терапевтическими средствами или видами лечения.

Далее описывается белок слияния, который включает аминокислотную последовательность антигенного рецептора TRAIL, содержащего по меньшей мере десять оснований, связанных с иммуноглобулиновым белком или его фрагментом, способным вызывать иммунную реакцию у субъекта.

Настоящее изобретение относится к способу генной терапии, при которой целевая клетка подвергается трансфекции последовательностью нуклеиновой кислоты для рецептора TRAIL, включенной в вектор экспрессии, таким образом, что указанный TRAIL-рецептор экспрессируется на целевой клетке. Затем целевая клетка подвергается воздействию антитела, которое селективно связывает TRAIL-рецептор.

В соответствии с изобретением предлагаются разработанные последовательности нуклеиновой кислоты и аминокислотные последовательности, кодирующие тяжелую и легкую цепь иммуноглобулинов антитела, селективного для DR5. Предлагаются также последовательности для антитела, которые селективно связываются с DR4. Далее подробно описываются также векторы, которые включают последовательность нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению и трансформированные клетки-хозяева, содержащие такой вектор по настоящему изобретению.

Настоящее изобретение относится к гуманизированному антителу DR5 (то есть TRA-8) и гуманизированному DR4 (то есть 2E12), а также к трансфицированной клетке, продуцирующей гуманизированное антитело DR5, и трансфицированной клетке, продуцирующей гуманизированное антитело DR4.

Описывается также способ получения гуманизированного антитела DR5 или антитела DR4, при котором клетка-хозяин трансформируется последовательностями нуклеиновой кислоты, кодирующими легкую цепь гуманизированного иммуноглобулина и тяжелую цепь гуманизированного иммуноглобулина, после чего трансформированную клетку-хозяин инкубируют в течение заданного периода времени.

В изобретении также описывается способ индукции апоптоза в целевых клетках или подавления пролиферации клеток, который включает контактирование целевой клетки с фармацевтически эффективным количеством гуманизированного антитела DR5, гуманизированного антитела DR4 или их сочетания, в присутствии или в отсутствие других терапевтических средств и режимов лечения.

Предлагается коммерческий набор для индукции апоптоза, который включает гуманизированное антитело TRA-8, селективное для DR5, или гуманизированное антитело, селективное для DR4 (например, гуманизированное 2Е12), упакованные в подходящий контейнер и, необязательно, при наличии инструкции по использованию.

Краткое описание чертежей

Фиг.1. Характеристика TRA-8. (a) Специфичность по связыванию TRA-8: Результат анализа по методу вестерн-блоттинга (верхний план): Рекомбинантные слитые белки из семейства TNFR с зондом в виде TRA-8 или антитела против человеческого IgG. Линия 1: Слитый белок DR5/hIgG1 (иммуноген): Линия 2: DR4/hIgG1 (TRAIL-R1); Линия 3: DR5/hIgG1; Линия 4: TRAIL-R3 (DcR-1)/hIgG1; Линия 5: TRAIL-R4 (DcR-2)/hIgG1; Линия 6: CD95/hIgG1; Линия 7: растворимый TNFRI. Результат анализа по методу ELISA (нижний план): Номера лунок обозначают варианты вестерн-блоттинга за исключением лунки 8, которая представляет собой слитый белок мышиного DR5/hIgG1. (b) Связывающая активность TRAIL и TRA-8 в отношении DR5 и DR4: на планшеты для ELISA наносят DR5/hIgG1 (левый план) или DR4/hIgG1 (средний план) и затем инкубируют с TRAIL или TRA-8. (c) Анализ по методу проточной цитометрии экспрессии DR5 на клеточной поверхности. Cos-7 клетки трансфицируют вектором экспрессии pcDNA3, содержащим кДНК DR5 полной длины (гистограмма со сплошными линиями), кДНК DR4 (открытая гистограмма, сплошная линия) или пустой вектор (открытая гистограмма, пунктирная линия). Через сорок восемь часов после трансфекции клетки окрашивают TRA-8 и затем подвергают воздействию антитела против мышиного IgG1, конъюгированной с ФЭ. (d) Иммуногистохимическая реактивность in situ для DR5. Цитоспиновые слайды Cos-7 клеток, трансфицированных экспрессируемым DR5 или контрольным вектором, окрашивают TRA-8 через сорок восемь часов после трансфекции. (е) Активность TRA-8 по уничтожению клеток: Клетки Jurkat инкубируют с указанными концентрациями TRA-8. Жизнеспособность клеток определяют методами ATPLite, MTT и по исключению PI после культивирования в течение ночи. Результаты тестов ATPLite и MTT представлены в виде процента от значения контроля, представляющего собой среду, и результаты теста PI представлены в виде процента от значения PI для отрицательных клеток. (f) Результаты вестерн-блоттинг-анализа активации каспазы: Клетки Jurkat инкубируют с 500 нг/мл TRA-8 в течение указанного периода времени. Клеточные лизаты разделяют электрофорезом в 15% ДСН-ПААГ, проводят блоттинг и подвергают воздействию зондов с антителами к каспазе. Стрелки указывают расщепленные субъединицы каждой каспазы. (g) Тест на ингибирование каспазы: Клетки Jurkat инкубируют с 50 нг/мл TRA-8 в течение ночи в присутствии различных концентраций указанных ингибиторов каспазы. Жизнеспособность клеток оценивают по методу ATPLite.

Фиг.2. Экспрессия DR5 на клеточной поверхности и чувствительность к DR5-опосредованному апоптозу. Выделяют из свежей периферической крови нормальные T- и B-клетки, клеточные линии, включающие T-клетки (a и a'), глиомные клетки (b и b'), клетки рака предстательной железы (c) и B клетки (d), и инкубируют с TRA-8 или контрольным антителом IgG1 изотипа мышей, после чего вносят конъюгированное с ФЭ козье антитело против мышиного IgG1. Открытые гистограммы обозначают изотип контрольного антитела, тогда как жирные гистограммы обозначают окрашивание под действием TRA-8. Апоптоз определяют по методу ATPLite после ночной инкубации с растворимым TRAIL (открытые кружки) или TRA-8 (зачерненные кружки), как показано для а, b' и d.

На фиг.3a' показан результат инкубирования Т-клеточной линии U937 с TRA-8 или мышиным контрольным антителом IgG1 изотипа. Апоптоз определяют по методу ATPLite после ночного инкубирования с растворимым TRAIL (открытые кружки) или TRA-8 (зачерненные кружки).

На фиг.3 показаны клеточные линии глиомы (b) и рака предстательной железы (c), инкубируемые с TRA-8 или мышиным контрольным антителом IgG1 изотипа. Апоптоз определяют по методу ATPLite после инкубирования в течение ночи с растворимым TRAIL (открытые кружки) или TRA-8 (зачерненные кружки).

На фиг.4 показана серия графиков, характеризующих жизнеспособность человеческих клеток Jurkat после экспозиции с указанными концентрациями (А) антитела, штаммов TRA-1, -8 и -10 и (В) TRAIL в присутствии фиксированных концентраций штаммов антитела по настоящему изобретению, отраженных на фиг.4А.

Фиг.5. Экспрессия DR5 в нормальных тканях и тканях злокачественных опухолей: гомогенаты нормальной ткани и ткани злокачественной опухоли анализируют с TRA-8 в качестве зонда и анализируют по хемилюминесценции. (а) Анализ по методу вестерн-блоттинга белка DR5 в нормальных тканях: линия 1: печень, линия 2: мозг, линия 3: легкое, линия 4: почка, линия 5: селезенка, линия 6: яички, линия 7: яичник, линия 8: сердце, линия 9: поджелудочная железа. (b) Анализ по методу вестерн-блоттинга белка DR5 в тканях злокачественных опухолей. Анализируют с помощью зонда блот из ткани злокачественной опухоли, содержащей раковые клетки яичника (линия 1), легкого (линия 2), печени (линия 3), прямой кишки (линия 4), шейки матки (линия 5), кожи (линия 6), яичек (линия 7), щитовидной железы (линия 8), матки (линия 9), желудка (линия 11), области глотки и пищевода (линия 12) и поджелудочной железы (линия 13). Показана иммуногистохимия in situ нормальных человеческих тканей (с) и тканей злокачественных опухолей (d). Замороженные среды подвергают иммунному окрашиванию с использованием TRA-8.

Фиг.6 Активность TRA-8 по эпилигнации опухолевых клеток. Мышам SCID инокулируют подкожно 1321N1 клетки. Мышам инъецируют внутривенно однократную дозу 100 мкг TRA-8 на второй день после инокуляции опухоли (a) или три дозы 100 мкг TRA-8, начиная с седьмого дня после инокуляции опухоли (b). Рост опухоли определяют по весу и проводят ее гистологический анализ с использованием H&E окрашивания. На фотографиях показан рост жизнеспособной опухоли у контрольных мышей и его отсутствие у мышей, которым был введен TRA-8 (с, верхний план) и при H&E окрашивании опухоли (с, нижний план). Мышам SCID инъецируют внутривенно 10⁶ клеток Jurkat и на второй день после инъекции вводят однократную дозу TRA-8. Через семь дней отбирают клетки селезенки, окрашивают антителом против человеческого CD3 и анализируют методом проточной цитометрии (d.) или иммуногистохимическим методом (е).

На фиг.7 показана экспрессия на клеточной поверхности DR5 при РА (А) и ОА (В) в синовиальных клетках. 1Х10⁶ первичных культивированных синовиальных клеток окрашивают очищенным аффинной хроматографией TRA-8 и затем обрабатывают ФЭ-конъюгированным козьим антителом против мышиного IgG1. Флуоресценцию 10000 жизнеспособных клеток анализируют с использованием FACSvantage.

На фиг.8 показана серия фотографий, демонстрирующих жизнеспособность клеток как функцию концентрации TRAIL и TRA-8, индуцирующих апоптоз репрезентативных штаммов РА (А) и ОА (В) синовиальных клеток с разными концентрациями рекомбинантного растворимого TRAIL (открытые кружки) или очищенного аффинной хроматографией TRA-8 (зачерненные кружки). Жизнеспособность клеток выражают в виде процента значения имп/мин для обработанных клеток относительно значения ипм/мин для необработанных клеток.

На фиг.9 представлена серия фотографий, демонстрирующих зависимость от каспазы DR5-опосредованного апоптоза синовиальных клеток при РА. Синовиальные клетки при РА (RA512) инкубируют с 50 нг/мл растворимого лиганда Fas (открытые квадраты) и антителом против Fas (CH-11) (зачерненные квадраты), растворимым TRAIL (открытые кружки) или антителом против DR5 (TRA-8) (зачерненные кружки) в присутствии варьирующих концентраций ингибиторов каспазы. После ночного культивирования определяют жизнеспособность клеток по методу ATPLite.

На фиг.10А приведены результаты гель-электрофореза, указывающие на активацию NFκb. RА1016-клетки инкубируют с 20 нг/мл TNF-a, 50 нг/мл растворимого TRAIL или 50 нг/мл TRA-8 в указанные временные точки перед проведением электрофореза.

На фиг.10В и С приведены графики, демонстрирующие уровень образования MMP-1 и MMP-3. 1·10⁶/мл указанных синовиальных клеток при РА инкубируют с указанными концентрациями TNF-a (открытые кружки), TRAIL (открытые треугольники) или TRA-8 (зачерненные кружки). После ночного культивирования собирают супернатанты из культуральной среды. Уровень ММР в культуральных супернатантах определяют по методу ELISA.

На фиг.11 показано, что TRA-8 не индуцирует токсичность для клеток печени. (а) Нормальные ткани печени не экспрессируют DR5. Парафиновые срезы двух нормальных печеночных тканей, одной ткани карциномы клеток печени и цитоспиновый препарат клеток HepG2 подготавливают для окрашивания H&E и соответствующие замороженные среды окрашивают с использованием TRA-8. (b) Методом проточной цитометрии анализируют наличие экспрессии DR5 на клеточной поверхности. Гепатоциты, выделенные из двух нормальных печеночных тканей, из одного варианта ткани карциномы печени и клетки HepG2 окрашивают TRA-8, антителом против Fas (DX2) или изотипом контрольного антитела. Жирная гистограмма указывает окрашивание под действием TRA-8 или DX2, и открытая гистограмма соответствуют контрольным изотипам.

На фиг.12 показано, что TRAIL, но не TRA-8 индуцирует токсичность для клеток печени. Свежие нормальные гепатоциты человека поддерживают в культуральной среде для гепатоцитов. (а) Апоптоз гепатоцитов индуцируют с помощью 1 мкг/мл растворимого TRAIL плюс сшиватель или TRA-8 в указанные временные точки. Жизнеспособность клеток определяют методом ATPLite. Результаты представлены в виде процента уровня жизнеспособных клеток относительно контроля, представляющего собой среду. Затененные прямоугольники показывают TRAIL, а черные прямоугольники показывают TRA-8. (b) Конденсированные ядра гепатоцитов окрашивают Hoechst 33352 и анализируют методом проточной цитометрии. (c) Эффект циклогексимида на апоптоз гепатоцитов. Гепатоциты культивируют в контрольной среде или с добавлением 1 мкг/мл TRAIL или TRA-8 в присутствии (закрытые прямоугольники) или в отсутствие (открытые прямоугольники) 1 мкг/мл циклогексимида в течение 8 часов. Жизнеспособность клеток определяют по методу ATPLite. Результаты представлены в виде среднего значения ±СКО (SEM) для трех повторов культур в двух экспериментах. (d) Сравнение чувствительности нормальных гепатоцитов к DR5 и Fas-опосредованному апоптозу. Свежевыделенные гепатоциты инкубируют с указанными концентрациями растворимого TRAIL, TRA-8, растворимого FasL или анти-Fas мАт (mAb) CH11 в течение 6 часов. Жизнеспособность клеток определяют по методу ATPLite. Результаты представлены в виде процента жизнеспособных клеток относительно контроля, представляющего собой среду. В случае нормальных гепатоцитов представлены средние данные ±СКО для четырех нормальных индивидуумов. Результаты по клеткам карциномы печени от одного пациента и по клеткам HepG2 представлены в виде среднего значения результатов исследования культур в тройном повторе.

Фиг.13. Показано, что TRAIL индуцирует гепатит. Мышам В6 внутривенно инокулируют 10⁹ БОЕ аденовирусного вектора, кодирующего человеческий TRAIL полной длины, под контролем элемента транскрипции «Тет-он». Экспрессия TRAIL индуцируется указанными дозами тетрациклина. (а) Анализ по методу нозерн-блоттинга экспрессии человеческого TRAIL в печени. Через 24 часа после инокуляции вектора и индукции тетрациклином из печени выделяют суммарную РНК и подвергают воздействию зондом кДНК человеческого TRAIL или β-актина. (b) Сывороточный уровень АСТ. Через 24 часа после трансдукции TRAIL определяются сывороточные уровни ACT (AST). (c) TRAIL-опосредованная гибель клеток гепатоцитов, инфицированных аденовирусным вектором: мышам В6 внутривенно инокулируют индуцируемый тетрациклином аденовирусный вектор. Через 48 часов после инокуляции выделяют гепатоциты из инокулированных мышей и контрольных неинокулированных мышей и инкубируют с указанными концентрациями TRAIL в течение 8 часов (левый план). Жизнеспособность гепатоцитов определяют по методу ATPLite. Мышам, которым инокулировали указанный выше аденовирусный вектор, через 48 часов внутривенно вводят 10 мкг растворимого человеческого TRAIL. Через 24 часа после инъекции TRAIL (правый план) измеряют сывороточный уровень ACT. (d и e) Гистологический анализ повреждения печени, индуцированного TRAIL. Печень отбирают через 24 часа (d) или 7 дней (е) после трансдукции TRAIL. Парафиновые срезы окрашивают по методу H&E и фотографируют с увеличением ×100 (верхний план) и ×400 (нижний план).

На фиг.14 приведена серия фотографий, из которых следует, что активированные Т-клетки и В-клетки, выделенные и очищенные из человеческих PBMC, экспрессируют повышенный уровень DR5, по результатам измерения методом проточной цитометрии покоящихся (не заштрихованные) и активированных (затененные) клеток.

Фиг.15 представляет собой график, показывающий жизнеспособность клеток как функцию концентрации TRA-8, для очищенных Т-клеток и В-клеток, изображенных на фиг.14, которые были стимулированы в течение 48 часов под действием анти-CD3 или анти-μ, активированных бластных клеток различной плотности, собранных с использованием Ficoll-Paque. Жизнеспособность клеток определяют по методу ATPLite.

Фиг.16 представляет собой гистограмму и график, построенный по результатам исследования методом проточной цитометрии экспрессии CD3 в отсортированной популяции лимфоцитов мышей NOD/SCID с недостаточностью NK-клеток, которым были инъецированы РВМС и TRA-8 или IgG (контроль).

На фиг.17 показаны микрофотографии клеток, окрашенных CD3 и по методу TUNEL, взятых из ткани селезенки мышей, описанных более подробно в примере 13.

На фиг.18 приведены графики цитотоксичности для случая хронического лимфолейкоза (ХЛЛ, CCL) и для нормальных В-клеток человека в присутствии TRA-8, BISVIII и их сочетания.

На фиг.19А показано специфичное связывание 2Е12 с DR4. На пластинки для проведения ELISA наносят растворимую форму слитых белков рецептора человеческого TRAIL, человеческого IgG1 Fc, как показано, и инкубируют с указанными концентрациями мАт 2Е12 и затем с ПХ-конъюгированным антителом против мышиного IgG1. Реакция проходит при использовании субстратного буфера TMB, и значения ОП измеряют при длинах волн 450/650 нМ.

На фиг.19В показано связывание 2Е12 с DR5 на клеточной поверхности. Cos-7 клетки трансфицируют вектором, содержащим кДНК для DR4 полной длины (жирная гистограмма) или контрольный вектор (открытая гистограмма). Трансфицированные клетки окрашивают 10 мкг/мл 2Е12 и ФЭ-конъюгированным антителом против мышиного IgG1. Клетки анализируют по методу проточной цитометрии.

На фиг.19С показана апоптоз-индуцирующая активность 2Е12. Клетки лимфомы человека Ramos B инкубируют в течение ночи с указанной концентрацией 2Е12 в присутствии 2 мкг/мл антитела против мышиного IgG1. Жизнеспособность клеток определяют по методу ATPLite. (D) Активация каспазы индуцируется добавлением 2Е12. Клетки Ramos обрабатывают 2Е12 и антителом против мышиного IgG в указанные временные точки. Активацию каспазы и расщепление под действием PARP определяют вестерн-блот-анализом с использованием специфических антител к каспазе или PARP.

На фиг.20 показан эффект 2Е12 и адриамицина у бестимусных мышей nude, содержащих ксенотрансплантаты рака молочной железы. Клетки 2LMP (3·10⁷) инъецируют подкожно бестимусным мышам nude на день 0. Двум группам мышей инъецируют внутрибрюшинно 200 мкг 2Е12 в дни 7, 10, 14, 17, 21 и 24. Две группы мышей получают в/в адриамицин (6 мг/кг) в дни 8, 12 и 16. Одной группе мышей вводят антитело. Полученные результаты выражают в виде среднего значения изменений размеров опухоли относительно ее размера на день 7 (n=8 мышей/группу).

На фиг.21 показан эффект TRA-8, 2Е12 и адриамицина у бестимусных мышей nude, содержащих ксенотрансплантаты рака молочной железы. Клетки 2LMP (3·10⁷) инъецируют подкожно (п/к) бестимусным мышам nude на день 0. Двум группам инъецируют внутрибрюшинно (в/б) 200 мкг TRA-8 и 2Е12 в дни 7, 10, 14, 17, 21 и 24. Двум группам мышей вводят внутривенно (в/в) адриамицин (6 мг/кг) в дни 8, 12 и 16. Одной группе мышей не вводят антитело. Полученные результаты выражают в виде среднего значения изменений размеров опухоли относительно ее размера на день 7 (n=8 мышей/группу).

На фиг.22А показаны результаты анализа методом проточной цитометрии экспрессии DR5 на клеточной поверхности на плане клеточных линий рака молочной железы человека. Клетки рака молочной железы собирают с использованием ЭДТА и окрашивают с использованием 10 мкг/мл мАт TRA-8 в течение 1 часа при температуре 4°С и затем обрабатывают ФЭ-конъюгированным козьим антителом против мышиного IgG с последующим анализом с использованием флуоресцентного клеточного сортировщика FACScan и программного обеспечения CellQuest. Жирные линии гистограммы показывают наличие окрашивания под действием TRA-8, а тонкие линии гистограммы указывают на результаты инкубации с контрольным мышиным антителом IgG1 изотипа.

На фиг.22В показана цитотоксичность TRA-8 для клеточных линий рака молочной железы человека. Клетки обрабатывают трипсином и вновь высевают на планшеты с плотностью 1000 клеток/лунку в 96-луночном планшете. После посева клеток добавляют антитело TRA-8 и проводят инкубацию в течение 24 часов при 37°С. Жизнеспособность клеток оценивают через 24 часа после добавления TRA-8 с использованием теста ATPLite. Определяют уровень АТФ относительно необработанных контрольных клеток в виде среднего значения и СКО для 2-3 определений в независимых экспериментах, выполненных в тройном повторе.

На фиг.23А показана цитотоксичность сочетанной обработки с использованием TRA-8 и адриамицина для клеточных линий рака молочной железы человека. Клетки (1000/лунка) подвергают воздействию различной концентрации адриамицина в течение 24 часов при 37°С, начиная с точки 24 часа после высева клеток. Через 24 часа после добавления адриамицина вносят TRA-8 и определяют уровни АТФ еще через 24 часа. Определяют среднее значение и величину СКО для тройных повторных определений, выполненных в ходе 2-4 независимых экспериментов, и выражают их относительно результатов, полученных для необработанных контрольных клеток.

На фиг.23B показана цитотоксичность для клеточных линий рака молочной железы человека сочетанной обработки TRA-8 и паклитакселом. Клетки (1000/лунка) подвергают воздействию различных концентраций паклитаксела в течение 24 часов при 37°С, начиная с точки 24 часа после высева клеток. Через 24 часа после внесения паклитаксела добавляют TRA-8 и еще через 24 часа определяют уровни АТФ. Определяют среднее значение и величину СКО для тройных повторных определений, выполненных в ходе 2-4 независимых экспериментов, и выражают их относительно результатов, полученных для необработанных контрольных клеток.

На фиг.24 показан эффект TRA-8 на рост опухоли у бестимусных мышей nude, содержащих установленные ксенотрансплантаты линии рака молочной железы человека 2LMP. Клетки 2LMP (3·10⁷) инъецируют п/к на день 0. Двум группам мышей инъецируют внутрибрюшинно 200 мкг или 600 мкг TRA-8 в дни 7, 10, 14, 17, 21 и 24. Одной группе мышей не вводят антитело. Представленные данные отражают среднее значение изменений размеров опухоли (продукт двух диаметров) относительно ее размера на день 7 (n=8 мышей/группу).

На фиг.25 показан эффект воздействия TRA-8 и адриамицина на рост опухоли у бестимусных мышей nude, содержащих ксенотрансплантаты клеточных линий рака молочной железы. Клетки 2LMP (3·10⁷) инъецируют п/к бестимусным мышам nude на день 0. Двум группам инъецируют в/б 200 мкг TRA-8 в дни 7, 10, 1