Препарат для защиты растений от возбудителей болезней сельскохозяйственных культур и винограда с ростстимулирующим эффектом, способ получения этого препарата и штаммы для его осуществления

Препарат для защиты растений от возбудителей болезней сельскохозяйственных культур и винограда с ростстимулирующим эффектом, способ получения этого препарата и штаммы для его осуществления

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретения относятся к биотехнологии, микробиологической промышленности, а именно к получению средств защиты растений от возбудителей болезней сельскохозяйственных культур и винограда, в частности к получению препарата для защиты растений от возбудителей грибковых и бактериальных болезней сельскохозяйственных культур и винограда с ростстимулирующим эффектом.

Известны штаммы для получения препаратов против грибковых возбудителей болезней злаковых культур.

Так штамм бактерий Bacillus subtilis ВИЗР М-22, используемый для защиты растений от фитопатогенных бактерий, проявляет антагонистическую активность по отношению Clavibacter michiganense subsp. michiganense, Vanthomonas campestris pv. vesicatora, Pseudamonas corrugata, Pseudamonas syringae pv. tomato, Erwinia carotovora subsp. carotovora, Alternaria splani, Verticillum dachliae, Fusarium graminearum, Ascohyta fabae, Colletotrichum lagenarium, Rhizoctonia solani, Bipolaris sorokiniana, Sclerotinia sclerotiorum, Sertoria nodorum. (RU 2084152, кл. А01 N63/00, C12N 1/20, C12N 1/20, C12R1:125, 1997.07.20).

Известный штамм бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-6554 - продуцент вещества, обладающего противогрибковой активностью, проявляет антагонические свойства в отношении грибов вида Beaveria bassiana, Gliocladium vide, Verticillium nigrescens, Verficillium dahiae, Fusarium graminearum, Sclerotinia scleotiorum, Phytophtora infestaus. (RU 2094990, кл. A01N 63/00, C12N 1/20, C12N 1/20, C12R1:125. 1997.11.10).

Недостатком описанных штаммов является отсутствие препаративной формы препарата и промышленной технологии получения, а также быстрая инактивация в процессе хранения.

Разработан и разрешен к производству и применению в сельском хозяйстве препарат бактофит для защиты растений от возбудителей болезней на основе культуры бактерий Bacillus subtilis штамм ИПМ-215 для защиты растений от болезней (RU 2019966, кл. A01N 63/00, 1994.09.30).

Известен способ получения препарата фитоспорин (RU 2129004, А61К 35/74, C12N 1/20, C12R1:07, C12R1:125, 1999.04.20) на основе штамма бактерий Bacillus subtilis 26, представляющего собой культуральную жидкость этого штамма.

Известен препарат против возбудителей болезней сельскохозяйственных культур и винограда на основе штамма бактерий Bacillus subtilis Ч-13 (ВНИИСХМ Д-606), который представляет собой средство для защиты сельскохозяйственных культур, подсолнечника, винограда от фитопатогенных микроорганизмов, а овощных культур - от фитопатогенных бактерий (RU 2259397 кл. А01С 1/06, C12N 1/20, C12R1:125. 2005.08.27).

К недостаткам препаратов на основе одного штамма относится отсутствие эффективности против комплекса грибов родов Fusarium (Fusarium moniliforme, Fusarium sporotrichiella, Fusarium solani, Fusarium hematium) Colletotrichum, Gaeumannomyces, вызывающих корневые гнили злаков, грибных возбудителей, а также заболевания винограда оидиум (возбудитель - Uncinula necator Burril - мучнистая роса), и мильдью (возбудитель - Plasmopara viticola Beri. et Toni - ложная мучнистая роса), Antracnose (антракноз зернобобовых, ягодников, винограда), Actinomyces scabiens (парша на картофеле и свекле), Phoma exigia (фомоз картофеля), Aspergillus niger.

Задача изобретения - разработка препарата для защиты растений от возбудителей болезней сельскохозяйственных культур и винограда с ростстимулирующим эффектом.

Технический эффект, получаемый от использования этого изобретения, заключается в том, что препарат обладает более широким спектром действия на возбудителей болезней сельскохозяйственных культур и винограда и ростстимулирующим эффектом.

Другой задачей является получение культур микроорганизмов - для получения препарата для защиты растений от возбудителей болезней сельскохозяйственных культур и винограда с ростстимулирующим эффектом.

Технический эффект этих предлагаемых изобретений состоит в том, что они проявляют одновременно фунгицидные и бактерицидные свойства, что может быть использовано для защиты растений от возбудителей болезней сельскохозяйственных культур и винограда.

Первая из указанных задач решается тем, что создан препарат для защиты растений от возбудителей болезней сельскохозяйственных культур и винограда с ростстимулирующим эффектом, включающий культуральную жидкость штаммов микроорганизмов, отличающийся тем, что в качестве культуральной жидкости штаммов микроорганизмов он содержит культуральные жидкости штамма бактерий Bacillus subtilis БАГ-65 и штамма актиномицета Streptomyces sindenensis БАГ-55, а также вспомогательные добавки и наполнители, при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Культуральная жидкость
Bacillus subtilis БАГ-55	20-50
Культуральная жидкость
Streptomyces sindenensis БАГ-65	5-20
Вспомогательные добавки и наполнители	Остальное

В качестве вспомогательных добавок могут быть использованы вещества, содержащие основные питательные вещества - азот, фосфор, калий - минеральные соли и микроэлементы, стимулятор - гидролизат хвойной хлорофилло-каротиновой пасты, протектор - диметилсульфоксид, прилипатель - молочная сыворотка.

Указанные вещества могут использоваться в следующих количествах, мас.%: минеральные соли и микроэлементы 0,5-50, гидролизат хвойной хлорофилло-каротиновой пасты 1,0-4,0, диметилсульфоксид 3,0-5,0, молочная сыворотка 3,0-10,0. В качестве наполнителя используют соевую муку и каолин (5,0-8,5, 0-7,0 соответственно).

Предлагаемый препарат представляет собой текучую пасту коричневого цвета со слабым хвойным запахом.

Он содержит комплекс гептаеновых соединений и комплекс соединений из группы макролидов - названный нами синденином, который представляет собой комплекс макролидов, по физико-химическим свойствам близкий к азаломицинам F.

Вторая задача решается тем, что выделены новые штаммы для получения препарата для защиты растений от возбудителей болезней сельскохозяйственных культур и винограда с ростстимулирующим эффектом: штамм бактерии Bacillus subtilis БАГ-65 и штамм актиномицета Streptomyces sindenensis БАГ-55.

Штаммы пригодны для использования, в частности, против грибных и бактериальных заболеваний сельскохозяйственных культур.

Культуральные жидкости указанных штаммов содержат в качестве действующего начала комплекс метаболитов двух культур, в том числе полиеновые соединения и синденин, который представляет собой комплекс макролидов, по физико-химическим свойствам близкий к азаломицинам F.

Указанные метаболиты способны подавлять различные фитопатогенные грибы и бактерии, за счет чего расширяется спектр патогенов, на которые действует препарат.

Штамм бактерий Bacillus subtilis БАГ-65, обладающий бактерицидными, фунгицидными и ростстимулирующими свойствами, пригодный для получения препарата для защиты растений от возбудителей болезней сельскохозяйственных культур и винограда с ростстимулирующим эффектом, выделен из почвы и депонирован Всероссийской коллекцией микроорганизмов под номером ВКМ В-2440 D и хранится в коллекции микроорганизмов ООО «Био-Агат-Групп» под номером БАГ-65.

Целевое назначение: перспективен для использования в производстве биопрепарата против фитопатогенных почвенных грибов и бактерий, вызывающих заболевания сельскохозяйственных культур, а также обладающий ростстимулирующими свойствами.

Культурально-морфологическая характеристика:

Морфологические признаки.

При микроскопировании - в поле зрения клетки палочковидные, прямые с закругленными концами, подвижные, расположенные одиночно, парами, реже цепочками; величина клеток в экспоненциальной фазе роста равна 0,7-0,8·2,0-3,0 мкм.

Реакция по Граму положительная, клетки при спорообразовании не раздуваются. Перитрихи. Образуют термоустойчивые эндоспоры, не более одной в клетке. Споры крупные, овальной формы, расположены центрально или субтерминально. Строгие аэробы. Не образует глобулы в протоплазме после роста на глюкозном агаре.

На мясопептонном агаре культура образует колонии с изрезанным краем, складчатые, сероватого цвета, сухой консистенции. Колонии среднего размера, диаметр которых у пятисуточной культуры достигает 4-5 мм.

На мясопептонном бульоне культура образует пленку, осадок на 6-7 сутки, пигмент не синтезирует.

На картофельном агаре образует колонии с изрезанным краем, морщинистые, светло-серого цвета, с уплотненным центром вгрызающиеся в агар.

На ломтике картофеля - обильный рост, поверхность складчатая, пигмент не образует.

Молочный агар. Рост хороший, колонии матового цвета, поверхность складчатая.

На среде 5/5, содержащей триптон, аминопептид, экстракт сои, экстракт кормовых дрожжей, колонии с изрезанным краем, складчатые, серого цвета, сухой консистенции.

Физиолого-биохимические свойства.

Штамм БАГ-65 культуры Bacillus subtilis хорошо усваивает следующие углеводы без образования газа: глюкозу, сахарозу, крахмал, маннит, сорбит; целлобиозу, не усваивает арабинозу, ксилозу, слабо маннозу.

Молоко коагулирует и пептонизирует без образования пигмента, не образует лецитиназу на яично-желтковых средах и уреазу на среде с мочевиной, желатину разжижает (гидролиз), крахмал гидролизует, на среде с казеином дает зоны просветления, хитиназу образует, образует АМК (ацетилметилкарбинол). Редукция нитратов положительная. Образование газа из NO₃ в анаэробных условиях отрицательное. Активен в отношении эскулина и не разлагает салицин. Образует каталазу, отсутствует аргинингидролаза. Использует пептон, дрожжевой автолизат, экстракт кормовых дрожжей, экстракт сои, кукурузные и пшеничные экстракты, мясные отвары и бульоны, дрожжи пивные и пекарские, овсяную муку, нитратные формы азота.

Гетеротроф. Обмен в высшей степени окислительный. В опытах по сбраживанию кислоты не выявляются.

Аэроб. При глубинном культивировании растет до образования спор. Культура может расти при температуре от 28 до 37°С. Оптимальная температура роста при глубинном культивировании 28-30°С (+2).

Антагонистическая активность.

Штамм бактерий Bacillus subtilis БАГ-65 является культурой-антагонистом и синтезирует биологически активные вещества, проявляя биологическую активность к ряду фитопатогенных микроорганизмов:

Fusarium sporotrchiella - корневые гнили озимой ржи, ячменя; Fusarium solani - корневые гнили озимой пшеницы, ячменя и ржи; Fusarium hematium - фузариоз корней овощебахчевых культур, кормовых, бобовых, трав (гнили); Fusarium graminearum - фузариоз корней злаковых, гниль красная, «пьяный хлеб»; Fusarium culmorum - корневые гнили озимой ржи, приводящие к белостебельности и белоколосости, корневые гнили ячменя и овса; Fusarium oxysporum - фузариоз зернобобовых, гнили клубней картофеля, корнеед свеклы; Colletotrichium atraventa - антракноз сельскохозяйственных культур, кормовых, злаковых трав; Gaeumannomyces graminis var. Tritici - офоболезная гниль корней пшеницы; Penicillium sp. - участвует в развитии корнееда свеклы; Fusarium moniliforme - кагатная гниль свеклы; Botrytis cinerea - кагатная гниль свеклы; Aspergillus niger - плесневение или гниль семян и плодов древесных и кустарниковых пород; Phomopsis - фомопсис у подсолнечника; Actinomyces scabies - обыкновенная парша на картофеле и свекле; Phoma exigia - фомоз картофеля; Verticillium dahliae - вертициллезное увядание хлопчатника, подсолничника; Antracnoze - антракноз зернобобовых, ягодников, винограда; Rizoctonia solani - ризоктониоз или черная парша картофеля; Fusarium sp.- кагатная гниль свеклы; Ervinia carotovora - слизистый бактериоз капусты.

Антагонистическую активность изучали на картофельно-глюкозном и сахарозном агаре, на среде Сабуро и среде Чапека.

Штамм бактерий Bacillus subtilis БАГ-65 хранят на скошенном картофельном агаре в биологических пробирках под вазелиновом маслом, при +4°С в течение 3-5 месяцев; в лиофилизированном виде в запаянных ампулах с защитной сахарозо-желатиновой средой или в жидком азоте.

Штамм Bacillus subtilis БАГ-65 поддерживают на картофельном агаре, который включает:

картофельный отвар	(300-600 г картофеля) в 1 дм3
агар микробиологический	20,0 г
дистиллированная вода	до 1,0 л

Для размножения штамм выращивают на агаризованных средах: картофельный агар, картофельно-глюкозный агар, среда 5/5, L агар.

Для глубинного культивирования используют ряд сред:

1) первая питательная среда, содержащая органические компоненты, %:

дрожжи кормовые (БВК)	3.0
зеленая патока, по объему,	3.0
по редуцирующим веществам	1.2-1.4
(или меласса) по объему	3.0
магний сернокислый	0.1
мочевина	0.3
вода водопроводная	до 100
рН среды до стерилизации	6,8-7,0

2) вторая среда (%):

соевая мука	0.5
дрожжи (БВК)	1.0
кукурузный экстракт	0.3
NaCl	0.5
вода водопроводная	до 100

Оптимум рН среды для роста культуры - 7.0-7.2, количество оборотов мешалки равно 240-260 об/мин. Время ферментации - 40-48 часов при 28-30°С. Отношение объема среды к объему колбы - 1:10.

Отношение к фагам, лизирующим клетки других штаммов того же вида: штамм не продуцирует вирулентный фаг и не чувствителен к фагам, специфичным для культуры бактерий Bacillus subtilis.

Особенности штамма: штамм бактерий Bacillus subtilis БАГ-65 отличается от описанных штаммов Bacillus subtilis способностью синтезировать комплекс полиеновых антибиотиков, определяющий его высокую фунгицидную активность.

Выделение бактерий из почвенного образца проводили по следующей общеизвестной методике.

При микробиологических исследованиях полученные почвенные образцы предварительно прогревали в металлических бюксах при температуре 105°С в течение 2 час для подавления роста немицелиальных бактерий. Брали навески почв по 1 или 10 г и переносили в протертые спиртом фарфоровые чашки. Увлажнив почву небольшим количеством стерильной воды, ее растирали в течение 5-7 минут стерильным пестиком. Растертую почву аккуратно переносили стерильным фарфоровым или металлическим шпателем в пустую стерильную колбочку с ватной пробкой. Количество воды в колбе - 99 (для 1 г почвы) или 90 мл (для 10 г почв), тогда концентрация почвенных суспензий была 1:100 или 1:10. Колбочки встряхивали на качалке 10-15 мин. Из полученных суспензий готовили серию последовательных разведении.

Из пробирки (второго или третьего разведении) брали стерильной пипеткой по 0,1 мл суспензии и переносили в чашки Петри на плотные агаровые среды (мясопептонный или картофельный агар) и сеяли известным поверхностным методом (Большой практикум по микробиологии, Изд. МГУ. М., 1957 г., с.44-52). В среду добавляли антибиотик рубомицин (от 20-50 мкг/мл) для подавления роста грибов. Капли растирали стерильным стеклянным шпателем. Для каждого разведения суспензии брали 3-5 чашек Петри со средой. Засеянные чашки помещали в термостат при 29-30°С. Посевы инкубировали в течение 3-5 дней.

Для выявления на чашках с питательной средой представителей споровых бактерий, относящихся к различным родам, микроскопировали колонии в оптическом микроскопе, отмечая характер колоний, наличие спор, отличающихся по форме и размерам. Выделяли колонии, относящиеся к определенному морфотипу.

Для выделения в чистую культуру и дальнейшего культивирования использовали среду картофельный агар. Отобранные клоны проверяли на антагонистическую активность по отношению к фитопатогенам - возбудителям болезней сельскохозяйственных культур. Использовали метод блочков на твердых средах и жидких средах методом диффузии в агар (Н.С.Егоров, «Основы учения об антибиотиках». М.: Высшая школа, 1986 г., с.117-120). Активность оценивали по величине зон подавления. У клона, проявившего высокую фунгицидную активность, изучали морфологические, культуральные и физиолого-биохимические свойства. По совокупности свойств культура была идентифицирована как Bacillus subtilis (Краткий определитель бактерий Берги, Изд. «Мир». М., 1980 г., с.286-288).

Полученный штамм бактерий по антагонистическим и антибиотическим свойствам отличается от описанных штаммов Bacillus subtilis способностью синтезировать комплекс макролидных противогрибковых полиеновых антибиотиков, что позволило его выделить в новый штамм Bacillus subtilis БАГ-65. Наряду с антагонистическими свойствами синтез этих веществ определяет его высокую фунгицидную и ростстимулирующую активность по отношению к патогенам - возбудителям болезней сельскохозяйственных культур.

Штамм бактерии Bacillus subtilis БАГ-65 пригоден для создания препарата против широкого спектра патогенов, вызывающих заболевания сельскохозяйственных - зерновых, масличных, овощных, технических культур, плодовых и винограда.

В Таблице 1 приведены данные по биологической активности культуральной жидкости штамма, подтверждающие его способность подавлять тест-культуры возбудителей болезней сельскохозяйственных культур.

Штамм актиномицета Streptomyces sindenensis БАГ-55, обладающий одновременно фунгицидными и бактерицидными свойствами, пригодный для получения препарата для защиты растений от возбудителей болезней сельскохозяйственных культур и винограда с ростстимулирующим эффектом, выделен из почвы Московской области, депонирован Всероссийской коллекцией микроорганизмов под номером ВКМ Ac-2535D и хранится в коллекции микроорганизмов ООО «Био-Агат-Групп» под номером БАГ-55.

Целевое назначение: фунгицид широкого спектра действия, пригодный для использования в производстве биопрепарата против фитопатогенных почвенных грибов и бактерий, вызывающих заболевания сельскохозяйственных культур, обладающий ростстимулирующим эффектом.

Культурально-морфологическая характеристика.

Морфология. Вегетативные гифы тонкие, в диаметре - 0,5-1,5 мкм, образуют хорошо разветвленный мицелий. Воздушный мицелий беловатый, порошковидный, в зрелом состоянии образует цепочки из 7-10 спор. Цепочки спор прямые, споры гладкие. Грамположительные. Аэробы. Размножаются путем прорастания воздушных спор.

При выделении колонии небольшие, обособленные, кожистые; в начале поверхность гладкая, но позже образуется беловатый воздушный мицелий, который может быть зернистым, легко превращающимся в порошок.

Рост на диагностических средах.

На минеральном агаре 1: воздушный мицелий белый, порошковидный, плохо развит; субстратный мицелий бесцветный до желтоватого; растворимого пигмента нет.

На глицерин-нитратном агаре: воздушный мицелий очень скудный, беловатый; субстратный мицелий желтоватый, коричневатый, иногда зеленоватый; растворимого пигмента нет.

На овсяном агаре: воздушный мицелий скудный, беловатый; субстратный мицелий желтоватый; растворимого пигмента нет.

На органическом агаре 2: воздушный мицелий скудный, беловатый; субстратный мицелий желтоватый, иногда коричневатый; растворимого пигмента нет.

Меланоидные пигменты: не образует.

Физиолого-биохимические свойства.

Гетеротроф. Обмен в высшей степени окислительный.

Из углеродных соединений утилизирует глюкозу, ксилозу, арабинозу, сахарозу, салицин, рамнозу, слабо - сорбит, не усваивает рафинозу, инозит.

В опытах по сбраживанию кислоты не выявляются. Гидролизует желатину, крахмал. Восстанавливает нитраты до нитритов.

Культура идентифицирована как Streptomyces sindenensis. Идентификация вида проведена по Определителю актиномицетов (Гаузе Г.Ф., Преображенская Т.П,, Свешникова М,А., Терехова Л,П,, Максимова Т.С. Определитель актиномицетов. М., Изд-во Наука, 1983, 244 с.).

Антагонистическая активность.

При первичном определении антагонистических свойств использовали метод блоков (Бабьева И.П., Зенова Г.М. Биология почв. М., Изд-во Московского Университета, 1989, 333 с.).

Культура Streptomyces sindenensis штамм БАГ-55 угнетает рост грамположительных бактерий (в том числе актиномицетов), грамотрицательных бактерий. Одновременно штамм актиномицета проявляет антагонистические свойства по отношению к ряду фитопатогенных грибов (представителей рода Fusarium, Coleotrichum, Rizoctonia, Aspergillius). He действует на рост микроскопических грибов и дрожжей (Penicillium chrysogenum, Neosavtovya fisher, Saccaromyces cerevisiae, Candida albicans).

Изучение антибиотической активности штамма Streptomyces sindenensis БАГ-55 проводили на жидких средах методом лунок (Егоров Н.С. Выделение микробов - антагонистов и биологические методы учета их антибиотической активности. М., Изд-во Московского Университета, 1957 г.)

В качестве тест-объектов использовали следующие патогены - возбудители болезней сельскохозяйственных культур.

Fusarium sporotrchiella - корневые гнили озимой ржи, ячменя; Fusarium solani - корневые гнили озимой пшеницы, ячменя и ржи; Fusarium hematium - фузариоз корней овощебахчевых культур, кормовых, бобовых, трав (гнили); Fusarium graminearum - фузариоз корней злаковых, гниль красная, "пьяный хлеб"; Fusarium culmorum - корневые гнили озимой ржи, приводящие к белостебельности и белоколосости, корневые гнили ячменя и овса; Fusarium oxysporum - фузариоз зернобобовых, гнили клубней картофеля, корнеед свеклы; Colletotrichium atraventa - антракноз сельскохозяйственных культур, кормовых, злаковых трав; Gaeum-annomyces graminis var. Tritici - офоболезная гниль корней пшеницы; Penicillium sp. - участвует в развитии корнееда свеклы; Fusarium moniliforme - кагатная гниль свеклы; Botrytis cinerea - Fusarium кагатная гниль свеклы; Aspergillus niger - плесневение или гниль семян и плодов древесных и кустарниковых пород; Phomopsis - фомопсис у подсолнечника; Actinomyces scabies - обыкновенная парша на картофеле и свекле; Phoma exigia - фомоз картофеля; Verticillium dahliae - вертициллезное увядание хлопчатника, подсолничника; Antracnoze - антракноз зернобобовых, ягодников, винограда; Rizoctonia solani - ризоктониоз или черная парша картофеля; Fusarium sp. - кагатная гниль свеклы; Ervinia carotovora - слизистый бактериоз капусты.

Данные по антагонистической активности культуры актиномицета Streptomyces sindenensis штамма БАГ-55 по отношению к фитопатогенным грибам приведены в Таблице 2.

Выделение актиномицетов из почвы проводили по следующей общеизвестной методике.

Для выделения и дифференцированного учета штаммов актиномицетов пользовались традиционным методом поверхностного посева из разведении почвенных суспензий, на среду с пропионатом натрия (Rowbatham T.J., Cross Т. Ecology of Rhodococcus coprochilus and associated actinomycetes in fresh and acricultaral habitats J. Gen. Microbiol. 1977. V.100 P.231-240.) следующего состава, г/л:

КН2PO4	0,46
Na2HPO4	0,73
KNO3	0,10
NaCl	0,29
MgSO4	0,10
СаСО3	0,02
Пропионат натрия	0,20
Агар-агар	20,00
рН	7,00

После стерилизации (1 атм.) добавляли витамин B₁ (4 мг/л) и раствор микроэлементов (1 мл/л) следующего состава, мг/мл:

FeSO4·7H2O	200
ZnSO4·7H2O	180
MnSO4·2H2O	20

В среду добавляли антибиотики: нистатин (50 мкг/мл среды) для подавления роста грибов; налидиксовую кислоту (1,5 мкг/мл) и рубомицин (1 мкг/мл) для подавления роста немицелиальных бактерий.

Образцы перед посевом прогревали про 120°С 1 час. Инокулированные чашки Петри инкубировали в термостате при 28°С в течение 14-28 суток. Выросшие колонии изолировали на пробирки со скошенным овсяным агаром или с органическим агаром 2 Гаузе (Г.Ф.Гаузе, Т.П.Преображенская, М.А.Свешникова, Л.П.Терехова, Т.С.Максимова. Определитель актиномицетов. Изд. " Наука". М., 1983 г., с.172) и инкубировали в термостате при 28°С в течение 14 суток. Подсчитывали общее число выросших колоний актиномицетов и проводили дифференцированный учет по морфологическим типам, микроскопируя колонии с чашки в оптическом микроскопе (400).

Для выделения штаммов актиномицетов и проверки чистоты культуры использовали среду органический агар (среда Гаузе 2) следующего состава, г/л:

Бульон Хотингера	30 мл
Пептон	5,0
NaCl	5.0
Глюкоза	10,0
Агар-агар	20,0
рН	7,0-7,2

Выросшие культуры оценивали по культуральным свойствам (окраске воздушного и субстратного мицелия и растворимым пигментам). Культуры, идентичные по культуральным свойствам и морфологии, отбраковывали. У отобранных культур изучали спектр действия или антагонистические свойства методом блочков на твердых средах и жидких средах методом диффузии в агар на жидких средах (Н.С.Егоров. "Микробы - антагонисты и биологические методы определения антибиотической активности. Изд. "Высшая школа ". М., 1965 г., с.28-41, 67-79) по отношению к фитопатогенным микроорганизмам, вызывающим заболевания растений. Активность оценивали по величине зон подавления тест-культуры. Необходимо было отобрать штамм, обладающий фунгицидными свойствами.

Из проверенных актиномицетов наибольшая активность была отмечена у культуры актиномицета штамм БАГ-65. Идентификация проведена по Определителю актиномицетов Гаузе (Г.Ф.Гаузе, Т.П.Преображенская, М.А.Свешникова, Л.П.Терехова, Т.С.Максимова. Определитель актиномицетов. Изд. " Наука". М., 1983 г., с.175).

Данный вид имеет ряд отличий от штаммов, описанных для вида Streptomyces sindenensis, что позволило выделить его в новый штамм Streptomyces sindenensis БАГ-65.

Штамм Streptomyces sindenensis БАК-55 в отличие от типового штамма использует из углеродных соединений ксилозу, арабинозу и сахарозу.

Штамм актиномицета БАГ-55 отличается от типовой культуры проявлением антагонистических и антибиотических свойств по отношению к ряду фитопатогенных грибов (представителей рода Fusarium, Coleotrichum, Rizoctonia, Aspergillius). He действует на рост проверенных микроскопических грибов и дрожжей (Penicillium chrysogenum, Neosavtovya fisher, Saccaromyces cerevisiae, Candida albicans). В литературе нет ссылок на антибиотические свойства культуры Streptomyces sindenensis no отношению к фитопатогенам - возбудителям болезней сельскохозяйственных культур.

Антибиотическая активность штамма по отношению к фитопатогенным грибам, особенно в отношении грибов родов Fusarium и Coleotrichum, связана с синтезом комплекса антибиотиков макролидной природы. Для типового штамма эта группа антибиотиков не отмечена.

По морфологическим свойствам колонии штамма БАГ-65 отличаются складчатой поверхностью с уплотненным центром, погруженным в агаризованные плотные среды. По культуральным свойствам, в отличие от описанных штаммов, не утилизирует арабинозу, ксилозу и маннит и в опытах по сбраживанию некоторых углеводов не образует кислоту.

Штамм актиномицета Streptomyces sindenensis БАГ-55 хранят на скошенном овсяном агаре в биологических пробирках под вазелиновом маслом при +4°С в течение 1-3 месяцев; споровый материал - в пробирках с простерилизованной почвой, содержащей суспензию мела (СаСО₃) или глюкозу. Срок хранения - 3 года. В лиофилизированном виде - в запаянных ампулах с защитной сахарозо-желатиновой средой и в жидком азоте.

Для размножения штамма проводят культивирование на агаризованных средах: овсяном агаре, среде Гаузе №1 или глубинное выращивание на среде Гаузе №1 и №2.

Оптимум роста 28°С.

Для ферментации используют среду, содержащую кукурузную муку, соевую муку, мел и соли азота. Выращивание проводят на качалке при 190-200 об/мин, время ферментации - 4-5 суток при 28°С. Объем среды - 50-100 мл.

Особенности штамма.

Штамм обладает антибиотическими свойствами по отношению к ряду фитопатогенных микроорганизмов, особенно грибов рода Fusarium. Биологическая активность штамма связана с синтезом комплекса соединений, названного нами синденином, - комплекса макролидов, по физико-химическим свойствам близкого к азаломицинам F.

Предлагаемый способ получения препарата для защиты растений от возбудителей болезней сельскохозяйственных культур и винограда с ростстимулирующим эффектом, заключается в том, что выращивают в условиях подпитки раздельно штамм бактерии Bacillus subtilis БАГ-65 и штамм актиномицета Streptomyces sindenensis БАГ-55, смешивают культуральную жидкость штамма бактерий Bacillus subtillus БАГ-65 и культуральную жидкость штамма актиномицета Streptomyces sindenensis БАГ-55 в соотношении 10:1-1:1, в полученную смесь вносят вспомогательные добавки и наполнители, при этом полученная смесь культуральных жидкостей составляет 25-70% от массы препарата, вспомогательные добавки и наполнители - остальное.

Штамм бактерии Bacillus subtilis БАГ-65 выращивают при 25-35°С в течение 2-3 суток.

В процессе культивирования в условиях подпитки получают уплотненную культуру штамма бактерии Bacillus subtilis БАГ-65 до оптической плотности культуральной жидкости не менее 100 ед. Это значение в 4-5 раз превышает плотность культуры при периодическом культивировании.

Для получения уплотненной культуры используют дробное добавление раствора мелассы, которая является источником углеводов и ростовых факторов. Дробная подача мелассы предотвращает катаболитную репрессию важнейших факторов метаболизма, поддерживает концентрацию сахаров в культуральной жидкости. Введенные с мелассой биологически активные вещества способствуют размножению микробных клеток, активизируют биосинтез вторичных метаболитов.

Штамм актиномицета Streptomyces sindenensis БАГ-55 выращивают при 25-30°С в течение 4-5 суток.

В процессе культивирования условия подпитки обеспечиваются дробным добавлением раствора глюкозы, что позволяет повысить содержание синденина в культуральной жидкости в 2-2,5 раза. Культуральные жидкости получают культивированием штаммов на соответствующих средах в аэробных условиях.

Ферментацию указанных штаммов микроорганизмов проводят в ферментере вместимостью 10 л с регулированием перемешивания, температуры, рН, аэрации, добавкой пеногасителя. Питательную среду стерилизуют при температуре 121°С в течение 20 мин.

Культуральная жидкость штамма актиномицета Streptomyces sendenensis БАГ-55 содержит метаболиты, секретируемые штаммом, в том числе синденин, неиндефицированные метаболиты, источники углерода, азота, неорганические соли из питательной среды, вегетативные клетки - мицелий, конидии и их комбинации, также обладающие фунгицидным действием.

Культуральная жидкость штамма бактерии Bacillus subtilis БАГ-65 содержит действующие вещества - комплекс гептаеновых соединений, неиндефицированные метаболиты, источники углерода, азота, неорганические соли из питательной среды, вегетативные клетки и споры штамма.

Биологическая активность препарата была продемонстрирована на вариантах препарата 20а и 20/1. При оптимальном разведении препарата они проявляли хорошие защитные функции на подсолнечнике, винограде и зерновых культурах (рожь, пшеница) против возбудителей Sclerotinium scleotiorum, Fusarium culmorum и Phomopsis helianthi.

Препараты показали быстрое начальное действие и долговременную защиту. Фунгицидное действие длится на протяжении более четырех недель, обеспечивая внутреннюю защиту растения на всех стадиях роста и, тем самым, предотвращая заражение.

Интересные данные были получены при использовании в качестве защитных факторов отдельных фракций препаратов. Так, например, обработка растений супернатантом автоклавированной культуры Bacillus subtilis приводила к повышенной устойчивости подсолнечника и винограда к действию бактериального патогена Erwinia carotovora. В то время как отдельно взятая биомасса защитного эффекта не оказала. А клетки штамма Streptomyces sindenensis, напротив, проявляли защитный эффект, но по отношению к грибному патогену Sclerotinium scleotiorum.

Возможно, что в основе этой защиты лежит и иммунологическое воздействие данных фракций по отношению к растению. Имеются данные, что при атаке патогена защитные механизмы клетки включают системы биосинтеза клеточной стенки растений, а также биосинтеза различных защитных низкомолекулярных соединений и специфических защитных белков. Также клетки растений способны распознавать патогены и индуцировать при их атаке специфический защитный ответ. Обычно взаимодействие между растением и патогеном вызывает у растения быструю реакцию гиперчувствительности, приводящую к локальному некрозу инфицированной ткани растения и гибели патогена.

Кроме того, эта реакция сопровождается индукцией в окружающих неинфицированных клетках системной приобретенной устойчивости, в результате чего растение получает иммунитет против повторного заражения фитопатогенами. Такой механизм может объяснить специфическую защиту растений, обработанных клетками штамма Streptomyces sindenensis, к грибному патогену Sclerotinium scleotiorum и повышенную устойчивость растений, обработанных культуральной жидкостью штамма Bacillus subtilis к бактериальному патогену Erwinia carotovora.

Вероятно, что большая часть действующих веществ поглощается ассимилирующими частями растений в течение очень короткого времени, распространяется по сосудам, и с этого момента начинается воздействие препарата непосредственно на растение.

Возможность осуществления предлагаемых изобретений иллюстрируется следующими примерами, но не исчерпывается ими.

Пример 1. Культивирование штамма бактерии Bacillus subtilis БАГ-65.

Исходную культуру штамм бактерии Bacillus subtilis БАГ-65 хранят на агаризованной среде под вазелиновым маслом при температуре 4°С в течение 1 года и в лиофильно высушенном состоянии. Для выращивания, поддержания и хранения культур используют среду следующего состава: г (или см³) на 1 дм³ среды:

Аминопептид	60 см3
Триптон	5 г
Соевый пептон	1 г
Экстракт дрожжей	1 г
Агар-агар	18 г

Исходное значение рН доводят раствором NaOH до 7,0-7,2.

Стерилизуют среду в автоклаве 121°С в течение 20 мин.

Для получения посевного материала в колбах используют среду следующего состава: г (или см³) на 1 дм³ среды:

Триптон	1 г
Дрожжевой экстракт	1 г
Глюкоза	10 г
КН2PO4	1 г

рН среды доводят 20%-ным раствором NaOH до 7,0-7,2.

Приготовленную питательную среду разливают в качалочные колбы вместимостью 750 см³ по 500 см³, стерилизуют в автоклаве при 121°С в течение 20 минут.

Для засева колб с жидкой питательной средой используют 12-и часовую культуру, выращенную на агаризованной среде. Каждую колбу со средой засевают микробиологической петлей с чашки Петри. Посевной материал выращивают на подвесной качалке (190-200 об./мин) при температуре 29°С.

Для получения культуральной жидкости в ферментере используют среду следующего состава, мас.%:

(NH4)2SO4	5,0-10,0
КН2PO4	2,0-6,0
Меласса	5,0-100,0
Глюкоза	10,0-40,0
Соевый пептон	0,5-4,0
Дрожжевой экстракт	0,5-5,0

Среду для выращивания культур в 10 дм³ ферментере стерилизуют в автоклаве при 1 кгс/см² (121°С) в течение 30 минут. Среду инокулируют 12-часовой культурой в объеме 5% от засеваемой среды. Ферментацию проводят при 29°С, аэрации 1 об. воздуха/1 об. среды; 0,15 дм³·мин на объем ферментера, далее в процессе ферментации pO₂ поддерживают на уровне 40-60% от насыщения увеличением расхода воздуха до 3 дм³·мин и скоростью перемешивания среды до 900 об/мин.

Поддерживают рН среды 6,8-7,0 автоматической подачей 10% раствора аммиака.

При самопроизвольном повышении рН среды выше 7,0 вносят 0,5 дм³ стерильного раствора мелассы.

При вспенивании культуральной жидкости подают из колбы с отростком водную эмульсию пеногасителя (пропинол, лапрол и пр.)

Культивирование ведут 36-48 часов. Окончание процесса определяют по самопроизвольному повышению рН после последней добавки мелассы. После чего ферментер выдерживают на режиме до повышения pO₂ на 15-20%.

По окончании ферментации отбирают пробу из ферментера для определения следующих параметров: оптической плотности, стерильности, содержание гексаенов.

Полученная культуральная жидкость содержит: действующие вещества - комплекс гексаеновых соединений - 150 мг/дм³.

Пример 2. Культивирование штамма актиномицета Streptomyces sindenensis БАГ-55.

Исходную культуру штамма актиномицета Streptomyces sindenensis БАГ-55 хранят в лиофильно высушенном состоянии в ампулах и на агаризованной среде при температуре 4°С в течение 6 месяцев.

Состав среды для поддержания культуры, мас.%:

Крахмал картофельный растворимый	2,00
Калий фосфорнокислый двузамещенный	0,10
Натрий азотнокислый	0,30
Калий хлористый	0,05
Магний сернокислый семиводный	0,055
Железо сернокислое	0,0015
Агар микробиологический	2,00
Вода	до 1 дм3
рН после стерилизации	6,7-7,0

Культуру штамма Streptomyces sindenensis БАГ-55 выращивают на агаризованной среде Чапека с крахмалом в течение 7-12 суток при температуре 28±1°С. Вегетативный посевной материал выращивают в колбах вместимостью 750 см³ с 100 см³ посевной среды следующего состава, мас.%:

Глюкоза кристаллическая	1,0
Соевая мука	1,0
Натрий хлористый	0,5
Калий углекислый	0,1
Вода	до 1 дм3
рН среды	6,7-7,0