Способ оценки состояния иммунной системы организма человека

Иллюстрации

Показать все

Изобретение относится к медицине, а именно к области клинической иммунологии. У пациентов определяют активность комплекса маннан-связывающего лектина с ассоциированными сериновыми протеазами путем измерения потребления комплемента сыворотки крови до и после инкубации в буферном растворе с добавлением этилендиаминотетрауксусной кислоты in vitro, которую нейтрализуют оттитрованным раствором Са2+ и Mg2+,добавляют эритроциты барана, сенсибилизированные антителами кролика, и повторно инкубируют. Показатели потребления комплемента определяют по степени лизиса эритроцитов: до 30% оценивают как сниженную реакцию иммунной системы организма человека, от 30% до 70% как нормальную, свыше 70% как повышенную. Использование простого и быстрого в осуществлении способа позволяет выявлять доклинические состояния иммунодефицита, проводить углубленное исследование патогенеза аутоиммунных заболеваний, дает возможность их ранней профилактики и позволяет контролировать эффективность проводимой терапии. 3 ил.

Реферат

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для определения функциональной активности пектинового пути системы комплемента в сыворотке крови человека.

Система комплемента является частью врожденной иммунной системы и включает более 30 функционально связанных между собой сывороточных и мембранных белков, активирующихся по каскадному механизму. Эта система играет ключевую роль как в клиренсе иммунных комплексов, так и в иммунном ответе на инфекционные агенты, чужеродные антигены, опухолевые и вирус-инфицированные клетки. При активации комплемента, кроме того, генерируются биологически активные фрагменты, которые опосредуют воспалительные реакции, включающие лейкоцитарный хемотаксис, активацию макрофагов, нейтрофилов и тромбоцитов, тучных и эндотелиальных клеток, повышение сосудистой проницаемости и т.д. [Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология: Пер. с англ. М.: Мир, 2000-592 с.].

Система комплемента может активироваться тремя путями: классическим, альтернативным и пектиновым, отличающимися способом образования С3-конвертаз. Субстратом С3-конвертаз трех путей активации системы комплемента является компонент С3, при расщеплении которого образуются С3а и С3b. Присоединение дополнительных молекул С3b к С3-конвертазам приводит к образованию С5-конвертаз, которые запускают реакцию формирования мембраноатакующего комплекса (МАК).

Классический путь является Ca2+/Mg2+-зависимым каскадом, который в норме запускается иммунными комплексами путем активации С1, первого компонента комплемента, включающего одну молекулу C1q и по две молекулы С1 г и С1s субкомпонентов. Активация С1 компонента в результате связывания C1q-субкомпонента с Fc-фрагментом иммуноглобулинов иммунного комплекса и образования активных протеиназ С1r и С Is инициирует ферментативный каскад комплемента, приводящий к образованию С3-конвертазы классического пути (С4b, С2а) [Muller-Eberhard H.J. Complement // Ann. Rev. Biochem. - 1975. - V.44. - P.697-724].

Альтернативный путь является Mg2+-зависимым и активируется полисахаридами клеточных стенок дрожжей и бактерий и рядом биополимерных материалов. Фактор В, связываясь с иммобилизованными на поверхности активатора молекулами С3b, расщепляется фактором D, образуя С3-конвертазу альтернативного пути (С3b, Bb) [Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология: Пер. с англ. М.: Мир, 2000. - 592 с].

Лектиновый путь активации системы комплемента запускается при взаимодействии маннан-связывающего лектина (МСЛ) с углеводными структурами на поверхности бактерий, дрожжей, простейших, вирусов и апоптозных клеток (манноза, N-ацетилглюкозамин, фукоза, глюкоза), приводящем к активации МСЛ-ассоциированных сериновых протеаз 1, 2 и 3 (МАСП-1, МАСП-2), которые генерируют С3-конвертазу (С4b, С2а). Кроме того, МСЛ после связывания с патогенами способен напрямую запускать процесс фагоцитоза [Petersen et al. An assay for the mannan-binding lectin pathway of complement activation // J. Immunol. Methods. - 2001. - V.257. - P.107-116].

Дефицит МСЛ был описан как "общий опсонический дефект" [Miller et al. A familial, plasma-assotiated defect of phagocytosis // Lancet. - 1968. - P.60-63]. Общий опсонический дефект встречается у 5-8% относительно здоровых индивидуумов, который проявляется при оперативных вмешательствах и в послеродовом периоде. У детей раннего возраста дефицит МСЛ клинически проявляется воспалительными заболеваниями органов дыхания, которые могут перейти в сепсис или синдром системной воспалительной реакции [Turner M.W. The role of mannose-binding lectin in health and disease // Mol. Immunol. - 2003. - V.40. - P.423-429]. Дефицит МСЛ может быть как функциональным, так и абсолютным.

В настоящее время разработаны несколько способов определения содержания МСЛ в плазме крови. В тесте "МСЛ-антиген" в лунки иммунологической плашки с сорбированными анти-МСЛ антителами, добавляют разведенную плазму и количество связанного МСЛ определяют Eu-меченными анти-МСЛ антителами. "Тест МСЛ-антиген" является высокочувствительным в отношении общего содержания (2 нг МСЛ/мл), однако исследования сывороток более чем 10000 пациентов не выявили дефицита МСЛ [Thiel et al. Assay for the functional activity of the mannan-binding lectin pathway of complement activation // Immunobiol. - 2002. - V.205. - P.446-454]. Этот метод позволяет измерять общее содержание, но не функциональную активность МСЛ в сыворотках крови.

Известен способ оценки состояния иммунной системы организма человека путем определения активности комплекса маннан-связывающего пектина с МАСП-1 и 2 (МСЛ/МАСП), при котором в качестве лиганда используют дрожжевой маннан, сорбированный в лунках иммунологических плашек. Исследуемую плазму инкубируют в плашках в буфере, предотвращающем связывание C1q компонента классического пути активации комплемента, и после связывания комплекса МСЛ/МАСП с маннаном добавляют препарат очищенного компонента С4, после чего определяют количество иммобилизованных молекул С4b биотинилированными анти-С4 антителами. На завершающем этапе тестирования используют Eu-меченый стрептавидин [Thiel et al. Assay for the functional activity of the mannan-binding lectin pathway of complement activation // Immunobiol. - 2002. - V.205. - P.446-454]. Этим способом определяют только функционально активный МСЛ. Недостатком данного метода является длительность процедуры исследования, многостадийность и необходимость использования очищенного дорогостоящего препарата компонента С4 в качестве субстрата МАСП, что ограничивает его использование в рутинных исследованиях.

Наиболее близким техническим решением является способ оценки состояния иммунной системы организма человека по пектиновому пути на основе определения активности комплекса МСЛ/МАСП путем измерения потребления комплемента по продуктам его активации - С3а и С4а в плазме крови, содержащей этилендиаминотетрауксусную кислоту (ЭДТА) in vitro, по разности этих показателей до и после инкубации в течение 30 мин при 37°С [Hugli Т.Е., et at. US Patent №6,297,024-2001]. Недостатком данного способа являются трудоемкость и длительность процедуры исследования (2,5 часа), использование дорогостоящих и малодоступных для рутинных исследований моноклональных анти-С3а и анти-С4а антител.

Техническим результатом предлагаемого способа является расширение арсенала способов оценки состояния иммунной системы организма человека, упрощение, сокращение длительности процедуры исследования, а также его удешевление.

Этот результат достигается тем, что исследуемую сыворотку инкубируют 0 и 30 мин в буфере, содержащем ЭДТА, после чего добавляют эритроциты барана, сенсибилизированные антителами кролика, оттитрованное количество раствора Са2+ и Mg2+ для нейтрализации ЭДТА, дополнительно инкубируют, а показатели потребления комплемента определяют по степени лизиса эритроцитов. Показатели потребления комплемента до 30% оценивают как сниженную реакцию иммунной системы организма человека, от 30% до 70% как нормальную, а свыше 70% как повышенную.

Способ оценки состояния иммунной системы организма человека осуществляют следующим образом. Способ включает забор крови, приготовление сыворотки, проведение гемолитического теста и расчет функциональной активности пектинового пути.

Гемолитический тест проводят с использованием стандартизованных эритроцитов барана (1,5×108 кл/мл), сенсибилизированных антителами кролика (ЕА), в вероналовом солевом буфере, содержащем 0,5 мМ MgCl2 и 0,15 мМ CaCl2 (VBS2+) и в вероналовом буфере, содержащем 10 мМ ЭДТА (VBSE), по стандартному методу [Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник / Меньшиков В.В., Делеторская Л.Н., Золотницкая Р.П. и др.: Под ред. В.В. Меньшикова. - М.: Медицина, 1987. - 368 с.].

Пример 1. Определение потребления комплемента в сыворотках крови здоровых испытуемых при предварительной инкубации в условиях вероналового солевого буфера с добавлением 10 мМ ЭДТА (VBSE). 20 мкл сыворотки, разведенной 1:9, инкубируют в общем объеме 290 мкл, доведенном буфером VBSE, в течение 0 и 30 мин при 37°С. После инкубации в пробы добавляют по 200 мкл эритроцитов барана, сенсибилизированных антителами кролика (ЕА) и 10 мкл оттитрованного количества раствора Са2+ и Mg2+ для нейтрализации ЭДТА и продолжают инкубацию в течение 30 мин при 37°С. Реакцию останавливают добавлением 2,5 мл холодного раствора 0,15 М Nad, суспензию центрифугируют и определяют степень лизиса ЕА по величине оптического поглощения гемоглобина в супернатанте при длине волны 412 нм (A412). Степень лизиса эритроцитов (У) определяют по формуле:

где Н, R и X - величины оптической плотности А412 в геополитических системах при полном лизисе, в контроле спонтанного лизиса ЕА и в опытной пробе соответственно.

Потребление комплемента (ПК) в сыворотках определяют как разность показателей до и после инкубации по формуле:

где У(0') - степень лизиса ЕА до инкубации сыворотки, У(30') - степень лизиса ЕА после инкубации сыворотки в течение 30 мин в условиях буфера VBSE. Полученные данные приведены ниже (фиг.1).

Как видно на фиг.1, потребление комплемента в сыворотках крови контрольной группы колебалось от 30 до 70%. Потребление комплемента на уровне от 30 до 70% у здоровых испытуемых контрольной группы нами принято за показатель, который характеризует нормальное состояние иммунной системы организма человека.

Пример 2. Определение потребления комплемента в сыворотках больных с хроническим алкоголизмом. Были тестированы сыворотки 8 больных с хроническим алкоголизмом предлагаемым вышеописанным способом. Результаты представлены на фиг.2.

Как видно на фиг.2, у двух больных не определяется потребление комплемента, у трех показатель потребления комплемента ниже 30%, у двух в пределах нормальных величин (от 30% до 70%) и у одного больного выше 70%. Полученные результаты свидетельствуют о снижении реакции иммунной системы у 63% больных с хроническим алкоголизмом.

Пример 3. Определение потребления комплемента в сыворотках больных с сердечно-сосудистыми заболеваниями. Были тестированы сыворотки 17 больных с заболеваниями сердечно-сосудистой системы предлагаемым вышеописанным способом.

Проведенные исследования показали, что у всех больных с сердечно-осудистыми заболеваниями наблюдается либо сниженное потребление комплемента либо полное его отсутствие (82% больных). Отсутствие потребления комплемента свидетельствует о функциональном иммунодефиците пектинового пути активации системы комплемента, который сопровождается нарушением опсонизации, фагоцитоза патогенов и апоптозных клеток в организме человека.

Пример 4. Определение потребления комплемента в сыворотках крови женщин с воспалительными заболеваниями матки и придатков. Предлагаемым вышеописанным способом были тестированы сыворотки 15 женщин с воспалительными заболеваниями матки и придатков. Результаты представлены на фиг.3.

Как видно на фиг.3, у 8 из 15 (73%) исследованных сывороток потребление комплемента колебалось от 76 до 97% (выше 70%), что свидетельствует об адекватной повышенной реакции иммунной системы организма на воспалительный процесс.

Преимущества предлагаемого способа перед известными заключаются в упрощении процесса, сокращении длительности процедуры исследования с 2 час 30 мин до 1 час 20 мин, а также его удешевлении. Данный способ оценки состояния иммунной системы организма человека позволяет выявлять доклинические состояния иммунодефицита, проводить углубленное исследование патогенеза аутоиммунных заболеваний, дает возможность их ранней профилактики и позволяет контролировать эффективность проводимой терапии.

Фиг.1
Показатели потребления комплемента в сыворотках крови здоровых испытуемых (контрольная группа) до и после инкубации
№сывороткиДо инкубации У(0'), %После инкубации У(30'), %ПК, % разность У(0') и У(30')
11006832
21006238
31005545
41004357
51005743
61003565
71004852
81003070
91003862
101007030

Фиг.2
Показатели потребления комплемента в сыворотках крови больных с хроническим алкоголизмом до и после инкубации
№сывороткиДо инкубации У(0'), %После инкубации У(30'), %ПК, % разность У(0') и У(30')
11005941
21004357
31001000
4100946
51007921
61008812
71001000
81001387

Фиг.3
Показатели потребления комплемента в сыворотках крови женщин с воспалительными заболеваниями матки и придатков
№сывороткиДо инкубации У(0'), %После инкубации У(30'), %ПК, % (разность У(0') и У(30')
11001387
21001684
3100595
41002575
51002179
6100892
71001882
81002377
9100397
101002476
111008812
121002872
13100928
141008515
151008218

Способ оценки состояния иммунной системы организма человека по лектиновому пути на основе определения активности комплекса маннан-связывающего лектина с ассоциированными сериновыми протеазами путем измерения потребления комплемента сыворотки крови в буферном растворе с добавлением этилендиаминотетрауксусной кислоты in vitro пo разности этих показателей до и после инкубации в течение 30 мин при 37°С, отличающийся тем, что в исследуемую сыворотку крови добавляют эритроциты барана, сенсибилизированные антителами кролика, и оттитрованное количество раствора Са2+ и Mg2+ дополнительно инкубируют, показатели потребления комплемента определяют по степени лизиса эритроцитов, при наличии показателей потребления комплемента до 30% оценивают как сниженную реакцию иммунной системы организма человека, от 30 до 70% как нормальную, свыше 70% как повышенную.