Способ экспресс-оценки динамики метаболизма системы крови

Способ экспресс-оценки динамики метаболизма системы крови

Реферат

Изобретение относится к области медицины, а именно к лабораторному исследованию биологических жидкостей, в частности крови и ее препаратов.

Известен широкий набор биохимических способов исследования биологических жидкостей, в том числе крови, для определения тех или иных молекулярных составляющих метаболизма на основе использования специальных реагентов и соответствующего для каждого способа биохимического оборудования (см., например, Методы биохимических исследований. Учебн. пособие. / Под. ред. М.И.Прохоровой. - Л.: Изд-во Ленингр. ун-та, 1982. - 272 с.).

Как правило, эти способы узко специфичны и поэтому не могут быть использованы для комплексной экспресс-оценки динамики метаболизма системы крови в рамках единого методического подхода. Кроме того, указанные известные биохимические способы требуют наличия набора реактивов, использования промежуточных реакций, различных видов сепарирования, термостатирования и др.

В биохимии известна и широко используется абсорбционная спектрометрия биологических жидкостей в ультрафиолетовой, видимой и инфракрасной областях спектра светового потока, отражающая состояние электронных энергетических уровней молекул (см., например, CN 1579322, 2005.02.16; US 2002180964, 2002.12.05; US 6330058, 2001.12.11; WO 9624837, 1996.08.15; WO 9408237, 1994.04.14). Спектр поглощения представляет собой график зависимости интенсивности поглощения (абсорбции) света, выражаемой в единицах оптической плотности, от его длины волны. Известна также разностная спектрометрия, при которой регистрируют спектр, пропуская два световых пучка через две строго выверенные кюветы: один из пучков - через кювету сравнения, другой - через кювету с исследуемым образцом (см., например, Мецлер Д. Биохимия. Химические реакции в живой клетке. Т.3. - М.: Мир, 1980. - С.5-27).

Известны из различных источников научно-технической информации спектральные области поглощения белков, ароматических аминокислот, дисульфидных связей, соединений азота, карбонильных групп и других химических соединений, а также способы их спектрометрического определения (см., например, Герцберг Г. Электронные спектры и строение многоатомных молекул. - М.: Мир. - 1969; Аскаров К.А. и соавт. Порфирины: структура, свойства, синтез. - М.: Наука. - 1985; Соловьев К.Н. и соавт. Спектроскопия порфиринов: колебательные состояния. - Минск: Наука и техника. - 1985).

К недостаткам выявленных по источникам научно-технической информации способов спектрометрии крови и ее препаратов относится узкая специфичность исследуемых областей спектра и использование для исследований в качестве препаратов крови плазмы или сыворотки крови, что оставляет вне контроля внутренний состав форменных элементов крови, главным образом эритроцитов, состав которых существенно важен для оценки метаболических процессов.

Наиболее близким по технической сущности к заявляемому изобретению является способ по патенту RU 2246898, 2005.02.27, включающий абсорбционную спектрометрию проб препарата крови с последующим анализом амплитуд пиков полос поглощения.

Недостатками известного способа являются длительность и сложность подготовки проб препарата крови, в качестве которого используют высушенную сыворотку крови в виде суспензии в вазелиновом масле, а также сложность математической обработки при анализе спектрограмм. Кроме того, этот способ, как и ранее перечисленные, не позволяет оценить метаболическую динамику состава форменных элементов, в первую очередь эритроцитов.

Задачей настоящего изобретения является упрощение способа и сокращение времени исследования, а также обеспечение возможности комплексной оценки динамики метаболизма системы крови, включая внутренний состав форменных элементов в рамках единого методического подхода.

Поставленная задача решается тем, что в известном способе, включающем абсорбционную спектрометрию проб препарата крови с последующим анализом амплитуд пиков полос оптического поглощения, в качестве препарата крови используют водный гемолизат цельной крови, получаемый путем смешивания цельной крови с дистиллированной водой до концентрации 1/1000-1/500, а спектрометрические измерения оптического поглощения проб гемолизата крови осуществляют в диапазонах длин волн 200-240 нм, 260-280 нм, 340-345 нм, 410-420 нм, 530-570 нм и определяют величины и направленность изменений амплитуд пиков полос оптического поглощения проб гемолизата крови пациента в процессе лечения или проведения процедур относительно исходных величин, по которым судят о динамике метаболизма системы крови вследствие проведенного лечения или процедуры.

Способ осуществляется следующим образом.

Заборы проб крови производят утром в период с 8 до 11 часов из пальца руки без антикоагулянта в объеме 0,01-0,05 мл. Взятую порцию цельной крови смешивают с дистиллированной водой до концентрации 1/1000-1/500 с последующей выдержкой не менее 10 минут при одновременном перемешивании. Полученный гемолизат наливают в кювету спектрофотометра, например, типа СФ-2000 и регистрируют спектрограмму гемолизата относительно дистиллированной воды в диапазоне длин волн от 200 до 600 нм. Спектрограмма представляет собой график зависимости интенсивности поглощения (абсорбции) света водным гемолизатом крови, выражаемой в единицах оптической плотности, от длины волны. Повторные заборы крови производят в процессе лечения или после проведения лечебных процедур, и повторяют регистрацию спектрограмм проб гемолизата крови по вышеизложенному способу. По полученным спектрограммам анализируют пики полос поглощения в диапазонах 200-240 нм, 260-280 нм, 340-345 нм, 410-420 нм, 530-570 нм, при этом определяют величины и направленность изменений амплитуд пиков полос оптического поглощения проб гемолизата крови пациента в процессе лечения или проведения процедур относительно исходных величин, по которым судят о динамике метаболизма системы крови вследствие проведенного лечения или процедур.

При анализе пиков на спектрограмме исходят из известных по литературным источникам данных (см., например, Мецлер Д. Биохимия. Химические реакции в живой клетке. Т.3. - М.: Мир, 1980. - С.5-27; Кантор Ч., Шиммел П. Биофизическая химия: В 3-х т. Пер. с англ. - М.: Мир, 1984. - Т.2. - С.32-45 и др.). Диапазон 200-240 нм соответствует электронным спектрам поглощения (ЭСП) пептидных и химических связей, отражая уровень их возбуждения. Диапазон 260-280 нм соответствует максимуму ЭСП белков и ароматических аминокислот триптофана, тирозина и фенилаланина. Помимо трех указанных ароматических аминокислот в этой области поглощают дисульфидные связи. Диапазон 340-345 нм относят к ЭПС металлов и пептидных металлокомплексов. Полоса Соре (диапазон длин волн 410-420 нм) относится к ЭСП порфирина, который представлен в водном гемолизате крови порфиринсодержащим белком крови - гемоглобином. При этом, чем больше порядок связей в ароматическом макроцикле гема (рост ароматичности), тем сильнее сближаются граничные орбитали, что отвечает более длинноволновому положению полосы Соре в электронных спектрах поглощения. С ростом ароматичности возрастает способность порфиринов к отщеплению протонов в процессе их кислотной диссоциации, происходящей вследствие понижения энергии низкой вакантной молекулярной орбитали, т.е. самой низкой по энергии разрыхляющей орбитали, которая определяет поведение порфиринов в реакциях восстановления, образования анион-радикальных форм и нуклеофильного замещения. Изменения оптической плотности в диапазоне 530-570 нм отвечают электронным переходам с электронного уровня основного состояния на электронно-колебательные подуровни, а также выходу металла из плоскости гема с сохранением исходной конфигурации порфиринового макроциклического хромофора, несущей преимущественно сигма-характер химической связи металл-азот. Изменение спина атома железа порфиринового кольца сопровождается изменением его ковалентного радиуса. Поэтому переход от низкоспинового к высокоспиновому состоянию железа приводит к расширению порфиринового макроцикла, что и обуславливает уменьшение частот колебаний углеродных связей метиновых мостиков, а следовательно, и изменение спектров поглощения этих связей.

Таким образом, сравнительный анализ спектрограмм показывает активность и направленность метаболических процессов в организме, указывая на возможные биохимические механизмы имеющих место изменений.

На чертеже представлен пример спектрограмм водного гемолизата крови при концентрации 1/1000 пациента до (спектрограмма 1) и после (спектрограмма 2) курса КВЧ-терапии аппаратом «Стелла-1» (КВЧ - крайне высокие частоты - ГГц диапазон).

Диапазон норм величин оптической плотности водного гемолизата крови при концентрации 1/1000, установленный опытным путем для ряда длин волн анализируемых диапазонов, приведен в таблице.

Длина волны, нм	235	275	340	410-412	540
Оптическая плотность, ед. ОП	1,1-1,5	0,5-0,6	0,3-0,4	1,1-1,7	0,15-0,22

Из спектрограмм (см. чертеж) наглядно видно, что после КВЧ-терапии произошел сдвиг метаболических систем крови в сторону нормализации.

Положительный эффект заявляемого способа соответствует поставленной задаче изобретения и состоит в упрощении и сокращении времени оценки динамики метаболизма системы крови с учетом роли внутреннего состава форменных элементов.

Способ экспресс-оценки динамики метаболизма системы крови, включающий абсорбционную спектрометрию проб препарата крови с последующим анализом амплитуд пиков полос оптического поглощения, отличающийся тем, что в качестве препарата крови используют водный гемолизат цельной крови, получаемый путем смешивания цельной крови с дистиллированной водой до концентрации 1/1000-1/500, а спектрометрические измерения оптического поглощения проб гемолизата крови осуществляют в диапазонах длин волн 200-240 нм, 260-280 нм, 340-345 нм, 410-420 нм, 530-570 нм и определяют величины и направленность изменений амплитуд пиков полос оптического поглощения проб гемолизата крови пациента в процессе лечения или проведения процедур относительно исходных величин и нормативных значений, по которым судят о динамике метаболизма системы крови вследствие проведенного лечения или процедуры.