Способ диагностики на основе раствора

Способ диагностики на основе раствора

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к способам диагностики медицински релевантных состояний путем детекции уровней соответствующих маркеров, являющихся признаком медицински релевантного состояния, и уровней маркеров нормализации. Эти способы относятся к характеризации образца в форме раствора без использования информации о морфологии клеток.

Предшествующий уровень техники

Современная диагностика большого числа медицински релевантных состояний основана на использовании молекулярных маркеров в качестве инструментальных средств. Такие молекулярные средства обычно представляют собой один из аспектов комплексного исследования и позволяют учитывать ряд различных параметров, характеризующих исследуемые образцы.

В медицински релевантном анализе морфологическое исследование образцов обычно осуществляют цитологическими или гистологическими способами. Эти способы основаны на морфологической характеризации клеточных образцов и применяются для анализа медицинских образцов, таких как физиологические жидкости, кровь, хирургические срезы, секреты, мазки или лаважи.

При скрининг-анализе, например, на рак шейки матки, проводимом в целях детекции неопластических поражений шейки матки, используются мазки. В этой скрининг-процедуре обнаруживаются поражения различного происхождения. Причинами, вызывающими такие поражения, могут быть, например, воспаления (вызванные инфекционными агентами либо физическими, или химическими повреждениями) или предопухолевые и опухолевые изменения. При морфологическом анализе трудно различить поражения различного характера. Так, например, для анализа мазков цитологи и патологи должны пройти особую подготовку, и даже опытные специалисты-диагносты при проведении диагностических анализов цитологических образцов получают результаты, которые в высокой степени отличаются как от наблюдений других сотрудников, так и от их собственных наблюдений. Вообще говоря, результат такого исследования основан на субъективной интерпретации диагностических критериев патологом/цитологом, проводящим исследование. В итоге число ложноположительных и ложноотрицательных результатов в таких скрининг-анализах является недопустимо высоким.

Поэтому во многих случаях такие цитологические или гистологические анализы подтверждают с помощью молекулярных маркеров. Такие маркеры часто используют в реакциях иммуногистохимического окрашивания либо в реакциях in situ-гибридизации. В уже разработанных комбинированных исследованиях по морфологии и реакциям иммуногистохимического окрашивания, основанным на использовании маркерных молекул, характеристика различных медицински релевантных состояний тканей или клеток может давать лучшие результаты - см., например, публикацию ЕР 1,217,377. Однако морфологическое исследование все еще остается трудоемким процессом, который требует много времени, а поэтому является дорогостоящим даже при его подтверждении молекулярными методами, которые дают более надежные результаты. Кроме того, диагноз, поставленный на основе данных клеточно-морфологического анализа, даже при его подтверждении молекулярными параметрами зависит от субъективной оценки морфологии отдельными специалистами. Таким образом, диагноз зависит от специалиста, проводящего исследование.

Только в очень редких случаях молекулярные маркеры могут быть использованы в качестве диагностических средств, не требующих дополнительного подтверждения путем проведения морфологического исследования клеток. Особенно это относится к тем случаям, когда маркеры должны быть детектированы в такой среде, где они встречаются лишь в строго определенных условиях. Таким образом, методы диагностики медицинских состояний, осуществляемые лишь на молекулярном уровне и не подтвержденные информацией о морфологии клетки, ограничены лишь теми методами, где используются подходящие маркеры, которые являются строго специфичными для диагностируемого состояния. Так, например, обнаружение вирусных инфекций может быть осуществлено в растворах образцов, поскольку маркеры, указывающие на присутствие вирусов в тканях, не обнаруживаются в нормальных тканях человека.

Воспроизводимость результатов таких исследований может быть повышена путем применения подтверждающих молекулярных методов. Однако проблема, связанная с хранением и получением образцов, не может быть решена лишь дополнительным использованием молекулярных маркеров.

При использовании молекулярных методов в цитологических или гистологических анализах необходимо соблюдать жесткие меры предосторожности при хранении образцов для предотвращения образования артефактов и получения ложных результатов тестов. Это вызвано отчасти отсутствием информации о морфологии клеток, а отчасти нестабильностью молекулярных маркеров, детектируемых во время проведения тестов. Если приготовление, транспортировка или хранение образцов не соблюдаются надлежащим образом, то информация о клетках или даже молекулярная информация может быть вообще утрачена или искажена. Поэтому в данном случае диагноз не может быть установлен либо он может быть ложным. Так, например, интерпретация биоптата или цитологических препаратов часто представляет значительные трудности или вообще невозможна из-за повреждения клеток (физического или биохимического). Что касается образцов ткани или биоптатов, то сохранение молекулярной структуры образцов, которые подвергаются быстрому метаболизму, представляется довольно трудной задачей, поскольку до помещения всего образца в соответствующие консерванты проходит много времени.

Диагностические методы, подтверждаемые морфологическими анализами и осуществляемые в соответствии со стандартными процедурами, имеют два главных недостатка. Во-первых, эти методы в высокой степени зависят от субъективной оценки исследователя. Во-вторых, информация, полученная в морфологических исследованиях, является достаточно чувствительной к процессам разрушения клеток, а поэтому она может приводить к возникновению артефактов после получения образцов. Оба этих аспекта являются причиной плохой воспроизводимости результатов.

Для улучшения диагностики медицински релевантных состояний желательно разработать такие способы, которые не зависели бы от результатов морфологического исследования клеток.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение относится к способу диагностики медицински релевантного состояния пациента. Этот способ включает в себя стадии получения исходного образца, содержащего клетки или клеточный дебрис, полученный из клеток, взятых у пациента; получения раствора указанного исходного образца; детекции уровней одного или нескольких релевантных маркеров, ассоциированных с указанным медицински релевантным состоянием в указанном растворе образца; детекции уровней одного или нескольких маркеров нормализации; нормализации детектируемого уровня релевантных маркеров по указанным параметрам нормализации; и диагностики медицински релевантного состояния, исходя из нормализованных уровней указанных релевантных маркеров в растворе образца. Указанные маркеры нормализации коррелируют, по меньшей мере, с одним из нижеследующих параметров нормализации: присутствием или отсутствием клетки конкретного типа среди клеток, присутствующих в растворе образца, наличием или отсутствием конкретного характера дифференцировки клеток, представленных в растворе образца; и наличием или отсутствием соответствующей способности к пролиферации данных клеток, представленных в растворе образца.

В одном из вариантов осуществления изобретения указанным медицински релевантным состоянием является клеточное пролиферативное расстройство, рак или предшествующее ему поражение.

Настоящее изобретение также относится к тест-набору для диагностики медицински релевантного состояния.

Краткое описание графического материала

Настоящая патентная заявка содержит по меньшей мере одну иллюстрацию, выполненную в цвете. Копии этого патента или публикация патентной заявки с цветной(ыми) иллюстрацией(ями) будут предоставлены Патентным ведомством по требованию и после уплаты необходимой пошлины.

На фиг. 1 проиллюстрировано специфическое иммуногистохимическое окрашивание эндоцервикальных и эктоцервикальных эпителиальных клеток в цервикальных срезах. На фиг. 1А показана положительная реакция, детектируемая в цилиндрическом эпителии эндоцервикса (слизистой оболочки канала шейки матки) с использованием антитела, направленного против цитокератина 18 (СК18). На фиг. 1В показано неспецифическое окрашивание в цилиндрическом эпителии эктоцервикса с использованием антитела, направленного против цитокератина 18 (СК18). На фиг. 1С показано неспецифическое окрашивание в цилиндрическом эпителии эндоцервикса с использованием антитела против цитокератина 10/13 (СК10/13). На фиг. 1D показано интенсивное окрашивание сквамозного эпителия эктоцервикса с использованием антитела против цитокератина 10/13 (СК10/13).

На фиг. 2 проиллюстрирован Вестерн-блот-анализ солюбилизированных образцов, взятых из цервикальных мазков. Цифры 1-4 относятся к образцам (цервикальным мазкам), полученным от отдельных пациентов.

На фиг. 3 показаны Вестерн-блот-анализ и анализ ELISA, иллюстрирующие адекватность (компетентность) образцов. Образцы, взятые от четырех пациентов с высокозлокачественной дисплазией шейки матки (см. "Диагностика"), были проанализированы с использованием Вестерн-блот-анализа (верхняя часть на фигуре). В нижней части этой фигуры представлены результаты анализов ELISA.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к способам улучшения диагностики медицински релевантных состояний путем проведения тест-процедур с использованием растворов тестируемых образцов. Настоящее изобретение относится к способу, в котором вместо информации о морфологии клеток, получаемой на основании данных цитологических и/или гистологических анализов тест-образцов, используется молекулярная информация, полученная путем анализа раствора, где исходный тест-образец является растворенным, а поэтому он является пригодным для проведения точного и воспроизводимого анализа исходя из указанных растворенных тест-образцов. Способ согласно изобретению включает в себя стадии определения уровней одного или нескольких маркеров, ассоциированных с диагностируемым состоянием; определения уровня серии маркеров нормализации, которые могут быть использованы вместо информации, относящейся к морфологическим аспектам данного образца, и которые должны установить или подтвердить диагноз, поставленный с использованием клеточной тест-системы; сравнения и/или объединения данных, относящихся к уровням указанных маркеров; и установления диагноза медицински релевантного состояния.

В настоящем изобретении указывается, что диагностика состояний, которые обычно (в клеточных системах диагностики) определяются и/или подтверждаются гистологическими и/или цитологическими анализами, может быть осуществлена в растворах исходных образцов, содержащих клетки различных типов с различными свойствами, способом, включающим следующие стадии: получения исходного образца; растворения указанного образца в соответствующем растворе; детекции уровня одного или нескольких маркеров, ассоциированных с диагностируемым состоянием и, кроме того, одного или нескольких маркеров нормализации в растворе указанного образца; нормализации данных, коррелирующих с уровнем маркеров, ассоциированных с указанным состоянием, с использованием данных, коррелирующих с указанными маркерами нормализации; и диагностики наличия или отсутствия данного состояния исходя из анализа указанного образца.

Способ согласно изобретению может быть применен, например, для первичного скрининг-анализа в случаях, когда обычно проводят цитологический, гистологический или патологический анализ. Применение способа согласно изобретению позволяет определить, можно ли диагностировать данное состояние исходя из анализа данного образца. Если диагноз, основанный на анализе раствора, дает отрицательный результат в отношении наличия конкретного состояния, то проведение дополнительного анализа может оказаться ненужным. Если был получен положительный результат, то он может быть дополнительно подтвержден классическими методами. Таким образом, путем проведения предварительного недорогостоящего и быстрого скрининг-теста можно избежать проведения дорогостоящего и занимающего много времени микроскопического анализа или других подобных анализов.

В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к способу улучшения диагностики медицински релевантных состояний, где диагноз устанавливают с использованием растворов исходных образцов лизированных тканей или клеток. Способ диагностики согласно изобретению основан не на морфологических параметрах, а на биохимическом анализе.

Во втором своем аспекте настоящее изобретение относится к способу характеризации комплексного образца в растворе с помощью молекулярных маркеров, коррелирующих с представляющими интерес параметрами, что позволяет отказаться от получения информации путем проведения цитологических или гистологических анализов тем или иным способом.

В своем третьем аспекте настоящее изобретение относится к подходящим комбинациям маркеров для диагностики конкретного медицински релевантного состояния с использованием комплексных образцов. Маркеры для нормализации выбирают так, чтобы из исходного образца можно было определить параметры, которые помогли бы поставить или подтвердить соответствующий диагноз и которые могли бы заменить данные, утраченные при растворении образца.

В своем четвертом аспекте настоящее изобретение относится к тест-набору для установления диагноза или для проведения научных исследований в соответствии с настоящим изобретением.

Настоящее изобретение позволяет быстро и легко диагностировать данное состояние путем анализа исходного образца, такого как физиологические жидкости, мазки, лаважи (например, бронхоальвеолярные лаважи, лаважи млечных протоков и т.п.), аспираты (аспираты, взятые иглой; аспираты, взятые тонкой иглой) или комплексные клеточные или тканевые образцы. Вообще говоря, проблема, связанная с использованием исходных образцов, заключается в том, что в данном образце присутствуют клетки других типов, а также конкретные микроорганизмы и внеклеточные субстанции. Таким образом, исходный материал содержит смесь клеток и композиций, что может приводить к образованию артефактов. Присутствие клеток различных типов с различными пролиферативными свойствами, а также различных микроорганизмов и веществ в исходном образце приводит к появлению множества факторов, которые могут влиять на конкретный уровень маркерной молекулы. Таким образом, диагностически полезную информацию дает детекция уровня лишь одного единственного молекулярного маркера, если, кроме того определить (морфологические) параметры, относящиеся к исходному образцу. Все морфологические данные, получаемые из исходного образца, утрачиваются из-за лизиса клеток в растворе. Однако имеются подходящие молекулярные маркеры, соответствующие конкретным морфологическим или другим параметрам, получаемым гистологическими и цитологическими методами.

Так, например, информация об одном компоненте в исходном образце может быть получена классическим способом путем исследования под микроскопом. Морфологическое исследование дает сведения о дифференцировке и локализации клеток, а также об окружении указанных клеток. Так, например, конкретные клетки в цитологических препаратах цервикальных мазков могут быть идентифицированы как эпителиальные клетки и, кроме того, они могут быть классифицированы как эндоцервикальные или эктоцервикальные эпителиальные клетки. Путем исследования под микроскопом может быть легко выявлено даже присутствие не-цервикальных клеток, таких как эндометриальные клетки.

В соответствии с настоящим изобретением исходные материалы могут быть непосредственно растворены в соответствующем растворителе, без дополнительного препарирования или характеризации, независимо от гомогенности или гетерогенности исходного материала. Данные, потеря которых обусловлена лизисом материала, содержащегося в растворе образца, определяются уровнями серии маркерных молекул, а поэтому могут быть восстановлены с использованием указанных молекулярных данных для нормализации по соответствующим морфологическим параметрам. Это может быть достигнуто с использованием подходящей серии молекулярных маркеров для каждого из характеристических параметров, необходимых для установления точного диагноза. Путем детекции соответствующего массива маркеров может быть проведена оценка соответствующих параметров, характеризующих данный исходный образец, что позволяет избежать нежелательной потери информации из-за лизиса образца.

Тест-процедура согласно изобретению включает детекцию уровней маркеров, являющихся признаками рассматриваемых клеточных состояний, и маркеров для нормализации данных по параметрам, характеризующим конкретное окружение тестируемого образца. Маркеры, подходящие для использования в настоящем изобретении, могут иметь различное происхождение. Характер экспрессии маркера, подходящего для детекции рассматриваемых состояний, может зависеть от пролиферативного статуса клеток, от статуса дифференцировки клеток, от типа клеток или от вида организма. Примеры подходящих маркеров описаны ниже.

Используемый здесь термин "диагностика", по существу, означает любой анализ на наличие или отсутствие медицински релевантного состояния. Так, например, термин "диагностика" включает в себя процедуры, такие как скрининг на предрасположенность к медицински релевантному состоянию, скрининг на предвестник медицински релевантного состояния, скрининг на медицински релевантное состояние и клинический или патологический диагноз медицински релевантного состояния и т.п. Используемый здесь термин "диагностика медицински релевантного состояния" может включать в себя оценку любого состояния, детектируемого на цитологическом, гистологическом, биохимическом или молекулярно-биологическом уровне, и может относиться к здоровью и/или организму человека. Такие исследования могут включать в себя, например, анализы, проводимые методами медицинской диагностики, и научные исследования в области биологии. В одном из вариантов осуществления изобретения такой метод используется для диагностики медицински релевантных состояний, например, таких как заболевания. Такими заболеваниями могут быть, например, расстройства, характеризующиеся пролиферацией клеток или тканей дикого типа.

В одном из вариантов осуществления изобретения термин "диагностика" относится к диагностике рака и предраковых состояний, к мониторингу течения ракового заболевания, к прогностической оценке рака и к обнаружению диссеминированных опухолевых клеток, например, в процессе установления диагноза минимального остаточного заболевания. Способ согласно изобретению может быть, например, применен для клинической или патологической диагностики рака и предраковых состояний или в рутинных скрининг-тестах, осуществляемых для выявления конкретного ракового заболевания, таких как, например, анализы мазков, например, в скрининг-тестах на поражения шейки матки, анализ бронхиальных лаважей на рак легких, или анализ на поражение желудочно-кишечного тракта, например, на поражение прямой и толстой кишки.

Способ согласно изобретению может быть применен ко всем типам медицински релевантных состояний.

Используемый здесь термин "медицински релевантные состояния" может, например, включать в себя состав тканей, физиологических жидкостей, секретов, промывок или мазков. Понятие "состояния" может, например, подразумевать клеточный состав физиологических жидкостей, такой как состав крови, состав жидкости или состав спермы. В этом контексте термин "состав" будет означать, например, присутствие или отсутствие клеток конкретных типов (например, патогенов, таких как вирусы и т.п.; пренеопластических, неопластических и/или диспластических клеток и т.п.), наличие или отсутствие определенного характера дифференцировки клеток конкретного типа, общее число клеток конкретного типа (например, эритроцитов, лейкоцитов, клеток спермы и т.п.), общее число всех клеток любого типа или фракции клеток с другими свойствами, присутствующих или отсутствующих в данном образце.

Кроме того, термин "медицински релевантные состояния" может также включать в себя нарушения, относящиеся к клеткам или тканям. Термин "диагностируемые состояния" может включать параметры, относящиеся к клеткам в цитологических или гистологических образцах тканей. Термин "состояния" может включать определенный характер дифференцировки клеток в образце тканей, таком как образцы хирургических срезов, биоптаты, мазки, лаважи и т.п. Такими состояниями могут быть, например, наследственные расстройства, воспалительные заболевания, механические нарушения, травмы, сосудистые заболевания, дегенеративные нарушения, нарушения роста, доброкачественные опухоли и злокачественные опухоли. В другом аспекте согласно изобретению такими расстройствами могут быть расстройства, характеризующиеся наличием или отсутствием пролиферативных свойств. Состояниями, характеризующимися наличием или отсутствием пролиферативных свойств, могут быть, например, клеточные пролиферативные расстройства.

Клеточные пролиферативные расстройства согласно изобретению включают в себя заболевания, характеризующиеся способностью клеток или тканей к аномальному росту по сравнению с нормальным ростом контрольных клеток или тканей. Рост таких клеток или тканей может быть, например, аномально ускоренным, пониженным, либо он может подвергаться аномальной регуляции. Используемый здесь термин "аномальная регуляция" может означать любую форму присутствия или отсутствия клеточного или тканевого ответа не-дикого типа на природные процессы, влияющие на регуляцию роста. Термин "аномалии роста клеток или тканей" может означать, например, неоплазию или гиперплазию.

В одном из вариантов осуществления изобретения клеточными пролиферативными расстройствами являются опухоли. Термин "опухоли" может включать опухоли головы и шеи, опухоли дыхательных путей, опухоли аногенитального тракта, опухоли желудочно-кишечного тракта, опухоли мочевой системы, опухоли репродуктивной системы, опухоли эндокринной системы, опухоли центральной и периферической нервной системы, опухоли кожи и ее деривата, опухоли мягких тканей и костей, опухоли лимфопоэтической и гематопоэтической системы и т.п. Термин "опухоли" может также означать неоплазмы, такие как доброкачественные и злокачественные опухоли, карциномы, саркомы, лейкозы, лимфомы или дисплазии. В конкретном варианте осуществления изобретения такими опухолями являются, например, рак головы и шеи, рак дыхательных путей, рак аногенитального тракта, рак желудочно-кишечного тракта, рак кожи и ее деривата, рак центральной и периферической нервной системы, рак мочевыделительной системы, рак репродуктивной системы, рак эндокринной системы, рак мягких тканей и костей, рак лимфопоэтической и гематопоэтической системы и т.п.

Опухоли аногенитального тракта могут включать в себя рак промежности, рак кожи промежностно-мошоночной области, рак шейки матки, рак вульвы, рак влагалища, рак пениса, рак заднего прохода и т.п. Рак шейки матки может включать в себя сквамозные поражения, железистые поражения или другие эпителиальные опухоли. Сквамозные поражения включают в себя, например, интраэпителиальные опухоли шейки матки (слабая, умеренная и значительная дисплазия), карцинома in situ, плоскоклеточная карцинома (кератинизирующие, не-кератинизирующие, сосочковые, онкопластические, папиллярные и лимфоэпителиомоподобные карциномы). Железистые поражения могут включать в себя атипичные гиперплазии, аденокарциномы in situ, аденокарциномы (например, слизеобразующая, эндометриоидная, аденокарцинома прозрачных клеток, злокачественная денома, папиллярная, серозная или мезонефрическая аденокарцинома). Другие эпителиальные опухоли могут включать в себя аденосквамозную карциному, стекловидноклеточную карциному, аденокистозную карциному, аденобазальноклеточную карциному, карциноидную опухоль, мелкоклеточную карциному и недифференцированную карциному. Для более подробной информации можно обратиться к работе "Kurman R., Norris H. et al., Tumors of the Cervix, Vagina and Vulva, Atlas of Tumor Pathology, 1992, AFIP", содержание которой вводится в настоящее описание посредством ссылки.

Опухоли желудочно-кишечного тракта могут включать в себя рак ободочной кишки, рак восходящей ободочной кишки, нисходящей ободочной кишки, поперечной ободочной кишки, сигмовидной ободочной кишки, рак прямой кишки, рак тонкой кишки, рак тощей кишки, рак двенадцатиперстной кишки, рак желудка, рак пищевода, рак печени, рак желчных путей, рак билиарной системы, рак поджелудочной железы и т.п. Исчерпывающее описание поражений желудочно-кишечного тракта приводится в работе "Hamilton Sr., Aaltonen LA (Eds.): World Health Organization Classification of Tumors, Pathology and Genetics of Tumors of the Digestive System, LARC Press: Lyon 2000", которая вводится в настоящее описание посредством ссылки.

Термин "опухоли дыхательных путей" может означать любое злокачественное заболевание дыхательных путей, такое, например, как, рак легких, альвеол, бронхиол, бронхиального дерева и бронхов, рак носоглотки, рак ротовой полости, рак гортани, рак носовой полости и околоносовой пазухи. К раку легких относится мелкоклеточный рак легких, не-мелкоклеточный рак легких, плоскоклеточная карцинома легких, мелкоклеточная карцинома легких, аденокарцинома легких, крупноклеточная карцинома легких, плоскоклеточная аденокарцинома легких, карциноидная опухоль легких, опухоль бронхиальных желез или (злокачественная) мезотелиома. Общее описание опухолей дыхательных путей можно найти в работе Colby T.V. et al.: Tumors of the Lower Respiratory Tract, Atlas of Tumor Pathology, Third Series, Fascicle 13, AFIP: Washington 1995", которая вводится в настоящее описание посредством ссылки.

Опухоли мочевыделительной системы могут включать в себя рак мочевого пузыря, рак почек, рак почечной лоханки, рак мочеточника, рак уретры и т.п. Опухоли репродуктивной системы могут включать в себя рак и предрак яичника, матки, яичек, предстательной железы, эпидидимиса и т.п.

Во всех случаях способы согласно изобретению могут также применяться для лечения предопухолевых поражений, опухолей или рака.

В одном из вариантов осуществления изобретения способ согласно изобретению предусматривает детекцию диссеминированных опухолевых клеток или метастазов.

В одном из вариантов осуществления изобретения карциномой является, например, рак шейки матки, рак ободочной кишки, рак желудка, рак молочной железы, рак мочевого пузыря, рак легких, рак ротовой полости и т.п.

Настоящее изобретение относится к ряду надежных, быстрых и легких способов сохранения молекулярных свойств образцов и тем самым предотвращения потери морфологической информации, которую содержат данные образцы. Такие образцы могут быть, например, получены в воспроизводимой и удобной для хранения и транспортировки форме путем растворения клеточных компонентов исходного образца в подходящем растворителе сразу после получения образца или даже во время его получения. Физиологические жидкости могут быть непосредственно перенесены из организма индивидуума в раствор, содержащий подходящие детергенты и консерванты. Кроме того, образцы тканей могут быть непосредственно перенесены в условия денатурирующего лизиса (фактически поддерживаемые физическими силами) и таким образом они могут быть сохранены. Молекулярные компоненты исходного образца могут быть сохранены с использованием соответствующих ингредиентов в растворителе, а поэтому они не могут подвергаться деградации. Деградация ферментативных активностей может быть, например, минимизирована с использованием ингибиторов ферментов. Таким образом, в растворе тест-образцов могут легко сохраняться молекулярные свойства тест-образца в процессе растворения и при этом не требуется соблюдения каких-либо дополнительных условий хранения.

Термин "исходные образцы" может включать в себя клинические образцы, такие как секреты, мазки, лаважи, физиологические жидкости, пробы крови, мочи, спермы, кала, желчи и жидкости, образцы костного мозга, биоптаты и образцы клеток и тканей. Термин "биоптат", используемый в контексте настоящего изобретения, может включать, например, срезы опухолей, образцы тканей, взятые эндоскопическими методами или путем трепанобиопсии или пункционной (аспирационной) биопсии органов. Кроме того, образцом согласно изобретению может быть любой образец, потенциально содержащий детектируемые маркерные молекулы. В одном из вариантов осуществления изобретения указанный образец включает цервикальные мазки, бронхиальные лаважи, кал и т.п. Термин "исходный образец", используемый в контексте настоящего изобретения, может включать в себя фиксированные или находящиеся на хранении образцы клеток или тканей. Так, например, клетки, сохраненные в подходящих растворах (спиртах и т.п.), или фиксированные образцы тканей могут быть использованы в качестве исходных образцов в способах согласно изобретению.

Исходным образцом, используемым в способе согласно изобретению, является любой образец, содержащий клетки или клеточный дебрис. Такими клетками могут быть, например, прокариотические или эукариотические клетки.

В случае, если настоящее изобретение относится к обнаружению инфекционных заболеваний, то определяемыми клетками могут быть клетки микроорганизмов, таких как хламидии, E.coli, Candida и т.п.

В соответствии с настоящим изобретением все молекулярные компоненты исходных образцов или их часть являются солюбилизированными в подходящем буфере для лизиса, содержащем, например, растворители. Такими растворителями могут быть, например, водные растворы хаотропных агентов, таких как мочевина, GuaSCN, формамид, водные растворы детергентов, таких как анионогенные детергенты (например, ДСН, N-лаурилсаркозин, дезоксихолат натрия, алкиларилсульфонаты, сульфаты длинноцепочечных (жирных) спиртов, сульфаты и сульфонаты олефинов, сульфаты и сульфонаты альфа-олефинов, сульфированные моноглицериды, сульфированные эфиры, сульфосукцинаты, алкансульфонаты, сложные эфиры фосфорной кислоты, алкилизетионаты, сложные эфиры сахарозы), катионогенные детергенты (например, хлорид цетилтриметиламмония), неионогенные детергенты (например, Твин-20, Nonidet P-40, Тритон Х-100, NP-40, Igepal CA-630, N-октилглюкозид) или амфотерные детергенты (например, CHAPS, 3-додецилдиметиламмонийпропан-1-сульфонат, оксид лаурилдиметиламина) и/или водные растворы гидроксидов щелочных металлов, таких как, например, NaOH или КОН. Растворитель выбирают так, чтобы в нем могли растворяться клетки, клеточный дебрис, нуклеиновые кислоты, полипептиды, липиды и другие биомолекулы, которые, возможно, присутствуют в исходном образце. Раствор для растворения исходных образцов согласно изобретению может, кроме того, содержать один или несколько агентов, предотвращающих деградацию компонентов в данных исходных образцах. Такими компонентами могут быть, например, ингибиторы ферментов, такие как ингибиторы протеиназы, ингибиторы РНКазы, ингибиторы ДНКазы и т.п. В одном из вариантов осуществления изобретения образец подвергают лизису в той форме, в которой он был непосредственно взят у индивидуумов, подвергаемых обследованию. В другом варианте осуществления изобретения данный образец может быть, кроме того, очищен, а затем подвергнут лизису. Такие процедуры очистки могут, например, включать удаление (путем промывки) примесей, таких как слизь или т.п., выделение или концентрирование клеточных компонентов, сохранение и транспортировку клеток. Так, например, клеточные компоненты исходных образцов могут быть включены в один раствор образца.

Получение образца для его использования в описанном здесь способе может также включать в себя несколько дополнительных стадий приготовления образца, таких как отделение нерастворимых компонентов, выделение полипептидов или нуклеиновых кислот, получение фиксированных на твердой фазе пептидов или нуклеиновых кислот, или получение сфер, мембран или предметных стекол, с которыми могут ковалентно или нековалентно связываться определяемые молекулы.

В соответствии с настоящим изобретением детекцию маркерных молекул осуществляют непосредственно в этом растворе. Такая детекция может быть осуществлена в растворе или с использованием реагентов, фиксированных на твердой фазе. В некоторых вариантах осуществления изобретения детекцию маркерных молекул осуществляют в растворе растворенных в нем физиологических образцов. Поэтому такая детекция может быть проведена в растворе или с использованием реагентов, фиксированных на твердой фазе. Твердой фазой, используемой в контексте настоящего изобретения, могут быть твердые вещества различных типов, такие как плоские поверхности и частицы (включая микро- и наночастицы или даже более мелкие частицы). В некоторых вариантах осуществления изобретения такими частицами могут быть сферы, коллоиды или т.п. Фиксация реагентов на твердой фазе в тест-наборе или в устройстве для in vitro-диагностики может быть осуществлена путем прямой или непрямой фиксации. Прямая фиксация может быть, например, осуществлена путем ковалентного или нековалентного связывания или ассоциации с поверхностями. Непрямая фиксация может быть осуществлена путем связывания реагентов (например, антител, зондов и т.п.) с агентами, которые сами являются непосредственно фиксированными на твердых фазах. Такими агентами могут быть антитела или другие связывающие агенты, такие как стрептавидин, биотин или т.п. Детекция одного или нескольких молекулярных маркеров может быть осуществлена в одной реакционной смеси либо в двух или в нескольких отдельных реакционных смесях. Реакции детекции нескольких маркерных молекул могут быть, например, осуществлены одновременно в мультилуночных реакционных сосудах либо в данном случае она может быть осуществлена на одной, двух или более отдельных тест-пластинах. Маркеры, являющиеся признаками клеточных пролиферативных расстройств, могут быть детектированы с использованием реагентов, которые специфически распознают эти молекулы. Одновременно с этим маркеры нормализации могут быть детектированы с использованием реагентов, специфически распознающих эти маркеры. Реакция детекции маркеров каждого класса может включать одну или несколько дополнительных реакций с детектирующими агентами, которые либо распознают исходные маркерные молекулы либо предпочтительно распознают молекулы-предшественники (например, "первые" антитела), используемые для распознавания исходных маркеров. Реакция детекции, кроме того, может включать "репортерную" реакцию, указывающую на уровень маркеров, являющихся признаком клеточно-пролиферативных расстройств или маркеров нормализации.

Термины "маркер" или "маркерная молекула", используемые в контексте настоящего изобретения во всех грамматических формах, означают нуклеиновую кислоту, а также полипептидные молекулы. Так, например, термины "маркер" или "маркерная молекула" означают, например, РНК (мРНК, чРНК и т.п.), ДНК (кДНК, геномную ДНК и т.п.), белки, полипептиды, протеогликаны, гликопротеины и соответствующие фрагменты этих молекул. Термин "релевантный маркер" означает маркерные молекулы, являющиеся признаками медицински релевантного состояния. Термин "маркер нормализации" означает маркерные молекулы, используемые в целях нормализации.

Используемый здесь термин "уровень маркерной молекулы" означает полуколичественную, а также количественную величину, относящуюся к количеству соответствующего маркера, присутствующего в образце. Количественная величина может быть, например, определена как концентрация. Полуколичественная величина может быть выраж