Антиэстрогенное и антипролиферативное средство для лечения и профилактики заболеваний женской репродуктивной системы

Антиэстрогенное и антипролиферативное средство для лечения и профилактики заболеваний женской репродуктивной системы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится области медицины и химико-фармацевтической промышленности.

В настоящее время в медицинской практике широкое распространение получили фитохимические средства на основе индольных соединений, выделенных из семейства крестоцветных (Cruciferous), к которому относятся все виды кочанной капусты, брюссельская, цветная капуста и брокколи, а также их синтетическим аналогам. Интерес к соединениям данной группы вызван, в частности, их антиканцерогенными и антиэстрогенными свойствами, в связи с чем они могут быть использованы при заболеваниях молочной железы, таких как мастопатии, рак.

Мастопатия (фиброзно-кистозная болезнь) является дисгормональным доброкачественным заболеванием, характеризующимся нарушением соотношения эпителиального и соединительно-тканного компонентов молочных желез. На сегодняшний день это одна из самых распространенных патологий у женщин. Согласно статистике, различные формы мастопатии (а всего их известно около 60) встречаются у каждой второй женщины старше 35 лет. При первичном осмотре врача мастопатия выявляется у 30-40% женщин, а при более подробном обследовании с применением УЗИ, маммографии, рентгенорадиографии и гистологических исследований - почти у 80%.

Общепризнано, что мастопатия - заболевание полиэтиологическое или мультифакторное. Существует масса внутренних и внешних причин, воздействие которых приводит к гормональному дисбалансу в женском организме и, в конечном счете, вызывает появление уплотнений и узлов в молочных железах. Среди них: генетическая предрасположенность, неблагоприятные факторы репродуктивного характера (поздние первые роды, раннее и позднее менархе, отсутствие беременностей и полноценной лактации, сопутствующие гинекологические заболевания (известно, что 75% гинекологических воспалительных заболеваний сопровождается изменениями в молочной железе), нарушения в эндокринной системе, неврологические расстройства.

Молочные железы, в силу физиологических особенностей, находятся в состоянии постоянной смены процессов пролиферации и инволюции, связанной с фазами менструального цикла и соответствующим им разным уровнем половых гормонов - эстрогенов и прогестерона, вырабатываемых яичниками и корой надпочечников, а также гонадотропных гормонов передней доли гипофиза - фолликулостимулирующего гормона, лютеинизирующего гормона и пролактина. В период беременности большое влияние оказывают гормоны, вырабатываемые плацентой. Поэтому нарушение нормального функционирования гипоталамо-гипофизарной системы на любом ее уровне может явиться причиной нарушения гормонального равновесия. Под влиянием гормональных сдвигов нарушаются физиологические преобразования в тканях молочных желез и развиваются очаги патологической пролиферации эпителия. Хронические нарушения физиологии молочных желез могут привести к развитию мастопатии, а в ряде случаев и к раку молочной железы (РМЖ).

В структуре онкологической заболеваемости у женщин РМЖ занимает первое место, и в среднем заболеваемость РМЖ увеличивается на 1% в год. В структуре смертности он стоит на втором месте, при этом "темп прироста" по показателям смертности остается самым высоким (28%). По данным экспертов ВОЗ, в настоящее время каждый год во всем мире регистрируется около миллиона новых случаев РМЖ, одна треть из которых заканчивается смертельным исходом. По оценкам ряда исследователей, в следующем десятилетии 5 млн. женщин во всем мире будет страдать от данной злокачественной опухоли.

Следует подчеркнуть, что мастопатия не является облигатно предраковым заболеванием, однако некоторые ее формы могут способствовать развитию РМЖ. Установлено, что на фоне доброкачественных новообразований РМЖ встречается в 3-5 раз чаще, а при некоторых формах узловой мастопатии с признаками пролиферации и атипии - в 30-40 раз чаще, чем у здоровых женщин.

Все вышеизложенное заставляет относиться к мастопатии крайне настороженно и стимулирует исследователей к разработке новых, более совершенных методов диагностики, позволяющих выявлять хронические и вновь возникшие патологии молочных желез на как можно более ранних стадиях развития, а также своевременно проводить соответствующие лечебные мероприятия.

Существует много классификаций различных форм мастопатии, однако с практической точки зрения (в частности, при анализе данных, полученных с помощью рентгенорадиографии (маммографии) и морфологических исследований) наиболее приемлемой является следующая классификация:

I. Диффузная фиброзно-кистозная мастопатия:

- с преобладанием железистого компонента (аденоз);

- с преобладанием фиброзного компонента (фиброз);

- с преобладанием кистозного компонента (множественные кисты);

- смешанная форма (железисто-кистозная);

- склерозирующий аденоз.

II. Узловая фиброзно-кистозная мастопатия:

- фиброаденома;

- киста.

Степень выраженности указанных процессов по маммограммам определяется условно соотношением соединительно-тканно-железистого комплекса и жирового фона и классифицируется как:

- нерезко выраженная мастопатия - состояние, при котором жировая ткань преобладает над паренхимой железы;

- мастопатия средней степени выраженности - состояние, когда жировая ткань и плотные структуры, формирующие молочную железу, представлены приблизительно в равных соотношениях;

- выраженная степень мастопатии - состояние, когда молочная железа представлена в основном соединительно-тканными и железистыми структурами, жировой ткани мало.

Согласно рекомендациям Проблемной комиссии по морфологии опухолей АМН СССР разработана классификация дисгормональных дисплазий, в основу которой положена гистологическая классификация опухолей молочных желез ВОЗ (2000 г.). В соответствии с данной классификацией различают следующие формы мастопатии (или фиброаденоматоза):

а) непролиферативная (дольковая, протоковая, кистозная, фиброзная);

б) пролиферативная эпителиальная (солидная, сосочковая, фиброзная);

в) фиброэпителиальная (цистаденопапиллома);

г) миоэпителиальная (склерозирующий аденоз) (фиброаденомы внесены в рубрику доброкачественных опухолей).

Несмотря на исключительно важное медицинское и социальное значение доброкачественных заболеваний молочных желез, до настоящего времени не разработана патогенетически обоснованная тактика их консервативного лечения. По существу оно сводится к приему витаминов, препаратов йода и лекарственных средств на основе растительных экстрактов. Эти паллиативные меры в ряде случаев позволяют снять отдельные симптомы заболевания. Однако в силу неясности механизмов действия используемых препаратов отдаленные результаты подобного лечения прогнозировать трудно.

В то же время, с учетом того, что некоторые формы мастопатии являются предвестниками процессов малигнизации тканей молочных желез, их лечение должно проводиться с применением препаратов, блокирующих основные патогенетические звенья данного заболевания.

Известно, что клетки молочной железы подвергаются непрерывному воздействию множества различных факторов, стимулирующих их к активному делению (пролиферации) и индуцирующих запуск специфических сигнальных каскадов. Среди них можно выделить три основных внутриклеточных механизма, приводящих к активации клеточной пролиферации: 1) гормональный (или эстроген-зависимый); 2) индуцируемый ростовыми факторами и 3) активируемый провоспалительными цитокинами.

Участие эстрогенов в развитии неопластических процессов в гормон-зависимых тканях (эпителий молочных желез, эндометрий и шейка матки) в настоящее время считается общепризнанным и рассматривается как один из ведущих этиологических факторов их возникновения.

Как известно, в тканях женской репродуктивной системы ежемесячно происходят колебания митотической клеточной активности, регулируемые ритмическими изменениями уровня половых гормонов. В первой (т.н. пролиферативной) фазе менструального цикла секретируемый яичниками эстроген индуцирует пролиферацию клеток эндометрия, гибнущих во время менструации. Аналогично, каждый менструальный цикл эстроген стимулирует пролиферацию внутреннего слоя эпителиальных клеток протоков молочных желез, которые впоследствии также подвергаются апоптозу. Всего в течение приблизительно 40-летнего репродуктивного периода в организме женщины осуществляется несколько сотен подобных циклов.

Попадая в клетку, эстроген (Е) активирует эстрогеновый рецептор (ER), находящийся в цитоплазме в неактивном состоянии. Взаимодействие гормона с рецептором активирует последний и способствует его проникновению в ядро. Попав в ядро, гормон-рецепторный комплекс стимулирует экспрессию т.н. эстроген-зависимых генов, среди которых большая часть прямо или опосредованно контролирует клеточную пролиферацию, а также повышает чувствительность клеток к факторам, активирующим гиперпластические процессы (Фиг.1). Это гены, кодирующие рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), фактор роста кератиноцитов (KGF), регуляторы клеточного цикла - белки-циклины и циклин-зависимые киназы (CDK), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), инсулиноподобный фактор роста (IGF) и множество других белков.

Регулярно повторяющиеся циклы эстроген-индуцированного клеточного деления могут двояко влиять на развитие опухолевого процесса в гормон-зависимых тканях. Во-первых, пролиферировать под действием эстрогенов могут уже малигнизированные (подвергнувшиеся действию внешнего канцерогена или имеющие набор герминальных мутаций) клетки, пролиферация которых приводит к формированию "опухолевого клона". Однако чаще всего имеет место другая ситуация. Периодически повторяющиеся циклы клеточного деления неизбежно повышают частоту появления новых, спонтанных мутаций (особенно с увеличением возраста женщины, а также при наличии других факторов риска). При условии накопления от 3 до 7 подобных генетических ошибок, не ликвидированных иммунной и/или репаративными клеточными системами, эстроген-зависимая пролиферация трансформированных клеток также приведет к образованию опухоли. При этом инициатор опухолевого процесса, в его традиционном понимании, во втором случае отсутствует.

В случае, если в организме женщины имеется повышенное содержание одного из производных эстрогенов, а именно 16α-гидроксиэстрона, патологические пролиферативные процессы в гормон-зависимых тканях многократно усиливаются (Clemons М, Goss P. Estrogen and risk of breast cancer, N. Engl. J. Med., 2001, 344 (4), 276-285). Именно поэтому повышенное содержание 16α-гидроксиэстрона рассматривается в настоящее время как фактор риска развития рака молочной железы.

Однако патологическая клеточная пролиферация может протекать и по эстроген-независимому механизму. В этом случае включаются сигнальные каскады, стимулируемые полипептидными ростовыми факторами и цитокинами.

Основным полипептидным фактором, стимулирующим рост клеток молочной железы, является эпидермальный фактор роста (EGF). Фактор EGF через последовательность сигнальных белков активирует ядерный фактор транскрипции NF-κB - стимулятор экспрессии большого числа генов, ответственных за клеточную выживаемость и пролиферацию. Среди них - гены, кодирующие рецептор EGF (EGFR), фактор роста кератиноцитов (KGF), регуляторы клеточного цикла - циклин-зависимые киназы, фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), инсулиноподобный фактор роста (IGF) и многие другие белки.

Цитокиновый путь регуляции клеточного роста связан с фактором некроза опухоли TNF-α. В больших концентрациях этот цитокин активирует про-апоптотические рецептор-опосредованные сигнальные каскады, т.е. останавливает процессы клеточного деления и вызывает физиологическую гибель клеток. Однако в малых дозах он же действует как фактор выживания и пролиферации клеток. При этом повышается активность циклооксигеназы-2 (СОХ-2) - основного фермента, участвующего в биосинтезе простагландинов и стимулирующего экспрессию фактора NF-κB, который, как мы уже говорили, включает экспрессию генов, стимулирующих клеточное деление.

Таким образом, в настоящее время достаточно хорошо изучены патогенетические механизмы развития гиперпластических процессов в молочной железе. Очевидно, что, блокируя основные каналы проведения сигналов, стимулирующих пролиферацию клеток молочной железы, мы можем рассчитывать на успех в профилактике и лечении возникающих на этой основе патологических состояний. Другими словами, фармакологическая коррекция гиперпролиферативных заболеваний молочной железы должна осуществляться на всех этапах и по отношению ко всем сигнальным каскадам, опосредующим ключевые патофизиологические функции.

Многолетние поиски природных соединений, блокирующих развитие гиперпластических процессов в гормон-зависимых тканях, наконец, увенчались успехом. Одно из таких соединений - содержащийся в овощах семейства крестоцветных (различных видах капусты) фитонутриент индол-3-карбинол (I3C), на основе которого разработано новое средство в таблетированной форме.

Противоопухолевая защита, оказываемая I3C, обусловлена широким спектром его биологических активностей. Один из механизмов противоопухолевого действия I3C заключается во взаимодействии данного вещества с арилкарбоновыми рецепторами (AhR), блокирующем связывание AhR с канцерогенами. Таким образом, I3C - это природный лиганд AhR. При активации AhR в результате его взаимодействия с I3C образованный лиганд-рецепторный комплекс проникает в ядро и способствует усилению экспрессии CYP1A1 - изоформы цитохрома Р450, гидроксилирующей эстрон (метаболит эстрогена) во 2-м положении с образованием 2-гидроксиэстрона (2-ОНЕ1). Установлено, что данный метаболит обладает выраженной антипролиферативной (антиэстрогенной) активностью (Hong CB, Kim НА, Firestone GL, Bjeldanes LF, 3,3'-Diindolyl-methane (DIM) induces a G(1) cell cycle arrest in human breast cancer cells that is accompanied by Sp1-mediated activation of p21(WAF1/CIP1) expression, Carcinogenesis (Lond) 2002; 23: 1297-1305). Изофермент CYP1A1 является индуцибельной формой и активируется в ответ на пищевые ингредиенты и сигаретный дым. В отсутствие I3C рецептор AhR активируется канцерогенными ариловыми углеводородами, поступающими в организм из окружающей среды или с продуктами питания (особенно с консервированной пищей), что способствует экспрессии CYPB1 - изоформы цитохрома Р-450, гидроксилирующей эстрон по 16α- и 4-положениям с образованием, соответственно, 16α-гидроксиэстрона (16α-ОНЕ1) и 4-гидроксиэстрона (4-ОНЕ1) (Smigel К. Breast Cancer Prevention Trial shows major benefit, some risk. J. Natl. Cancer Inst. (Bethesda), 1998, 90: 647-648). Показано, что основной образующийся при этом метаболит 16α-ОНЕ1 способен ковалентно связываться с эстрогеновыми рецепторами, ядерными белками-гистонами и с ДНК, в результате чего происходит пролонгирование эстрогенной активности (эстроген-зависимого пролиферативного сигнала), а также инициация генотоксических повреждений ДНК. Таким образом, данные гидроксипроизводные эстрона являются сильнейшими канцерогенами для клеток-мишеней.

Таким образом, эстрадиол может превращаться в две метаболические формы - гидроксипроизводные эстрона - 2-ОНЕ1 и 16α-ОНЕ1, образующиеся посредством катализа разными изоферментами цитохрома Р-450 и обладающие абсолютно противоположными биологическими свойствами. 2-ОНЕ1 не влияет на пролиферацию клеток, в то время как 16α-ОНЕ1, наоборот, стимулирует клеточный рост и является агонистом эстрогена. Изучение функций этих двух метаболитов позволило выявить однозначную связь между уровнем 16α-ОНЕ1 и риском развития опухолей в эстроген-зависимых тканях. В то же время при повышении уровня 2-ОНЕ1 наблюдалась тенденция к гибели опухолевых клеток и профилактике их дальнейшего образования.

Многочисленные клинические исследования показали, что для поддержания нормального гормонального баланса как у пре-, так и у постменопаузальных женщин необходимо, чтобы концентрация 2-ОНЕ1 превышала концентрацию 16α-ОНЕ1 как минимум в два раза. При понижении данного соотношения статистически значимо возрастает риск возникновения РМЖ (Leong H, Firestone GL, Bjeldanes LF, Cytostatic effects of 3,3'-diindolylmethane in human endometrial cancer cells result from an estrogen receptor-mediated increase in transforming growth factor-alpha expression, Carcinogenesis (Lond) 2001: 22: 1809-1817; Patent WO 9203973, Onset ofantiestrogen resistence in breast cancer, 1992).

В рандомизированных клинических исследованиях, проведенных в конце 90-х гг., было установлено, что у постменопаузальных женщин с диагнозом РМЖ отмечалось пониженное соотношение 2-ОНЕ1/16α-ОНЕ1 по сравнению с соответствующим контролем. Более того, было показано, что пациенты с III и IV стадиями РМЖ имели более низкие соотношения 2-ОНЕ1/16α-ОНЕ1, чем пациенты с I и II стадиями заболевания (Huang CS, Chem HD, Chang KJ, et al. Breast cancer risk associated with genotype polymorphism of the estrogen-metabolizing genes CYP17, CYP1A1, and COMT: a multigenic study on cancer susceptibility. Cancer Res, 1999, Vol.59, N.19, p.4870-4875).

В настоящее время клиницистам стал доступен простой, неинвазивный, достоверный и относительно недорогой иммуноферментный метод определения метаболитов эстрогена - 2-ОНЕ1 и 16α-ОНЕ1 - в моче (Kabat GC, Chang CJ, Sparano JA et al. Urinary estrogen metabolites and breast cancer: a case-control study. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev., 1997, 6, 505-509), что в будущем открывает неограниченные перспективы по расширению масштабов профилактики и лечения доклинических форм гормон-зависимых опухолей (особенно среди пациентов, входящих в группы риска по данным заболеваниям).

Поскольку индол-3-карбинол непосредственно влияет на уровень 2-гидроксиэстрона и 16α-гидроксиэстрона, измерение соотношения данных метаболитов может служить надежным маркером эффективности его действия. Стабильное превышение 2-гидроксиэстрона более чем в 2 раза на протяжении 1-3 месяцев на фоне приема I3С - показатель адекватной коррекции гормонального фона и терапевтической эффективности данного соединения.

Препараты на основе индол-3-карбинола в виде биологически активных добавок широко используются в США для коррекции дисгормональных нарушений. Первое клиническое исследование на эту тему ставило своей целью проверку гипотезы о возможности использования I3C для стимуляции образования производного эстрогена - 2-гидроксиэстрона (2-ОНЕ1) (Bradlow et al. Long-responses of women to indol-3-carbinol. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev., 1994, 7, 591-595).

В данном клиническом исследовании принимали участие 2 группы женщин по 20 пациенток в каждой. Первая (опытная) группа получала в течение 3-х месяцев I3C в дозе 400 мг в день. Вторая (контрольная) группа получала плацебо. Ежемесячно у женщин исследовали стандартные биохимические параметры крови и соотношение метаболитов эстрогена 2-ОНЕ1/16α-ОНЕ1. В контрольной группе не было зарегистрировано никаких изменений в биохимических показателях. В опытной группе стандартные биохимические параметры также оставались без изменений, при этом у 17 женщин было зафиксировано значительное изменение соотношения метаболитов эстрадиола в пользу 2-ОНЕ1, причем это соотношение оставалось неизменным на протяжении 3-х месяцев после отмены I3C. Три женщины в опытной группе не отвечали на прием препарата. Авторы пришли к заключению о том, что I3C является эффективным средством для коррекции метаболизма эстрогенов.

В 1997 г. 60 женщин-волонтеров, проживающих в США, приняли участие в рандомизированных клинических исследованиях. Все участники были разделены на три группы: 1) контрольная группа, получавшая плацебо; 2) группа, получавшая низкие дозы I3C (50, 100 и 200 мг в день), и 3) группа, получавшая высокие дозы I3C (300 и 400 мг в день) в течение 4 недель. У всех женщин определяли соотношение 2-ОНЕ1/16α-ОНЕ1 как биомаркер эффективности проводимой терапии. Результаты проведенных исследований позволили авторам сделать два важных вывода:

1. Ни в одном случае не отмечалось никаких побочных эффектов.

2. Минимальная суточная доза I3C, при которой наблюдалось изменение соотношения метаболитов эстрогена, составила 300 мг, на основании чего авторы рекомендуют для профилактики рака груди дозы I3C - 300-400 мг/сутки.

Годом позже Фондом профилактической онкологии были проведены клинические исследования, посвященные этому же вопросу. Женщины-волонтеры в возрасте от 35 до 47 лет в течение 2-х месяцев принимали I3C в дозе 400 мг в день. Измерение уровня 2-гидроксиэстрона (2-ОНЕ1) показало значительное увеличение данного метаболита в результате приема I3C, что свидетельствует о высокой терапевтической эффективности данного препарата в отношении коррекции гормонального фона.

В ходе многочисленных экспериментальных исследований была доказана универсальность противоопухолевой активности I3C, обусловленная способностью данного соединения блокировать все основные пути трансдукции внутриклеточных сигналов, стимулирующих клеточный рост, в том числе эстроген-независимые пролиферативные пути, активируемые ростовыми факторами и цитокинами.

Ростовые факторы, к каковым относятся эпидермальный фактор роста (EGF), фибробластический фактор роста (FGF), фактор роста кератиноцитов (KGF или FGF-7), инсулиноподобный фактор роста (IGF-I) и др., в отсутствие какого-либо препятствия активируют специфические рецепторы, обладающие тирозинкиназной активностью. Лиганд-индуцируемая димеризация рецепторов активирует каскад цитоплазматических сигнальных киназ (МАРК, Akt), протоонкогенов (fos, ras), активаторов транскрипции (NF-κB), что приводит к экспрессии лиганд-индуцируемых генов, среди которых - упоминавшиеся выше ростовые факторы и их рецепторы; киназы; факторы, стимулирующие образование новых сосудов; белки теплового шока; а также другие необходимые для опухолевого метаболизма белки.

Индол-3-карбинол, проникая в клетку, препятствует фосфорилированию тирозиновых остатков киназ, что мешает каскадной передаче пролиферативных сигналов с поверхности к ядру клетки (Chinni SR, Sarkar FH. Akt Inactivation Is a Key Event in Indole-3-carbinol-induced Apoptosis in PC-3 Cells. Clin. Cancer Research, 2002, 8, 1228-1236). Кроме того, он ингибирует ядерный фактор транскрипции NF-κB, который является основным активатором транскрипции большого числа генов, вовлеченных в пролиферацию и воспаление (Brignall MS. Prevention and treatment of cancer with indole-3-carbinol, Altem. Med. Rev., 2001, 6(6), 580-589).

Еще один механизм блокады опухолевого роста, осуществляемый посредством I3C, связан с ингибированием активности циклооксигеназы-2 (СОХ-2) - фермента, вовлеченного в синтез простагландинов (PGE2). СОХ-2 активируется в ответ на действие провоспалительных цитокинов - фактора некроза опухоли-альфа (TNF-α) и его «партнера» - интерлейкина-1 (IL-1). Взаимодействие цитокинов со своими рецепторами приводит, в частности, к активации СОХ-2 и синтезу PGE2 с последующей транскрипцией фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) - основного компонента опухолевого неоангиогенеза.

Есть данные, что ОС-опосредованное подавление пролиферативной активности опухолевых клеток сопровождается ингибированием активности белков-регуляторов клеточного цикла - циклинов D1 и Е и циклин-зависимых киназ (CDK2, CDK4 и CDK6), а также стимуляцией образования супрессоров опухолевого роста - белков р15, р21 и р27. При этом происходит остановка клеточного цикла в фазе G1 (Aggarwal BB, Ichikawa H. Molecular targets and anticancer potential of indole-3-carbinol and its derivatives. Cell Cycle, 2005, 4(9), 1201-1215; Cover CM, Hsieh SJ, Tran SH et al. Indole-3-carbinol Inhibits the Expression of Cyclin-dependent Kinase-6 and Induces a G1 Cell Cycle Arrest of Human Breast Cancer Cells Independent of Estrogen Receptor Signaling. Biol. Chem., 1998, 273(7), 3838-3847; Garcia HH, Brar GA, Nguyen DH, Bjeldanes LF, Fire-stone GL, Indole-3-carbinol (I3C) inhibits cyclin-dependent kinase-2 function in human breast cancer cells by regulating the size distribution, associated cyclin E forms, and subcellular localization of the CDK2 protein complex. J. Biol. Chem., 2005, 280(10), 8756-8764; Kim YS, Milner JA. Targets for indole-3-carbinol in cancer prevention. J. Nutr. Biochem., 2005, 16 (2), 65-73; Matsuzaki Y, Koyama M, Hitomi T, Kawanaka M, Sakai T, Indole-3-carbinol activates the cyclin-dependent kinase inhibitor p15(INK4b) gene. FEBS Lett., 2004, 576(1-2), 137-140).

Еще одной уникальной особенностью I3C является его способность избирательно индуцировать в опухолевых клетках процессы программируемой клеточной гибели - апоптоза (Powles Т.J. Efficacy of tamoxifen as treatment of breast cancer. Semin. Oncol., 24 (Suppl.1): S1-48-S1-54, 1997). Известно, что транслокация проапоптотического белка Вах из цитоплазмы в митохондрии является критическим событием при развитии митохондриального пути апоптоза. I3C стимулирует этот процесс, что сопровождается снижением митохондриального потенциала, выходом цитохрома с из митохондрии, активацией проапоптотических каспаз (-3 и -9) и, собственно, наступлением апоптоза. При этом одновременно с проявлением апоптотической активности I3C наблюдается ингибирование активности антиапоптотических белков - Bcl-2, Bcl-xL, сурвивина, LAP (inhibitor-of-apoptosis protein), XIAP (X chromosome-linked IAP) и FLIP (Fas-associated death domain protein-like interleukin-1-beta-converting enzyme inhibitory protein).

Кроме того, есть данные, указывающие на антиоксидантные свойства I3C, а также на его способность подавлять ангиогенные, инвазивные и миграционные процессы при канцерогенезе в молочных железах (McCarty MF, Block KI. Multifocal Angiostatic Therapy: An Update, Integrat. Cancer Ther., 2005, 4, 301-314; Meng Q, Goldberg ID, Rosen EM, Fan S. Inhibitory effects of Indole-3-carbinol on invasion and migration in human breast cancer cells, Breast Cancer Res Treat, 2000, 63(2), 147-152; Wu HT, Lin SH, Chen YH. Inhibition of cell proliferation and in vitro markers of angiogenesis by indole-3-carbinol, a major indole metabolite present in cruciferous vegetables. J. Agric. Food Chem., 2005, 53(13), 5164-5169).

Таким образом, I3C является универсальным корректором патологических пролиферативных процессов в органах женской репродуктивной системы. Универсальность противоопухолевого действия I3C обусловлена способностью данного соединения блокировать все основные (гормон-зависимые и гормон-независимые) пути трансдукции внутриклеточных сигналов, стимулирующих клеточный рост, а также индуцировать избирательный апоптоз (программированную клеточную гибель) опухолевых клеток. I3C является поистине уникальным соединением, поскольку способен подавлять развитие опухолевого процесса практически на всех его уровнях: субмолекулярном (активация опухоль-супрессорных генов и супрессия генов, стимулирующих онкогенез), молекулярном (блокировка пролиферативных сигналов на всем их протяжении - от рецепторов до ядерных белков и ДНК) и надмолекулярном (торможение процессов клеточной миграции и инвазии).

Сочетание антиэстрогенной и антипролиферативной активностей I3C делает его незаменимым при лечении и профилактике гиперпластических процессов в органах репродуктивной системы. Показано, что органами-мишенями I3C могут быть молочная железа, миометрий, эндометрий и другие гормон-зависимые ткани. Высокая клиническая эффективность I3C как фармакологического корректора гиперпластических процессов в гормон-зависимых тканях подтверждена в клинических исследованиях, проводившихся на моделях диффузных мастопатий, миомы матки и дисплазий шейки матки. Это свойство I3C имеет большое значение в клинической практике, т.к. мастопатии часто сочетаются с патологиями других гормон-зависимых органов и тканей и развиваются на фоне дисгормональных нарушений.

Перечисленные фармакологические свойства индол-3-карбинола позволяют считать данное вещество весьма перспективным кандидатом для создания на его основе лекарственных средств. Однако I3C является очень нестабильным соединением и при попадании в кислую среду желудка очень быстро превращается в несколько олигомерных производных, основным из которых является его димерная форма - 3,3'-дииндолилметан (DIM) (Фиг.2) (Arneson DW, Hurwitz A, McMahon LM et al. Presence of 3,3'-diindolylmethane in human plasma after oral administration of indole-3-carbinol [abstract 2833], Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 1999; 40, 429; Grose KR, et al. Oligomerization of indole-3-carbinol in aqueous acid. Chem Res Toxicol, 1992, 5, 188-193). Именно поэтому, несмотря на многочисленные эффекты I3C in vivo, до настоящего времени нет полной ясности в отношении их истинного источника, т.е. по-прежнему открытым остается вопрос, связаны ли биологические свойства I3C непосредственно с его собственным действием на клеточные мишени или это результат активности продуктов конденсации и окисления индол-3-карбинола, в частности дииндолилметана.

В то же время известно, что клинический эффект, оказываемый I3C при тех или иных патологиях, существенно зависит от индивидуальных особенностей метаболизма принимающих данный препарат пациентов, в частности от способности конвертировать I3C в различные его производные, между которыми, в свою очередь, возможны синергетические и/или антагонистические взаимодействия (Dalessandri KM, Firestone GL et al. Pilot Study: Effect of 3-Diindolylmethane Supplements on Urinary hormone metabolites in Postmenopausal women with a history of early-stage breast cancer. Nutrition and cancer, 2004, 50(2), 161-167). Одновременно с этим есть экспериментальные данные, указывающие на самостоятельную биологическую активность I3C, независимую от биологической активности образующихся в результате его олигомеризации метаболитов (Anderton MJ, Manson MM, Verschoyle RD, Gescher A, Lamb JH, Farmer PB, Steward WP, Williams MIL. Pharmacokinetics and Tissue Disposition of Indole-3-carbinol and Its Acid Condensation Products after Oral Administration to Mice. Clin. Cancer Research, 2004, 10, 5233-5241; Hsu JC, Zhang J, Dev A, Wing A, Bjeldanes LF, Firestone GL. Indole-3-carbinol inhibition of androgen receptor expression and downregulation of androgen responsiveness in human prostate cancer cells. Carcinogenesis, 2005, 26(11), 1896-1904).

Одним из принципиальных критериев, которому должно отвечать любое химические соединение, претендующее на основу для создания лекарственного средства, является стабильность при хранении. Индол-3-карбинол является чрезвычайно лабильным соединением, быстро разлагаясь на свету и в присутствии кислорода. Он также плохо растворим и соответственно обладает низкой биодоступностью, что может ограничивать его применение в качестве лекарственного средства.

Исследователями предпринимались попытки создания форм с повышенной абсорбцией дииндолилметана.

Из уровня техники известен ряд решений, касающихся лекарственных форм I3C (индол-3-карбинола).

В частности, известен патент США 6689387, опубл. 10.02.2004, описывающий микрочастицы I3C или 3,3'-дииндолилметана в крахмальной матрице, в том числе, в виде твердых лекарственных форм для орального введения. Данные формы содержат 30-70% крахмала. Что, повышая растворимость активного вещества, не обеспечивает достаточной стабильности в процессе хранения.

Известен патент US 639964, опубл. 2002 г., описывающий средство для лечения неопластических заболеваний на основе индол-3-карбинола и/или дииндолилметана. Данное средство может быть выполнено в виде капсулы или таблетки, содержащей в качестве вспомогательных веществ лактозу, крахмал, производные целлюлозы и подобное. Данный состав не стабилен.

Известен также патент США 2004156910, который может быть указан в качестве прототипа, описывающий различные лекарственные формы средства для лечения мастопатии и эндометриоза на основе производных индола с повышенной степенью абсорбции, в том числе в виде таблеток, например, содержащих связующее, ПАВ и воду. Таблетки могут быть покрыты оболочкой. Активное вещество присутствует в микрокристаллической форме. Разработанные лекарственные формы согласно данному источнику не обеспечивают улучшенную водорастворимость действующего вещества, представляют собой дисперсионные системы, в большей степени имеющие гетерогенную структуру.

Хотя в известных патентах упоминается возможность получения таблеток с различными известными в области фармации добавками, в них не ставится и не предполагается задача создания такой формы, чтобы она позволяла разобщить терапевтические эффекты I3C и его метаболита при достижении концентрации 2-ОНЕ1, превышающей концентрацию 16α-ОНЕ1 как минимум в два раза, что обеспечивает максимальный профилактический и терапевтический эффект.

Задачей изобретения является следующее:

1) максимально сузить спектр его молекулярных внутриклеточных мишеней и таким образом сделать действие данного препарата как можно более предсказуемым;

2) разобщить терапевтические эффекты I3C и DIM.

С учетом данной задачи было разработано антиэстрогенное и антипролиферативное средство для лечения и профилактики заболеваний женской репродуктивной системы, представляющее собой таблетку, покрытую кишечнорастворимой оболочкой, содержащее индол-3-карбинол, а также вспомогательные вещества, повышающие стабильность препарата при хранении и улучшающие его растворимость и биодоступность.

Предлагаемое средство содержит следующие компоненты в г:

Состав на одну таблетку:
Индол-3-карбинол	0,1-0,2
Лактоза	0,10-0,15
Бутилгидроксианизол	0,0001-0,0002
Целлюлоза микрокристаллическая	0,10-0,150
Крахмал кукурузный модифицированный	0,03-0,05
Магния стеарат или кальция стеарат	0,002-0,004
Кишечнорастворимое
покрытие АКРИЛИЗ	0,03-0,05

Было обнаружено, что предлагаемый состав наиболее эффективным образом позволяет избежать при пероральном приеме I3C его контакта с кислой средой желудочного сока, в результате которого происходит образование метаболически активных производных данного соединения.

В качестве оболочки предлагается покрытие Акрилиз (Akryl-eze), (НД 42-13039-04), включающее:

Сополимер метакриловой кислоты с
этилакрилатом 1:1	40%
Двуокись титана	15%
Тальк	37,25%
Триэтилацетат	4,8%
Кремния оксид коллоидный безводный	1,25%
Натрия гидрокарбонат	1,2%
Натрия лаурилсульфат	0,5%

Предпочтительно вес оболочки должен составлять около 10% от веса ядра таблетки.

Изобретение может быть проиллюстрировано следующими примерами.

Пример 1

Предлагаемое средство. Таблетки, содержащие 0,1 г индол-3-карбинола, покрытые кишечнорастворимой оболочкой

Состав на одну таблетку:
Индол-3-карбинол	- 0,1 г
Лактоза (для прямого прессования 80 МЕШ)	- 0,1058 г
(ГОСТ 4963-85, ГФ X)
(80 меш, 200 меш)
Бутилгидроксианизол	- 0,0002 г
(Евр. Фарм. 2004 г.)
Целлюлоза микрокристаллическая	- 0,150 г
(Вивапур 12, Евр. Фарм. 2004 г.)
Крахмал кукурузный модифицированный	- 0,040 г
(Starch 1500, НД 42-11973-01)
Магния стеарат	- 0,004 г
(ТУ 6-09-16-1533-90, «ч»)
Масса таблетки-ядра	- 0,400 г
Кишечнорастворимое
покрытие АКРИЛИЗ (ЦВЕТНОЙ)	- 0,040 г (10%)
(НД 42-13039-04)
Масса таблетки, покрытой оболочкой	- 0,440 г

Пример 2

Предлагаемое средство. Таблетки, содержащие 0,2 г индол-3-карбинола, покрытые кишечнорастворимой оболочкой

Индол-3-карбинол	- 0,2 г
Лактоза (для прямого прессования 80 МЕШ)	- 0,15 г
(ГОСТ 4963-85, ГФ X)
(80 меш, 200 меш)
Бутилгидроксианизол	- 0,0002 г
(Евр. Фарм. 2004 г.)
Целлюлоза микрокристаллическая	- 0,1 г
(Вивапур 12, Евр. Фарм. 2004 г.)
Крахмал кукурузный модифицированный	- 0,046 г
(Starch 1500, НД 42-11973-01)
Кальция стеарат	- 0,0038 г
Масса таблетки-ядра	- 0,500 г
Кишечнорастворимое
покрытие АКРИЛИЗ (ЦВЕТНОЙ)	- 0,050 г (10%)
(НД 42-13039-04)
Масса таблетки, покрытой оболочкой	- 0,550 г

Пример 3

Экспериментальное изучение специфической фармакологической активности предлагаемого средства в условиях in vitro и in vivo.

Материалы и методы

Культивирование клеток. В экспериментах in vitro и in vivo использовали клетки аденокарциномы молочной железы человека эстроген-чувствительной (ER+) линии MCF-7 и эстроген-нечувствительной (ER-) линии MDA-MB-468. Клеточные культуры, полученные из Американской Коллекции Типовых Клеточных Культур АТСС (Bethesda, MD, США), культивировали в пластиковых культуральных флаконах ("Costar", США) в ростовой среде DMEM/F-12 (1:1) с добавлением 10% бычьей эмбриональной сыворотки, 4,0 г/л глюкозы, 3,7 г/л натрия бикарбоната, 2 мМ L-глутамина, 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина ("GibcoBRL") при 37°С в увлажненной атмосфере, содержащей 5% CO₂.

Животные и их содержание. Эксперименты in vivo проводились на взрослых самках бестимусных (nu/nu) линейных мышей C57Black/6 (7 недель), полученных из Charis Rivers Co (США).

Длительность карантина (акклиматизационного периода) для всех животных составляла 14 дней. Клетки с животными были помещены в отдельные комнаты. Животные содержались при 12-часовом режиме освещения, температуре 20-25°С, относительной влажности 50-70% и свободном доступе к корму и воде.

Определение выживаемости опухолевых клеток молочной железы при воздействии предлагаемого средства.

Клетки аденокарциномы молочной железы человека линий MCF-7 и MDA-MB-468 рассевали по 96-луночным планшетам для микротитрования ("Costar", США) в концентрации 5×104 клеток на ячейку. Через 24 час после прикрепления клеток к поверхности и достижения монослоя культуральную ростовую среду заменяли на среду, содержащую предлагаемое средство (его рас