Специфические антитела для диагностики сердечной недостаточности

Специфические антитела для диагностики сердечной недостаточности

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области диагностики in vitro желудочковой сердечной недостаточности.

Уровень техники

Сердечная недостаточность (congestive heart failure) - это распространенный клинический синдром, особенно у пожилых людей. Обычно он проявляется в виде скрытого нарастания неспецифических симптомов, таких как кашель при физической нагрузке, усталость и появление периферических отеков. Диагностика по традиции основывается на исследовании различных параметров, таких как клинические признаки (разделенные на 4 стадии от I до IV по классификации NYHA, т.е. Кардиологической ассоциации Нью-Йорка), эхокардиография, сцинтиграфия, тест на физическую нагрузку и др.

По причине тяжести сердечного заболевания, а также высоких затрат на уход, конечно, ранняя диагностика весьма желательна: она способствует предупреждению быстрого прогрессирования этого синдрома в тяжелую форму сердечной недостаточности. Таким образом, необходима идентификация лиц с риском сердечной недостаточности. Это бы также позволило быстрее, легче и с меньшими затратами адаптировать последующую терапию. К сожалению, полностью удовлетворительного и полностью информативного метода диагностики сердечной недостаточности еще нет.

Длительное время проводились поиски пресимптоматических прогностических маркеров сердечной недостаточности. В этом отношении привлекает внимание то, что кардиомиоциты вырабатывают и секретируют пептиды, обладающие натриуретической активностью: пептид из предсердий сердца - ANP (atrial natriuretic peptide, т.е. натриуретический пептид предсердий), открытый у крыс de Bold et al.. Life Science 1981, vol. 28(1): 89-94, и натриуретический пептид предсердно-желудочкового происхождения, названный BNP (brain natriuretic peptide, т.е. натриуретический пептид мозга), открытый Sudoh et al.. Nature 1988, vol. 332: 78-81, у свиней, а затем у человека.

Предшественником BNP является препроBNP(1-134), запасная форма молекулы внутри кардиомиоцитов. Он подвергается расщеплению с отделением сигнального пептида и проBNP(1-108) (пропептид BNP(1-108). ПроBNP(1-108) представляет собой полипептид из 108 аминокислот, имеющий следующую последовательность:

H₁PLGSPGSASDLETSGLQEQRNHLQGKLSELQVEQTSLEPLQESPRPTGVWKSREVATE GIRGHRKMVLYTLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGSGCFGRKMDRISSSSGLGCKVLRRH₁₀₈ (SEQ ID No. 1).

Он подвергается расщеплению, до и/или во время секреции, между аминокислотами Arg⁷⁶ и Ser⁷⁷, образуя, с одной стороны, BNP, также называемый BNP(77-108) или BNP-32, либо BNP(1-32), и N-концевой фрагмент прогормона - BNP(1-76), также называемый N-концевым фрагментом проBNP или NT-проBNP.

BNP или BNP(77-108), вазоактивная форма молекулы, представляет собой пептид из 32 аминокислот, имеющий следующую последовательность:

S₇₇PKMVQGSGCFGRKMDRISSSSGLGCKVLRRH₁₀₈ (SEQ ID No. 2).

NT-проBNP или BNP(1-76) состоит из 76 N-концевых аминокислот проBNP(1-108), образующих следующую последовательность:

HiPLGSPGSASDLETSGLQEQRNHLQGKLSELQVEQTSLEPLQESPRPTGVWKSREVATE GIRGHRKMVLYTLRAPR₇₆ (SEQ ID No. 3).

Уровень гормональной формы BNP - BNP(77-108) в плазме крови повышается у больных с дистрофией желудочков. Кстати, определение уровня BNP(77-108) в плазме крови было описано в связи с его применением как прогностического маркера желудочковой сердечной недостаточности. В то же время хорошо известно, что гормон BNP(77-108) мало стабилен. Отсюда следует, что его определение требует особой осторожности: Davidson N.C. et al.. Circulation 1995, 91: 1276; Gobiner-Georges et al., Clin. Chem. Lab. Med. 2000, 38: 519-23). Более того, BNP имеет очень короткое время полужизни, и его концентрация в плазме повышается слабо. Отсюда следует, что наблюдается определенное количество ложно-отрицательных ответов у лиц с риском сердечной недостаточности. Таким образом, определение BNP(77-108) не позволяет правильно отличить больных на стадии I по классификации NYHA от здоровых лиц (Clerico A. et al., J. Endocrinol. Invest. 1998, 21: 170-9; Del Ry S. et al., Scand. J. Clin. Lab. Invest. 2000, 60: 81-90).

Чтобы обойти эти трудности, в патентной заявке WO 93/24531 описан метод диагностики in vitro сердечной недостаточности, основанный на обнаружении BNP(1-76), т.е. N-концевого фрагмента проBNP - распространенного соединения, имеющего продолжительное время полужизни по сравнению с гормоном BNP(77-108). Во всяком случае, метод, описанный в заявке WO 93/24531, не так уж легко применим к BNP(1-76) в образцах крови. В самом деле, единственные представленные примеры реализованы не на реальной сыворотке, а на серии стандартов, полученных с помощью синтетического пептида - пептида BNP(47-64), представляющего собой часть последовательности BNP(1-76). Для компенсации этого недостатка потребовалось задействовать автоматизированную и очень сложную систему.

В статье Hunt et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, vol. 214(3), 1885, pp.1175-1183, описано применение конкурентной разновидности метода РИА для определения BNP(1-76) в плазме больных сердечной недостаточностью с применением антисыворотки против N-концевого фрагмента BNP(1-13). В этой статье показано, что при сердечной недостаточности уровень BNP(1-76), который очень хорошо коррелирует с уровнем BNP(77-108), заметно повышается по отношению к его уровню у контрольных лиц. Вместе с тем, описанная методика специфической экстракции одного BNP(1-76) из плазмы является сложной, поскольку она требует экстрагирования плазмы с помощью картриджа Sep-pak С 18 (Millipore-Waters) с последующей хроматографией методом ВЭЖХ. Кроме того, в этой статье подчеркивается, что применяемый при определении метод РИА, по-видимому, не распознает проBNP(1-108). В ней также предполагается, что проBNP(1-108) может секретироваться в кровоток из сердечной ткани, однако он затем подвергается быстрой деградации до меньшего пептида путем отщепления N-концевых аминокислот. Кроме того, согласно этой статье, проBNP(1-108) может принимать такую форму, с которой антисыворотка к проBNP(1-108) не способна связываться. Наконец, авторы предполагают, что сам BNP(1-76) (N-концевой фрагмент проBNP) мог бы служить более специфичным маркером сердечной дисфункции, чем BNP(77-108) или N-концевой фрагмент проANP.

В статье Kari et al., Scand. J. Clin. Lab. Invest. 1999, 59 (suppi 230): 177-181 описан метод обнаружения BNP(1-76), подобный методу патентной заявки WO 93/24531, однако в ней не приведены результаты, полученные на образцах больных.

В статье Schuiz et al., Scand. J. Clin. Lab. Invest. 2001, vol. 61, pp.33-42 также описано радиоиммунологическое определение, специфичное к BNP(1-76) (N-концевому фрагменту проBNP), без экстракции, с помощью антисыворотки против аминокислот 1 -21 этого фрагмента. Авторы подтвердили полезность определения BNP(1-76) для диагностики желудочковой сердечной недостаточности, а также его хорошую корреляцию с определением BNP(77-108). При изучении различных циркулирующих форм проBNP(1-108) они выдвинули гипотезу, что проBNP(1-108) может циркулировать в крови одновременно в виде интактного прогормона и в виде продуктов расщепления - BNP(1-76) (N-концевого фрагмента проBNP) и BNP(77-108). В то же время в статье ничего не говорится и не предполагается касательно возможной физиологической активности проBNP(1-108) или какой-либо диагностической пользы проBNP(1-108) в качестве прогностического или диагностического маркера желудочковой сердечной недостаточности.

В статье Shimizu et al., Clinica Chimica Acta, 2002, vol. 316, pp.129-135 представлено исследование деградации BNP человека в крови и циркулирующих молекулярных форм иммунореактивного BNP в плазме больных сердечной недостаточностью. В их плазме наблюдается присутствие двух форм иммунореактивного BNP: BNP с высоким молекулярным весом (36 кДа), который может соответствовать тримеру проBNP(1-108), и BNP с низким молекулярным весом. Последний соответствует одновременному присутствию одного из продуктов деградации BNP-32, лишенного N-концевых серина и пролина (т.е. это ASerPro-BNP, иначе BNP(3-32), и гормональной формы BNP-32, называемой BNP(1-32). Таким образом, из сердца в кровь секретируются проBNP(1-108) и гормональный BNP (то есть BNP-32 или BNP(1-32), иначе BNP(77-108). Тем не менее, авторы как будто предполагают, что проBNP(1-108) в олигомеризованном виде (тример) присутствует в концентрации, близкой к концентрации циркулирующего BNP(77-108), но ее они не измеряли. Вследствие этого не была изучена корреляция между концентрацией проBNP(1-108) и клиническим состоянием больных. Таким образом, диагностическое или прогностическое значение проBNP(1-108) в сыворотке крови не было установлено. И тем более не предполагалось, что возможно рутинное определение проBNP(1-108).

Впрочем, известно некоторое число эпитопов на проBNP(1-108). Так, в рамках обнаружения BNP(77-108) в заявке WO 97/32900 описан эпитоп с последовательностью S₇₇PKMVQGSGC₈₆ (SEQ ID No. 105), соответствующей 10 N-концевым аминокислотам BNP(77-108). Аналогичным образом, в рамках обнаружения BNP(1-76) (N-концевого фрагмента проBNP) в заявке WO 00/35951 описан эпитоп с последовательностью R₆₅KMVLYTLRAPR₇₆ (SEQ ID No. 106), соответствующий 12 С-концевым аминокислотам BNP(1-76) (N-концевого фрагмента проBNP), а близкая последовательность H₆₄RKMVLYTLRAPR₇₆ (SEQ ID No. 107) описана в заявке WO 00/45176. Тем не менее, ни в одной из этих патентных заявок не описано и не предполагается существование промежуточного эпитопа или гибрида между этими последовательностями.

Таким образом, все еще существует потребность, в рамках ранней диагностики сердечной недостаточности, в таком методе, который был бы лишен недостатков предшествующего уровня техники. В частности, существует потребность в таком простом методе, имеющем рутинное применение и надежном, который был бы лишен неудобства обнаружения BNP(77-108) - малораспространенной и не очень стабильной молекулы, и при этом совсем избежать сложных экстракций, необходимых при определении других молекулярных форм BNP, при которых даже может потребоваться сложнейшая автоматизация.

Раскрытие изобретения

Авторы настоящего изобретения поэтому решили разработать альтернативный метод для решения поставленной проблемы. В основе настоящего изобретения лежит неожиданное, сделанное авторами изобретения, открытие одного эпитопа с уникальными свойствами, располагающегося в районе шарнирной последовательности Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGSG₈₅ (SEQ ID No. 4) или последовательности Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGS₈₄ (SEQ ID No. 108) из проBNP(1-108) и содержащего как минимум последовательность RAPR₇₆S₇₇P (SEQ ID No. 5).

В самом деле, при иммунизации кроликов одним пептидом из шарнирного участка проBNP(1-108) с последовательностью CY₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGSG₈₅ (SEQ ID No. 16) либо пептидом с последовательностью CY₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGS₈₄ (SEQ ID No. 109) они обнаружили, весьма неожиданно, что полученная антисыворотка не только содержала антитела, специфически распознающие данный пептид из шарнирного участка и практически не распознающие формы BNP(1-76) и BNP(77-108), но также обладающие способностью к распознаванию циркулирующего проBNP(1-108).

Авторы настоящего изобретения, кроме того, впервые показали, что циркулирующий проBNP(1-108) является эффективным прогностическим маркером сердечной недостаточности и что его концентрация существенно выше у больных с сердечной недостаточностью, чем у здоровых контролей.

Авторы также открыли, что другой способ получения таких антител заключается в иммунизации животных с помощью целой молекулы проBNP(1-108). Действительно, авторы обнаружили, что иммунизация целой молекулой проBNP(1-108) способна вызвать появление антител, специфически распознающих последовательность из шарнирного участка.

Более того, авторы настоящего изобретения показали, что минимальный эпитоп, распознаваемый антителами по изобретению, имеет следующую последовательность: RAPR₇₆S₇₇P. Кроме того, они показали, что хороший способ получения антител по настоящему изобретению заключается в иммунизации животных пептидами общей формулы

где a₁ означает Н или функциональную группу или химическую группировку, выбранную из тиоловой, спиртовой, аминоокси- функциональных групп, первичного или вторичного амина, аминокарбоксильной, биотинильной и ацетильной групп,

X₁ - пептидная последовательность из 0-3 аминокислот, происходящая или не происходящая из природной последовательности проBNP(1-108),

Х₂ - пептидная последовательность из 0-8 аминокислот, предпочтительно из 7 аминокислот, происходящая или не происходящая из природной последовательности проBNP(1-108),

а₂ - функциональная группа ОН, NH₂ или алкоксильная группа.

Кроме того, авторы настоящего изобретения показали, что можно получить такие же специфические антитела при иммунизации животных пептидом, содержащим последовательность RAPR₇₆S₇₇P или пептидом формулы

X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85-Z

(II)

где Х означает Н или ацетильную группу либо 1-3 аминокислоты, не принадлежащие к последовательности проBNP(1-108), a Z означает группу ОН или 1-3 аминокислоты, не принадлежащие к последовательности проBNP(1-108).

Кроме того, авторы настоящего изобретения показали, что можно получить такие же специфические антитела при иммунизации животных пептидом по формуле

X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84-Z

(III)

где Х означает Н или ацетильную группу либо 1-3 аминокислоты, не принадлежащие к последовательности проBNP(1-108), a Z означает группу ОН или 1-3 аминокислоты, не принадлежащие к последовательности проBNP(1-108).

Авторы настоящего изобретения также разработали простой и надежный метод ранней диагностики сердечной недостаточности, основывающийся на определении циркулирующего в крови проBNP(1-108), а также набор, позволяющий осуществлять такое определение циркулирующего проBNP(1-108).

Таким образом, предметом настоящего изобретения являются антитела к проBNP(1-108), отличающиеся тем, что, с одной стороны, они распознают специфическим образом последовательность Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGSG₈₅ из проBNP(1-108) и практически не распознают ни BNP(1-76), ни BNP(77-108), а с другой стороны - обладают способностью к специфическому распознаванию циркулирующего проBNP(1-108) в образцах сыворотки или плазмы человека.

Предметом настоящего изобретения также являются антитела к проBNP(1-108), отличающиеся тем, что, с одной стороны, они распознают специфическим образом последовательность Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGS₈₄ из проBNP(1-108) и практически не распознают ни BNP(1-76), ни BNP(77-108), а с другой стороны - обладают способностью к специфическому распознаванию циркулирующего проBNP(1-108) в образцах сыворотки или плазмы человека.

В частности, предметом настоящего изобретения являются антитела к проBNP(1-108), характеризующиеся тем, что, с одной стороны, они распознают специфическим образом последовательность RAPR₇₆S₇₇ из проBNP(1-108) и практически не распознают ни BNP(1-76), ни BNP(77-108), а с другой стороны - обладают способностью к специфическому распознаванию циркулирующего проBNP(1-108) в образцах сыворотки или плазмы человека.

Кроме того, предметом настоящего изобретения является способ получения антител к проBNP(1-108), распознающих специфическим образом последовательность Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGSG₈₅, последовательность Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGS₈₄ и/или последовательность RAPR₇₆S₇₇P из проBNP(1-108), практически исключая BNP(1-76) и BNP(77-108), и обладающих способностью к специфическому распознаванию циркулирующего проBNP(1-108) в образцах сыворотки или плазмы человека, который отличается тем, что животных иммунизируют целой молекулой проBNP(1-108), а также тем, что полученную антисыворотку истощают с помощью пептида BNP(77-108) и/или пептида ВМР(1-76).

Под "истощением антисыворотки" против данного конкретного антигена (иммунизирующего антигена) понимается удаление неспецифических антител, которые могут присутствовать в антисыворотке, путем обработки и инкубирования этой антисыворотки с "неспецифическими антигенами", то есть антигенами, отличными от иммунизирующего антигена, а затем отделения и иммунологического удаления антител, прореагировавших с данными "неспецифическими антигенами", и выделения истощенной таким образом антисыворотки (т.е. обедненной неспецифическими антителами). Истощение в классическом виде служит для того, чтобы сделать полученную антисыворотку специфичной к данному антигену.

В настоящем случае антисыворотка, распознающая последовательность Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGSG₈₅ и/или последовательность Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGSg4 или последовательность RAPR₇₆S₇₇P из проBNP(1-108), может быть истощена, то есть она станет специфической путем обработки ее вышеуказанными BNP(77-108) и/или BNP(1-76), причем эти последние, к примеру, могут быть иммобилизованы на твердой фазе и служить в качестве носителя при хроматографии методом иммуноадсорбции согласно традиционным методам, известным в этой области. При этом антитела, находящиеся в конечном счете в истощенной антисыворотке, являются поликлональными и моноспецифическими.

Предметом настоящего изобретения также является пептид формулы

a₁-X₁-RAPRSP-X₂-a₂ (I)

где a₁ означает Н или функциональную группу или химическую группировку, выбранную из тиоловой, спиртовой, аминоокси- функциональных групп, первичного или вторичного амина, аминокарбоксильной, биотинильной и ацетильной групп,

X₁ - пептидная последовательность из 0-3 аминокислот, происходящая или не происходящая из природной последовательности проBNP(1-108),

Х₂ - пептидная последовательность из 0-8 аминокислот, предпочтительно из 7 аминокислот, происходящая или не происходящая из природной последовательности проBNP(1-108),

а₂ - функциональная группа ОН, NH₂ или алкоксильная группа.

Предметом настоящего изобретения также является пептид формулы

X-Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGSG₈₅-Z (II)

где Х означает Н или ацетильную группу либо 1-3 аминокислоты, не принадлежащие к последовательности проBNP(1-108), a Z означает группу ОН или 1-3 аминокислоты, не принадлежащие к последовательности проBNP(1-108).

Предметом настоящего изобретения также является пептид формулы

X-Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGS₈₄-Z (III)

где Х означает Н или ацетильную группу либо 1-3 аминокислоты, не принадлежащие к последовательности проBNP(1-108), a Z означает группу ОН или 1-3 аминокислоты, не принадлежащие к последовательности проBNP(1-108).

Следует отметить, что в вышеприведенных формулах (II) и (III) номера аминокислот (Y₇₀, R₇₆, S₇₇, S₈₄, G₈₅) сохраняются просто для того, чтобы облегчить понимание изобретения, а также для сравнения этой последовательности с последовательностью проBNP(1-108). В данной заявке есть и другие последовательности, которые приводятся вместе с номерами.

Изобретение также касается всех пептидов, содержащих последовательность X-Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGSG₈₅-Z (II) или последовательность X-Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGS₈₄-Z (III) либо одну из последовательностей (II) или (III) в замещенной форме, консервативным или неконсервативным образом, по какой-либо из аминокислот в положении от 70 до 85 или 84 соответственно, при условии, что участок RAPR₇₆S₇₇R остается интактным (в частности, незамещенным).

При этом имеются в виду пептиды, имеющие последовательность, происходящую из последовательности X-Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGSG₈₅-Z (II) или последовательности X-Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGS₈₄-Z (III) путем замены одной или нескольких аминокислот из числа Y₇₀, T₇₁, L₇₂, К₇₉, M₈₀, V₈₁, Q₈₂, G₈₃, S₈₄ и G₈₅, причем Х может отсутствовать или означает группу NH₂ либо 1-3 аминокислоты, не принадлежащие к последовательности проBNP(1-108), a Z может отсутствовать или означает группу ОН или 1-3 аминокислоты, не принадлежащие к последовательности проBNP(1-108).

Наконец, изобретение касается пептида с последовательностью Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGSG₈₅ и пептида с последовательностью Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGS₈₄.

Следующим предметом изобретения является способ получения антител к проBNP(1-108), распознающих специфическим образом последовательность Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGSG₈₅, Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGS₈₄ и/или последовательность RAPR₇₆S₇₇P из проBNP(1-108), практически исключая BNP(1-76) и BNP(77-108), и обладающих способностью к специфическому распознаванию циркулирующего проBNP(1-108) в образцах сыворотки или плазмы человека, который характеризуется тем, что животное иммунизируют пептидом формулы:

a₁-X₁-RAPRSP-X₂-a₂ (I)

где a₁, X₁, X₂ и а₂ имеют те же значения, что и выше,

а также тем, что полученную антисыворотку при необходимости истощают с помощью пептида BNP(77-108) и/или пептида BNP(1-76). Полученные при этом антитела являются моноспецифическими.

Следующим предметом изобретения является способ получения антител к проBNP(1-108), распознающих специфическим образом последовательность Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGSG₈₅, Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGS₈₄ и/или последовательность RAPR₇₆S₇₇P из проBNP(1-108), практически исключая BNP(1-76) и BNP(77-108), и обладающих способностью к специфическому распознаванию циркулирующего проBNP(1-108) в образцах сыворотки или плазмы человека, который характеризуется тем, что животное иммунизируют пептидом формулы

X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85-Z

(II)

или пептидом формулы

X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84-Z

(III),

где Х и Z означают то же, что и выше,

а также тем, что полученную антисыворотку при необходимости истощают с помощью пептида BNP(77-108) и/или пептида BNP(1-76).

Предметом изобретения также является способ получения гибридомы, секретирующей антитела к проBNP(1-108), распознающие специфическим образом последовательность Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGSG₈₅, Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGS₈₄ и/или последовательность RAPR₇₆S₇₇P из проBNP(1-108), практически исключая BNP(1-76) и BNP(77-108), и обладающие способностью к специфическому распознаванию циркулирующего проBNP(1-108) в образцах сыворотки или плазмы человека, который характеризуется тем, что животное иммунизируют пептидом формулы

X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85-Z

(II)

или пептидом формулы

X-Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGS₈₄-Z (III)

в замещенной форме, консервативным или неконсервативным образом, при условии, что участок RAPR₇₆S₇₇P остается интактным (в частности, незамещенным), где Х и Z означают то же, что и выше, а также тем, что полученную антисыворотку при необходимости истощают с помощью пептида BNP(77-108) и/или пептида BNP(1-76).

Следующим предметом изобретения является способ получения антител к проBNP(1-108), распознающих специфическим образом последовательность Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGSG₈₅, Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGS₈₄ и/или последовательность RAPR₇₆S₇₇P из проBNP(1-108), практически исключая BNP(1-76) и BNP(77-108), и обладающих способностью к специфическому распознаванию циркулирующего проBNP(1-108) в образцах сыворотки или плазмы человека, который характеризуется тем, что животное иммунизируют пептидом с последовательностью Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGSG₈₅ или пептидом с последовательностью Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGS₈₄, а также тем, что полученную антисыворотку при необходимости истощают с помощью пептида BNP(77-108) и/или пептида BNP(1-76).

Предметом изобретения также является способ получения гибридомы, секретирующей антитела к проBNP(1-108), распознающие специфическим образом последовательность Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGSG₈₅, Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGS₈₄ и/или последовательность RAPR₇₆S₇₇P из проBNP(1-108), практически исключая BNP(1-76) и BNP(77-108), и обладающие способностью к специфическому распознаванию циркулирующего проBNP(1-108) в образцах сыворотки или плазмы человека, который характеризуется тем, что:

- животное иммунизируют пептидом, выбранным из числа пептидов следующих формул:

a₁-X₁-RAPRSP-X₂-a₂ (I)

где a₁, X₁, X₂ и а₂ имеют те же значения, что и выше;

X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85-Z

(II)

где Х и Z имеют те же значения, что и выше;

X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84-Z

(III)

где Х и Z имеют те же значения, что и выше;

X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85-Z

(II)

в замещенной форме, консервативным или неконсервативным образом, при условии, что участок RAPR₇₆S₇₇P остается интактным (в частности, незамещенным), где Х и Z имеют те же значения, что и выше;

X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84-Z

(III)

в замещенной форме, консервативным или неконсервативным образом, при условии, что участок RAPR₇₆S₇₇P остается интактным (в частности, незамещенным), где Х и Z имеют те же значения, что и выше;

Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGSG₈₅

и Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGS₈₄;

- выделяют лимфоциты, секретирующие иммуноглобулины этого животного, а также

- осуществляют слияние лимфоцитов с клетками миеломы для получения, по меньшей мере, одной гибридомы, секретирующей иммуноглобулины.

Этот способ соответствует классической методике получения гибридом, принцип которой описан в Kohler et Milstein (1975) Nature (London), 256: 495-497.

Предметом изобретения также является такая гибридома и моноклональные антитела к проBNP, секретируемые данной гибридомой.

Кроме того, предметом изобретения является способ диагностики in vitro сердечной недостаточности у человека, включающий обработку биологических образцов, предпочтительно крови, плазмы или сыворотки, антителами к проBNP(1-108), распознающими специфическим образом последовательность Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGSG₈₅, последовательность Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGS₈₄ и/или последовательность RAPR₇₆S₇₇P из проBNP(1-108), практически исключая BNP(1-76) и BNP(77-108), и обладающие способностью к специфическому распознаванию циркулирующего проBNP(1-108) в образцах сыворотки или плазмы человека, и детектирование проBNP(1-108) в образцах.

Изобретение обеспечивает обобщенным образом способ диагностики in vitro сердечной недостаточности у человека, включающий стадии:

a) обработки биологических образцов, предпочтительно крови, плазмы или сыворотки, антителами к проBNP(1-108), распознающими специфическим образом последовательность Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGSG₈₅, последовательность Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGS₈₄ и/или последовательность RAPR₇₆S₇₇P из проBNP(1-108), практически исключая BNP(1-76) и BNP(77-108), и обладающими способностью к специфическому распознаванию циркулирующего проBNP(1-108) в образцах сыворотки или плазмы человека;

b) инкубации этой смеси в условиях, способствующих образованию комплексов антиген-антитело;

c) обнаружения образовавшихся комплексов антиген-антитело, при необходимости с помощью детектирующих антител, меченых и способных к специфическому связыванию с проBNP(1-108), присутствующим в первом комплексе, либо с помощью детектирующего антигена, меченого и способного к связыванию с антителами к проBNP(1-108), присутствующими в первом комплексе.

В частности, изобретение обеспечивает способ диагностики сердечной недостаточности, который включает помимо вышеуказанных стадий a, b и с также стадию d) коррелирования количества обнаруженных комплексов антиген-антитело с клиническим состоянием субъекта.

Кроме того, предметом настоящего изобретения является набор для обнаружения проBNP(1-108) в биологических образцах, особенно в образцах крови, плазмы или сыворотки, содержащий, по меньшей мере, одно антитело к проBNP(1-108), распознающее специфическим образом последовательность Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGSG₈₅, последовательность Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGS₈₄ и/или последовательность RAPR₇₆S₇₇P из проBNP(1-108), практически исключая BNP(1-76) и BNP(77-108), и обладающее способностью к специфическому распознаванию циркулирующего проBNP(1-108) в образцах сыворотки или плазмы человека.

Наконец, изобретение предусматривает набор для обнаружения проBNP(1-108) в биологических образцах, особенно в образцах крови, плазмы или сыворотки, содержащий в качестве стандарта или контроля композицию, содержащую, по меньшей мере, один пептид, выбранный из числа пептидов следующих формул:

a₁-X₁-RAPRSP-X₂-a₂ (I)

где a₁, X₁, Х₂ и а₂ имеют те же значения, что и выше;

X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85-Z

(II)

где Х и Z имеют те же значения, что и выше;

X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85-Z

(II)

в замещенной форме, консервативным или неконсервативным образом, при условии, что участок RAPR₇₆S₇₇P остается интактным (в частности, незамещенным), где Х и Z имеют те же значения, что и выше;

X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84-Z

(III)

где Х и Z имеют те же значения, что и выше;

X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84-Z

(III)

в замещенной форме, консервативным или неконсервативным образом, при условии, что участок RAPR₇₆S₇₇P остается интактным (в частности, незамещенным), где Х и Z имеют те же значения, что и выше;

Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGSG₈₅;

Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGS₈₄.

Определения

В контексте изобретения "биологический образец", а также "образец биологической жидкости" предпочтительно состоит из биологической жидкости, такой как кровь, плазма, сыворотка, моча, спинномозговая жидкость, слюна и др.

Под "сердечной недостаточностью" понимается такое патологическое состояние, при котором нарушение функции сердца вызывает неспособность его к прокачиванию крови достаточным образом, чтобы соответствовать метаболическим потребностям организма, и/или при котором сердце обеспечивает потребности, но с аномально высоким давлением при заполнении. В частности, можно говорить о недостаточности правого и/или левого желудочка.

Термин "антитело" относится к любым антителам, как целым, так и функциональным фрагментам антител (полученных методами генной инженерии или нет), включающим или состоящим из, по меньшей мере, одного участка связывания антигена, позволяющего связывание антитела, по меньшей мере, с одной антигенной детерминантой антигенного соединения. В качестве примера фрагментов антител можно привести фрагменты Fab, Fab', Р(ab')₂, а также вариабельные фрагменты с простой цепью (цепи scFv).

Антитела к проBNP(1-108) по изобретению могут быть поликлональными или моноклональными. Поликлональные антитела к проBNP(1-108) по изобретению могут быть получены, кроме прочего, путем иммунизации таких животных, как кролики, мыши и пр. с помощью целого проBNP(1-108), выделения и затем истощения полученной антисыворотки, к примеру, на иммуносорбенте, содержащем BNP(77-108) и/или BNP(1-76), в соответствии с методами, известными в этой области. Моноклональные антитела к проBNP(1-108) по изобретению могут быть получены, кроме прочего, классическим методом Kohler et Milstein, Nature (London), 256: 495-497 (1975).

Получение моноклональных антител или моноспецифических поликлональных антисывороток или антител, получаемых при скрининге геномных банков, применимых в рамках настоящего изобретения, основывается на общепринятых методах, которые подробно изложены ниже.

Под "захватывающими антителами" понимаются антитела или части антител, предпочтительно фиксированные на твердой фазе, которые способны связывать антиген проBNP(1-108), находящийся в биологическом образце, путем аффинной связи.

Наличие антигена в биологическом образце выявляют с помощью "средств детектирования". В отношении детекции антигена изобретение, в частности, предусматривает детектирование с помощью, по меньшей мере, одного "детектирующего антитела". Такие детектирующие антитела, меченые, способны связываться с захваченным антигеном путем аффинной связи, распознавая эпитопный участок, отличающийся от того, который распознается захватывающим антителом.

Термин "меченый" относится как к прямому мечению (при помощи ферментов, радиоизотопов, флуорохромов, люминесцентных соединений и т.п.), так и к непрямому мечению (например, при помощи других антител, меченых прямым способом, или с помощью реагентов, составляющих меченую "аффинную пару", к примеру, таких как пара меченый авидин-биотин и пр.).

Под "антигенным фрагментом" понимается любая часть проBNP(1-108), способная индуцировать у иммунизированного животного синтез антител, специфичных практически только к проBNP(1-108).

В соответствии с настоящим изобретением "антигенный фрагмент" содержит, по меньшей мере, "эпитопный участок" или эпитоп RAPR₇₆S₇₇P. "Эпитопный участок" или "эпитоп" - это аминокислотная последовательность, распознаваемая, по меньшей мере, одним антителом и позволяющая специфическое связывание с ним.

Термин "моноспецифические поликлональные антитела" применяется к любым поликлональным антителам, проявляющим специфичность только к одному эпитопу. Это означает, что эти антитела способны связываться с такой аминокислотной последовательностью из последовательности проBNP(1-108), которая содержит аминокислоты, входящие в состав эпитопа, но не способны связываться с такой аминокислотной последовательностью из последовательности проBNP(1-108), которая не содержит аминокислот, входящих в состав эпитопа.

Термин "специфически", если он относится к распознаванию или специфическому связыванию антитела с антигеном, означает, что антитело взаимодействует с антигеном без заметного связывания с другими антигенами или, когда речь идет о "специфическом" распознавании эпитопа, о почти исключительном распознавании этого эпитопа. Предпочтительно константа связывания превышает 10 л/моль.

Под "консервативной заменой" понимается, в частности, замена аминокислоты одного класса другой аминокислотой из того же класса, при этом замена не ведет к значительной модификации иммунореактивности полученного пептида по отношению к исходному пептиду. Из различных классов аминокислот обычно выделяют аминокислоты с полярной боковой цепью (аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин), аминокислоты с неполярной боковой цепью (глицин, аланин, валин, лейцин, изолейцин, фенилаланин, метионин, триптофан, цистеин), аминокислоты с боковой цепью основного характера (лизин, аргинин, гистидин) и аминокислоты с боковой цепью кислотного характера (аспарагиновая и глутаминовая кислота).

Под "неконсервативной заменой" понимаются все другие типы замен, которые не ведут к значительной модификации иммунореактивности полученного пептида по отношению к исходному пептиду.

Выражение "практически не распознает ни BNP(1-76), ни BNP(77-108)" означает, что антитело по изобретению проявляет перекрестную реакцию с BNP(1-76) или BNP(77-108) на уровне менее 20%, в особенности менее 10%, предпочтительно менее 5%. Определение степени перекрестной реакции осуществляется в соответствии с методами, известными в этой области, например, приведенными в примере 5.

"Практическое" отсутствие распознавания пептидов BNP(1-76) и BNP(77-108) предпочтительно соответствует отсутствию или почти полному отсутствию реакции антител по изобретению с этими пептидами.

Выражение "практически исключая BNP(1-76) и BNP(77-108)" означает, что антитела "практически не распознают ни BNP(1-76), ни BNP(77-108)" в смысле, изложенном выше.

Получение специфических антител

Антитела, используемые в изобретении, обладают специфичностью к антигену и по этой причине они представляют собой моноклональные антитела или моноспецифические поликлональные антитела, то есть они распознают специфически только один эпитоп.

Моноклональные антитела могут быть получены классическим методом слияния с лимфоцитами и культивирования гибридом, описанным Kohler et Milstein, Nature, 1975, 256: 495-497. Также известны и другие методы получения моноклональных антител (Harlow et al., ed., 1988 "Antibodies: a laboratory manual"). Моноклональные антитела могут быть получены путем иммунизации млекопитающих (к примеру, мышей, крыс, кроликов, а также человека и др.) и применения методики слияния с лимфоцитами с получением гибридом (Kohler et Milstein, 1975).

Существуют методы, альтернативные этому обычному методу. Например, можно получить моноклональные антитела путем экспрессирования нуклеиновой кислоты, клонированной из гибридомы. Равным образом можно получить антитела методом экспрессии в фаге ("фаговый дисплей") при введении ДНК антитела в векторы, которые, как правило, представляют собой нитевидные фаги, презентирующие банки генов V на поверхности фага (например, fUSE5 для Е.coli, см. Scott J.K. et al.. Smith G.P., Science, 1990, 249: 386-390). Методики