Вакцина против репродуктивно-респираторного синдрома свиней эмульсионная инактивированная

Вакцина против репродуктивно-респираторного синдрома свиней эмульсионная инактивированная

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии и может быть использовано при разработке и изготовлении средств специфической профилактики репродуктивного и респираторного синдрома свиней (РРСС).

РРСС - контагиозная вирусная болезнь, характеризующаяся абортами в конце срока супоросности, рождением мертвого и слабого приплода, погибающего в первые 2-3 недели жизни, и поражением органов дыхания у поросят. Гибель поросят может достигать 80-90%.

Впервые болезнь была зарегистрирована и описана в 1987 году в США и Канаде. Первая вспышка заболевания со сходными признаками была отмечена в Германии в 1990 году, откуда инфекция распространилась на территорию большинства стран Европы.

В России заболевание впервые отмечено в 1991 году в хозяйствах Курской области. Болезнь быстро распространялась и на сегодняшний день РРСС диагностирован во многих областях и краях России.

В настоящее время РРСС широко распространен во многих странах мира с развитым свиноводством и чаще протекает в энзоотической (хронической) форме (1-8).

Возбудителем болезни является РНК-содержащий вирус, относящийся к роду Arterivirus, семейства Arteriviridae порядка Nidovirales.

Впервые вирус РРСС изолировали голландские ученые Центрального ветеринарного института в 1991 году в культуре клеток альвеолярных макрофагов поросят (9).

Выделенные в различных странах Европы, Северной Америки и Азии штаммы вируса РРСС отличаются вирулентностью, антигенной структурой и последовательностью нуклеотидов в геномной РНК.

Известны, по крайней мере, два генотипа вируса РРСС - европейский и американский. Гомология между ними на нуклеотидном уровне составляет только 55-70%, а внутри генотипов 97-99%.

Различия касаются не только вариаций в нуклеотидной и аминокислотной структуре, но и размеров вирусных белков. Так размер нуклеокапсидного белка американских штаммов вируса РРСС составляет 123 аминокислоты, а размер нуклеокапсидного белка европейских штаммов составляет 128 аминокислот (10-12).

При проведении молекулярной характеризации отечественных изолятов вируса РРСС установлено, что они принадлежат к европейской группе, однако на уровне аминокислотной последовательности обнаруживают отличия, достигающие 16%, а размер нуклеокапсидного белка отличается от аналогичного показателя как американских (123 аминокислоты), так и европейских штаммов (128 аминокислот) и составляет 125 аминокислот (13).

Данные структурные особенности отечественных изолятов вируса РРСС, касающиеся нуклеокапсида как одного из наиболее консервативных вирусных белков, свидетельствуют о их антигенных отличиях по сравнению с соответствующими характеристиками западно-европейских и американских изолятов вируса.

При сравнении выделенных на территории России изолятов вируса РРСС обнаруживается чрезвычайно высокая их генетическая и антигенная вариабельность.

Это обстоятельство вынуждает вести постоянный поиск новых изолятов вируса РРСС, пригодных для изготовления диагностических и вакцинных препаратов.

Специфическая профилактика РРСС проводится с помощью живых и инактивированных вакцин.

Хотя преимущество живых вакцин из-за технологичности в производстве и простоты применения не вызывает сомнений, однако иммунная реакция у свиней при их введении не всегда стабильна и в ряде случаев вызывает осложнения после вакцинации.

В настоящее время в мировом промышленном свиноводстве для специфической профилактики РРСС широко используют эмульсионные инактивированные вакцины, приготовленные из различных штаммов вируса, выращенного в чувствительных биологических системах (9, 14).

Известна вакцина против РРСС эмульсионная инактивированная, содержащая активное вещество в виде суспензии авирулентного и очищенного антигенного материала из штамма CNCM №I-1102 (Lelystad) вируса РРСС, полученного в чувствительных гетеро- или гомологичных культурах клеток, и целевую добавку в виде масляного адъюванта в эффективном соотношении (15).

Известна вакцина против РРСС эмульсионная инактивированная, содержащая активное вещество в виде суспензии авирулентного и очищенного антигенного материала из штамма CNCM №I-1140 вируса РРСС, полученного в чувствительных гетеро- или гомологичных культурах клеток, и целевую добавку в виде масляного адъюванта в эффективном соотношении (16).

Известна вакцина против РРСС эмульсионная инактивированная, содержащая активное вещество в виде суспензии авирулентного и очищенного антигенного материала из штамма CNCM №I-1153 вируса РРСС, полученного в чувствительных гетеро- или гомологичных культурах клеток, и целевую добавку в виде масляного адъюванта в эффективном соотношении (17).

Известна вакцина против РРСС эмульсионная инактивированная, содержащая активное вещество в виде суспензии авирулентного и очищенного антигенного материала из штамма ЕСАСС №V-93070108 вируса РРСС, полученного в чувствительных гетеро- или гомологичных культурах клеток, и целевую добавку в виде масляного адъюванта в эффективном соотношении (18).

Известна вакцина против РРСС эмульсионная инактивированная, содержащая активное вещество в виде суспензии авирулентного и очищенного антигенного материала из штамма CNCM №I-1387 или штамма CNCM №I-1388 вируса РРСС, полученного в чувствительных гетеро- или гомологичных культурах клеток, и целевую добавку в виде масляного адъюванта в эффективном соотношении (19).

Известна вакцина против РРСС эмульсионная инактивированная, содержащая активное вещество в виде суспензии авирулентного и очищенного антигенного материала из штамма АТСС №VR-2402 вируса РРСС, полученного в чувствительных гетеро- или гомологичных культурах клеток, и целевую добавку в виде масляного адъюванта в эффективном соотношении (20).

Известна вакцина против РРСС эмульсионная инактивированная, содержащая активное вещество в виде суспензии авирулентного и очищенного антигенного материала из штамма АТСС №VR-2509 вируса РРСС, полученного в чувствительных гетеро- или гомологичных культурах клеток, и целевую добавку в виде масляного адъюванта в эффективном соотношении (21).

Известна вакцина против РРСС эмульсионная инактивированная, содержащая активное вещество в виде суспензии авирулентного и очищенного антигенного материала из штамма АТСС №VR-2525 вируса РРСС, полученного в чувствительных гетеро- или гомологичных культурах клеток, и целевую добавку в виде масляного адъюванта в эффективном соотношении (22).

Известна вакцина против РРСС эмульсионная инактивированная, содержащая активное вещество в виде суспензии авирулентного и очищенного антигенного материала из штамма JK-100 (ССТСС V 20005) вируса РРСС, полученного в чувствительных гетеро- или гомологичных культурах клеток, и целевую добавку в виде масляного адъюванта в эффективном соотношении (23).

Известна вакцина против РРСС эмульсионная инактивированная, содержащая активное вещество в виде суспензии авирулентного и очищенного антигенного материала из штамма «БД» вируса РРСС, полученного в культуре клеток Marc-145 с инфекционной активностью не менее 6,0 lg ТЦД₅₀/см³, и целевую добавку в виде масляного адъюванта в соотношении, мас.%:

Антигенный материал	33,3-50,0
Масляный адъювант	до 100,0 (24)

Общим недостатком известных вакцин против РРСС является их низкая противоэпизоотическая эффективность для Российской Федерации, обусловленная тем, что штаммы РРСС, используемые для их изготовления, обладают антигенными и иммунобиологическими отличиями по сравнению с аналогичными характеристиками эпизоотических изолятов вируса РРСС, выделенных на территории России в различные временные промежутки.

Наиболее близкой предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является вакцина против РРСС эмульсионная инактивированная, содержащая активное вещество в виде суспензии авирулентного и очищенного антигенного материала из штамма CNCM №I-1102 (Lelystad) вируса РРСС, полученного в чувствительной биологической системе, и целевую добавку в виде масляного адъюванта в эффективном соотношении (15).

Недостаток вакцины-прототипа состоит также в ее низкой противоэпизоотической эффективности для Российской Федерации, обусловленной тем, что используемый для ее изготовления штамм CNCM №I-1102 (Lelystad) обладает антигенными и иммунобиологическими отличиями по сравнению с аналогичными характеристиками эпизоотических изолятов вируса РРСС, выделенных на территории России в различные временные промежутки.

Кроме того, штамм CNCM №I-1102 (Lelystad) является вирулентным, что всегда создает проблемы при выполнении требований ветеринарно-санитарной безопасности.

В связи с этим актуальной остается проблема создания новых вакцинных препаратов против РРСС эмульсионных инактивированных на основе новых штаммов вируса РРСС, обладающих высокой антигенной и иммуногенной активностью.

В задачу создания настоящего изобретения входила разработка вакцины против РРСС эмульсионной инактивированной, создающей напряженный и длительный иммунитет у привитых животных против циркулирующего на территории России эпизоотического вируса РРСС.

Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в расширении арсенала вакцин против РРСС эмульсионных инактивированных, обладающих высокой антигенной и иммуногенной активностью и безвредностью и создающих напряженный и длительный иммунитет у привитых животных против циркулирующего на территории России эпизоотического вируса РРСС.

Указанный технический результат достигнут созданием вакцины против РРСС эмульсионной инактивированной, охарактеризованной следующей совокупностью признаков.

Предложенное изобретение содержит активное вещество в виде суспензии авирулентного и очищенного антигенного материала из штамма «КПР-96» (авторское наименование) вируса РРСС, полученного в культуре клеток млекопитающих, и целевую добавку в виде масляного адъюванта в эффективном соотношении.

Исходный вирус для получения штамма «КПР-96» выделен в 1996 году из сыворотки крови абортировавших свиноматок с клиническими признаками РРСС из СХП «Победа» Ленинск-Кузнецкого района Кемеровской области и адаптирован серийными пассажами к культуре клеток почки африканской зеленой мартышки Marc-145. Инфекционная активность штамма «КПР-96» вируса РРСС 6 пассажа в среднем составила 5,17 lg ТЦД₅₀/мл, а 17 пассажа - 5,09 lg ТЦД₅₀/мл. В нативном виде штамм «КПР-96» является слабовирулентным для свиней.

Штамм «КПР-96» депонирован во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, Федерального государственного учреждения «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ «ВГНКИ») 28 октября 2004 года под регистрационным номером (ссылкой) «КПР-96»-ДЕП.

Для получения антигенного материала из штамма «КПР-96» вируса РРСС в качестве чувствительной биологической системы используют культуру клеток Marc-145.

Полученный вируссодержащий материал очищают от балластных примесей центрифугированием или любым другим известным методом.

Для инактивации вируса используют аминоэтилэтиленимин (АЭЭИ), который добавляют в очищенную суспензию до концентрации 0,05-0,08 мас.%. Инактивацию вируса ведут при 37°С в течение 20-22 часов с периодическим перемешиванием. По окончании инактивации АЭЭИ нейтрализуют внесением в суспензию тиосульфата натрия.

В соответствии с изобретением вакцина содержит суспензию авирулентного и очищенного антигенного материала из штамма «КПР-96» вируса РРСС, полученного в культуре клеток Marc-145 с инфекционной активностью не менее 5,0 lg ТЦД₅₀/мл, в количестве 33,0 мас.%.

В качестве целевой добавки вакцина содержит масляный адъювант в количестве 67,0 мас.%.

Из масляных адъювантов вакцина содержит масляный адъювант марки Montanide ISA-70 производства фирмы «Seppic» (Франция).

Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые испрашивается правовая охрана:

1. Вакцина против РРСС эмульсионная инактивированная.

2. Активное вещество в виде суспензии авирулентного и очищенного антигенного материала из штамма «КПР-96» вируса РРСС в эффективном количестве.

3. Целевая добавка.

Признаками изобретения, характеризующими предлагаемую вакцину и совпадающими с признаками прототипа, в том числе родовое понятие, отражающее назначение, являются:

1. Вакцина против РРСС эмульсионная инактивированная.

2. Активное вещество.

3. Целевая добавка.

По сравнению с вакциной-прототипом существенным отличительным признаком предлагаемого изобретения является то, что в качестве активного вещества оно содержит суспензию авирулентного и очищенного антигенного материала из штамма «КПР-96» вируса РРСС в эффективном количестве.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:

1. Суспензия авирулентного и очищенного антигенного материала из штамма «КПР-96» вируса РРСС, полученного в чувствительной биологической системе.

2. Суспензия авирулентного и очищенного антигенного материала из штамма «КПР-96» вируса РРСС, полученного в культуре клеток Marc-145 с инфекционной активностью не менее 5,0 lg ТЦД₅₀/мл.

3. Суспензия авирулентного и очищенного антигенного материала из штамма «КПР-96» вируса РРСС, полученного в культуре клеток Marc-145 с инфекционной активностью не менее 5,0 lg ТЦД₅₀/мл, в количестве 33,0 мас.%.

4. Целевую добавку в виде масляного адъюванта.

5. Из масляных адъювантов масляный адъювант марки Montanide ISA-70.

6. Масляный адъювант марки Montanide ISA-70 в количестве 67,0 мас.%.

7. Суспензия авирулентного и очищенного антигенного материала из штамма «КПР-96» вируса РРСС, полученного в культуре клеток Marc-145 с инфекционной активностью не менее 5,0 lg ТЦД₅₀/мл, и масляный адъювант в соотношении, мас.%:

Антигенный материал	33,0
Масляный адъювант до	100,0

Предлагаемое изобретение расширяет арсенал вакцин против РРСС эмульсионных инактивированных, обладающих высокой антигенной и иммуногенной активностью и безвредностью и создающих напряженный и длительный иммунитет у привитых животных против циркулирующего на территории России эпизоотического вируса РРСС.

Достижение технического результата от использования предлагаемого изобретения объясняется тем, что оно содержит суспензию авирулентного и очищенного антигенного материала из штамма «КПР-96» вируса РРСС, сохраняющего нативные иммунобиологические свойства после инактивации и обладающего высокой антигенной и иммуногенной активностью и безвредностью.

Экспериментально подтверждена возможность его использования для изготовления вакцины против РРСС эмульсионной инактивированной.

Штамм «КПР-96» вируса РРСС обеспечивает получение эффективной инактивированной вакцины против РРСС, создающей защиту восприимчивых животных от возбудителя заболевания, циркулирующего на территории России.

Сущность изобретения пояснена на графическом изображении, на котором представлены результаты сравнения последовательностей аминокислот белка GP5 штамма «КНР-96» и штамма CNCM №I-1102 (Lelystad) вируса РРСС, а также в перечне последовательностей, в котором:

SEQ ID NO:1 представляет последовательность нуклеотидов гена OPC5 штамма «КПР-96» вируса РРСС;

SEQ ID NO:2 - последовательность аминокислот белка GP5

штамма «КПР-96» вируса РРСС.

Штамм «КПР-96» вируса РРСС характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические свойства

Штамм «КПР-96» вируса РРСС относится к семейству Arferiviridae, роду Arterivirus, RNA-геномный, обладает морфологическими признаками, характерными для вируса РРСС: форма вириона шарообразная. Размер вириона 45-75 им с ядром, занимающим 3/4 вириона диаметром 25-35 нм, окружен липидной оболочкой.

Антигенные свойства

Вирус РРСС штамма «КПР-96» стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой.

Вирус не обладает гемагглютинирующими свойствами. При вакцинации антиген из штамма «КПР-96» индуцирует образование специфических антител, выявляемых в иммуноферментном анализе (ИФА).

Определение антигенной активности и специфичности штамма «КПР-96» вируса РРСС проводили путем выявления специфических антител в сыворотках крови свиней, полученных через 28 суток после их иммунизации эмульсионной инактивированной вакциной, изготовленной из штамма «КПР-96» вируса РРСС.

До иммунизации в сыворотках крови животных антител к вирусу РРСС не выявляли, а через 28 суток после вакцинации во всех пробах выявляли в ИФА специфические антитела в пределах от 1,79 до 2,05.

Биотехнологические характеристики

Штамм «КПР-96» проявляет высокую биологическую активность.

Биологическую активность штамма определяли путем титрования на культуре клеток Marc-145.

Вирус 6 и 17 пассажей, полученный в культуре клеток Marc-145, использовали для типирования после двукратного замораживания-оттаивания и низкоскоростного центрифугирования для осаждения клеточного детрита. Результаты типирования на культуре клеток Marc-145 показали, что биологическая активность штамма «КПР-96» вируса РРСС 6 пассажа в среднем составила 5,17 lg ТЦД₅₀/мл, а 17 пассажа - 5,09 lg ТЦД₅₀/мл.

Разница в титрах вируса 6 и 17 пассажей несущественна, т.е. в результате 11 пассажей биологическая активность штамма «КПР-96» вируса РРСС оставалась неизменной.

Хемо- и генотаксономическая характеристика

Геном вируса РРСС штамма «КПР-96» состоит из одной молекулы линейной позитивной одноцепочечной РНК размером около 15000 нуклеотидов. 5'-конец РНК кэпирован, а 3'-конец полиаденилирован. Ген капсидного белка расположен на 3'-концевой части генома. Геном штамма «КПР-96», как и другие штаммы и изоляты вируса РРСС, содержит восемь открытых рамок считывания (ОРС), которые кодируют гены репликаз (ОРС 1а и 1b), оболочечные белки (ОРС 2-6) и нуклеокапсидный белок (ОРС 7). Были определены шесть структурных белков вируса РРСС и их соответствующих генов: негликозилированный нуклеокапсидный белок N (мол. масса 15 kDa), кодируемый ОРС 7, негликозилированный трансмембранный белок М (мол. масса 18 kDa), кодируемый ОРС 6, и четыре N-гликозилированных белка с мол. массой 25; 31-35; 45-50 и 29-30 kDa, кодируемые ОРС 5, ОРС 4, ОРС 3 и ОРС 2 соответственно. Сферические вирионы имеют диаметр 45-75 нм, включают ядро диаметром 25-35 нм. В состав оболочки вириона входят липиды и углеводы как часть гликопротеинов.

Идентификацию и специфичность вируса РРСС определяли методами полимеразной цепной реакции (ПЦР) и нуклеотидного секвенирования.

В результате проведенных исследований обнаружен только геном вируса РРСС. Нуклеотидное секвенирование гена ОРС 5 подтвердило, что штамм «КПР-96» относится к европейскому генотипу вируса РРСС. Сравнение выведенных из нуклеотидных последовательностей ОРС 5 аминокислотных последовательностей белка GP5 показало, что штамм «КПР-96» отличается от штамма CNCM №I-1102 (Lelystad) по двум аминокислотным остаткам (а.о.). Двадцатый а.о. у «КПР-96» представлен фенилаланином, а у штамма CNCM №I-1102 (Lelystad) - лейцином, в 37 позиции белка GP5 у «КПР-96» и CNCM №I-1102 (Lelystad) находятся аспарагин и аспарагиновая кислота соответственно.

Физические свойства

Масса вириона от 49×10³ Da до 55×10 Da. Плавучая плотность в градиенте хлористого цезия 1,18-1,2 г/мл.

Устойчивость к внешним факторам

Штамм «КПР-96» неустойчив к эфиру, хлороформу и детергентам, чувствителен к формальдегиду, ультрафиолетовому облучению, гамма-облучению и высыханию.

Дополнительные признаки и свойства

Иммуногенная активность - через 14 дней после иммунизации свиней вызывает у них образование специфических антител.

Реактогенность отсутствует.

Является слабовирулентным для свиней.

Онкогенность отсутствует.

Является контагиозным при контакте (совместном содержании инфицированных и здоровых свиней).

Исходя из полученных данных, можно утверждать, что штамм «КПР-96» вируса РРСС по антигенному и иммунологическому спектрам является оригинальным, в таксономическом отношении новым, ранее неизвестным штаммом вируса РРСС.

Проведенный заявителем анализ уровня техники, включающий поиск по патентным и научно-техническим источникам информации и выявление источников, содержащих сведения об аналогах предлагаемого изобретения, позволил установить, что заявитель не обнаружил источники, характеризующиеся признаками, тождественными (идентичными) всем существенным признакам предлагаемого изобретения.

Определение из перечня выявленных аналогов прототипа как наиболее близкого по совокупности существенных по отношению к усматриваемому заявителем техническому результату отличительных признаков предлагаемого изобретения, изложенных в независимом пункте формулы изобретения.

Следовательно, заявленное решение соответствует условию патентоспособности «новизна».

Для проверки соответствия предлагаемого решения условию патентоспособности «изобретательский уровень» проведен дополнительный поиск известных решений для выявления признаков, включенных в отличительную часть независимого пункта формулы изобретения. Результаты поиска показали, что предлагаемое решение не вытекает для специалиста явным образом из известного уровня техники, изложенного в соответствующем разделе описания (не выявлены решения, имеющие признаки, совпадающие с отличительными признаками предлагаемого изобретения), а также не выявлено влияние предусматриваемых существенными признаками предлагаемого изобретения преобразований для достижения технического результата.

Следовательно, предлагаемое решение соответствует условию патентоспособности «изобретательский уровень».

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его исполнения и использования, которые не ограничивают его объем.

Пример 1.

В 1996 году при вирусологическом исследовании сывороток крови свиней с клиническими признаками РРСС, полученных из СХП «Победа» Ленинск-Кузнецкого района Кемеровской области, на культуре клеток Marc-145 был выделен изолят вируса РРСС. Для выделения вируса РРСС из полевого материала были использованы пластиковые культуральные матрасы с монослоем культуры клеток Marc-145. Небольшим объемом (1 см³) общей пробы из суспензии патологического материала (легкие и транссудат от мертворожденных поросят) и сыворотки крови свиноматок с клиническими признаками РРСС заразили культуру клеток Marc-145 и ее поместили в СО₂-инкубатор на один час при 37°С. После этого к инфицированным клеткам добавили среду Игла с 10% содержанием фетальной сыворотки КРС и антибиотиками. Выраженное цитопатическое действие (ЦПД) проявилось через 6 пассажей на культуре клеток Marc-145. Идентификацию и специфичность вируса определяли в ИФА (IDEXX, США) с контролем специфичности. Вирус может быть выделен также из легких, лимфоузлов, селезенки и других внутренних органов инфицированных поросят.

Выделенный вирус использовали для заражения 3-суточной культуры клеток Marc-145. Перед внесением вируса клеточный монослой однократно промывали фосфатно-буферным раствором (ФБР). Культуру заражали вирусом в дозе 0,01-0,1 ТЦД₅₀ на клетку. Адсорбцию вируса проводили при 37°С в течение 1 часа. После этого в материал вносили среду Игла в объеме 150-200 см³ с добавлением 5% фетальной сыворотки КРС, 50 мкл/мл гентамицина и 0,3 мг/мл глютамина.

Культивирование проводили при 36-37°С в течение 96-144 часов. В качестве контроля оставляли незараженными 3 матраса, в которых меняли среду.

Размножение вируса в культуре клеток Marc-145 определяли по характерному ЦПД с образованием скопления шарообразных клеток, возвышающихся над монослоем. В контрольных матрасах не должно быть каких-либо деструктивных изменений клеток. Матрасы, в которых наблюдали ЦПД с поражением 60% клеточного монослоя (обычно через 48-96 часов), отбирали и замораживали при -20°С. Вирус получали двукратным замораживанием и оттаиванием инфицированных клеток с последующим удалением клеточных остатков путем центрифугирования при 2500 об/мин в течение 20 мин. В течение 120 часов инкубирования вирус 6 пассажа накапливался до титра 5,17 lg ТЦД₅₀/мл. Полученный штамм вируса РРСС (авторское наименование «КПР-96») депонирован во Всероссийской государственной коллекции микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, Федерального государственного учреждения «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ «ВГНКИ») 28 октября 2004 года под регистрационным номером (ссылкой) «КПР-96»-ДЕП.

Пример 2.

Проведена проверка биологических свойств вакцинного штамма «КПР-96» (6 пассаж) по следующим показателям:

- отсутствие бактериальной и грибковой контаминации;

- специфичность и отсутствие вирусной контаминации (метод ПЦР);

- антигенная активность и специфичность (метод ИФА);

- биологическая активность (титрование на культуре клеток Marc-145);

- вирулентность для свиней.

1. Определение отсутствия бактериальной и грибковой контаминации штамма «КПР-96».

Для этого использовали среды Сабуро, мясопептонный бульон (МПБ), мясопептонный агар (МПА) и среду Китта-Тароцци. Все используемые бактериальные среды были проверены на ростовые свойства согласно ГОСТу 28085-89. Для испытания из 3 флаконов (отдельно из каждого) с культуральным вирусом вносили по 1 см³ вируссодержащего материала в 4 пробирки с тиогликолевой средой. Пробирки инкубировали при разных температурных режимах.

По две пробирки с содержимым из каждого флакона выдерживали в термостате при температуре 37±0,5°С, одну - при 30±0,5°С, одну - при 22±0,5°C. Через 7 суток из 3 пробирок, инкубируемых при 37±0,5°C, делали пересев на следующие бактериальные среды: агар и жидкую среду Сабуро, МПБ и МПА, сахарный бульон и среду Китта-Тароцци. В среду Китта-Тароцци вносили по 1 см³, а в остальные среды - по 0,5 см³ исследуемого материала и выдерживали в течение 7 суток при температуре 37±0,5°С, со средой Сабуро - при температуре 22±0,5°С.

Все пробирки подвергались ежедневному визуальному контролю в течение 14 суток.

Результаты проверки представлены в таблице 1. Испытания показали, что штамм «КПР-96» вируса РРСС (6 пассаж) не контаминирован бактериальной и грибковой микрофлорой.

На всех средах с высевами и пересевами роста бактериальной и грибковой микрофлоры не наблюдалось.

2. Проверка штамма «КПР-96» вируса РРСС на специфичность и отсутствие вирусной контаминации методом ПЦР.

Определение специфичности и отсутствие вирусной контаминации проводили путем исследования пробы культуральной суспензии вируса РРСС штамма «КПР-96» методом ПЦР на наличие геномов вирусов РРСС, КЧС, болезни Ауески, ПВИС, коронавирусов, цирковирусов и возбудителей микоплазмозов свиней (М.hyopneumoniae, M.hyorhinis, М.hyosynoviae).

Все исследования методом ПЦР проводили согласно «Методическим указаниям по индикации генома вируса РРСС методом полимеразной цепной реакции», утвержденным Департаментом ветеринарии МСХ РФ 21.02.1997 г.

В результате проведенных исследований в пробах культуральной суспензии обнаружен только геном вируса РРСС. Геномы вирусов КЧС, болезни Ауески, ПВИС, корона-вирусов, цирковирусов и возбудителей микоплазмозов свиней (M.hyopneumoniae, M.hyorhinis, M.hyosynoviae) не обнаружены.

Сравнение полных нуклеотидных последовательностей гена нуклеокапсидного белка (ОРС 7) штамма «КПР-96» и других известных штаммов вируса РРСС показало высокую степень его гомологии со штаммом CNCM №I-1102 (Lelystad) вируса РРСС.

Уровень нуклеотидной гомологии по ОРС 7 между штаммами «КПР-96» и «БД» составляет только 60%.

Существенные отличия между штаммами «КПР-96» и «БД» были подтверждены также в ИФА (набор Ingenasa, Испания) перекрестными исследованиями против американского и европейского типов вируса РРСС. Результаты исследований представлены в таблице 2. Данные, приведенные в таблице 2, свидетельствуют о том, что штамм «КПР-96» принадлежит к европейской геногруппе вируса РРСС.

3. Определение специфичности и отсутствия контаминации штамма «КПР-96» вируса РРСС на подсвинках.

Для проведения испытания использовали 3 подсвинков массой 25-30 кг. Все животные были серонегативными по отношению к вирусам РРСС, ПВИС, болезни Ауески, КЧС, трансмиссивного гастроэнтерита свиней (ТГЭС), гриппа и M.hyopneumoniae.

Всем животным вводили внутримышечно по 5 мл культуральной суспензии вируса РРСС штамма «КПР-96» с титром 10^5,0 ТЦД₅₀/мл. До и через 28 суток после заражения от животных отбирали пробы крови и сыворотки исследовали на наличие антител против следующих возбудителей:

- вируса РРСС в ИФА с использованием набора фирмы IDEXX (США), значение s/p<0,4 - специфические антитела отсутствуют, значение s/p≥0,4 - наличие специфических антител;

- вируса ПВИС в РТГА с использованием «Набора препаратов для серодиагностики ПВИС в РТГА» производства ФГУ «ВНИИЗЖ», значение ≥1:256 - наличие специфических антител;

- вируса Ауески с использованием набора фирмы Chekit, значение s/p<50 - специфические антитела отсутствуют, s/p>100 - наличие специфических антител;

- вируса КЧС с использованием набора фирмы Chekit, значение s/p<40 - специфические антитела отсутствуют, s/p>50 - наличие специфических антител;

- вируса ТГЭС в реакции микронейтрализации, значение ≥3,0 log₂ - наличие специфических антител;

- M.hyopneumoniae с использованием набора фирмы Chekit, значение s/p<20 - специфические антитела отсутствуют; s/p>30 - наличие специфических антител;

- вируса гриппа свиней с использованием набора фирмы IDEXX (США), значение s/p<0,4 - специфические антитела отсутствуют, s/p≥0,4 - наличие специфических антител.

Результаты исследований сывороток крови на наличие антител к вышеуказанным возбудителям инфекций представлены в таблице 3.

Приведенные в таблице 3 данные показывают, что в испытанных образцах антитела к вирусам ПВИС, болезни Ауески, КЧС, ТГЭС, гриппа и M.hyopneumoniae не выявлены. Это свидетельствует об отсутствии контаминации штамма «КПР-96» вышеуказанными возбудителями.

4. Определение антигенной активности и специфичности штамма «КПР-96» вируса РРСС методом ИФА.

Указанные исследования проведены методом ИФА путем выявления специфических антител в сыворотках крови свиней, полученных через 28 суток после их иммунизации эмульсионной инактивированной вакциной, изготовленной из штамма «КПР-96» вируса РРСС.

Для этого использовали 4 серонегативных подсвинков массой 25-30 кг. Вирус с титром инфекционности 5,0 lg ТЦД₅₀/мл инактивировали аминоэтилэтиленимином (АЭЭИ) и эмульгировали с масляным адъювантом Montanide ISA-70 в соотношении 1:3. После проверки на стерильность препарат вводили животным внутримышечно в дозе 2 мл на голову.

От всех животных отбирали пробы крови до и через 28 суток после вакцинации. Сыворотки крови исследовали в коммерческом наборе ИФА фирмы IDEXX (США). Результаты изучения антигенной активности штамма «КПР-96» вируса РРСС методом ИФА представлены в таблице 4.

Данные таблицы 4 свидетельствуют о том, что до иммунизации в сыворотках крови подсвинков антител к вирусу РРСС не выявляли, а через 28 суток после вакцинации во всех 4 пробах выявляли специфические антитела в пределах от 1,79 до 2,05 lg ТЦД₅₀/см³.

Проведены также исследования по изучению антигенной активности штаммов «БД», CNCM №I-1102 (Lelystad) и «КПР-96» вируса РРСС на свиньях. Результаты исследований представлены в таблице 5.

Из данных таблицы 5 наглядно видно, что штамм «КПР-96» обладает выраженной антигенной активностью.

После его введения в сыворотках крови 2-3-месячных поросят выявляют неспецифические антитела к вирусу РРСС на достаточно высоком уровне, как при интраназальном, так и внутримышечном методах введения вируссодержащего материала. Кроме того, уровень антител к вирусу РРСС через 21 сутки после иммунизации, штаммом «КПР-96» был выше, чем у поросят, иммунизированных штаммом «БД».

5. Определение биологической активности штамма «КПР-96» вируса РРСС.

Биологическую активность штамма «КПР-96» определяли путем титрования на культуре клеток Marc-145 по общепринятой методике. Вирус 6 и 17 пассажей, выращенный в культуре клеток Marc-145, использовали для титрования после двукратного замораживания-оттаивания и низкоскоростного центрифугирования для осаждения клеточного детрита.

Для титрования вируса РРСС использовали 2-3-суточный монослой культуры клеток Marc-145, выращенный в пробирках. Вначале готовили 10-кратные разведения (от 10^-1 до 10^-9) вируссодержащего материала на среде Игла без сыворотки (рН 7,0-7,4). Каждое разведение вируса вносили в 4 пробирки с культурой клеток. Предварительно из пробирок сливали ростовую среду, вносили по 0,1 см³ разведенного вируса.

После 1 часа контакта добавляли 0,9 см³ питательной среды. На пробирках указывали номер исследуемого материала (числитель) и разведения (знаменатель). Пробирки оставляли в штативах в наклонном положении и помещали в термостат для инкубирования при температуре +37°С.

Одновременно ставили контроль с незараженной культурой клеток. Ежедневно в течение 6 суток проводили учет результатов титрования путем просмотра каждой пробирки под малым увеличением микроскопа. После просмотра отмечали ЦПД вируса (условно в крестах), окончательный учет результатов проводили через 144 часа после заражения культуры клеток. Результаты титрования считали достоверными при сохранении монослоя в контроле.

Расчет титра проводили по методу Кербера. Каждый пассаж испытуемого вируса титровали в 3-х повторностях. Результаты определения биологической активности штамма «КПР-96» вируса РРСС представлены в таблице 6. Результаты титрования па культуре клеток Marc-145 показали, что биологическая активность штамма «КПР-96» вируса РРСС 6 пассажа составляет в среднем 5,17 lg ТЦД₅₀/мл, а 17 пассажа - 5,09 lg ТЦД₅₀/мл. Разница в титрах вируса 6 и 17 пассажей несущественна, т.е. в результате 11 пассажей биологическая активность штамма «КПР-96» вируса РРСС оставалась неизменной.

Проведены также исследования культуральных свойств штаммов «БД», CNCM №I-1102 (Lelystad), NVSL, №2156 и «КПР-96». Результаты этих исследований представлены в таблице 7. Из таблицы 7 видно, что ЦПД у штамма «КПР-96» в культуре клеток Marc-145 появляется с 3 суток после заражения и достигает максимального проявления на 5 сутки, при этом титр вируса составляет 5,1±0,07 lg ТЦД₅₀/мл.

6. Определение степени вирулентности штамма «КПР-96» вируса РРСС на свиньях.

Степень вирулентности штамма «КПР-96» для свиней изучали на поросятах 2-4-месячного возраста с живой массой 25-30 кг. Результаты этих опытов представлены в таблице 8.

Из таблицы 8 видно, что проверка штамма «КПР-96» на поросятах 2-4-месячного возраста на уровне 17 пассажа показала, что он является слабовирулентным, так как у некоторых зараженных подсвинков наблюдали только незначительное повышение температуры тела (до 40,7°С) в течение 1-4 суток.

Полученный штамм «КПР-96» был испытан также на супоросных свиноматках. Двух серонегативных супоросных свинок интраназально заразили за 4 недели до опороса. Обе свиноматки на 114 день после осеменения опоросились. От них получено 23 поросенка. Характеристика приплода свиноматок представлена в таблице 9.

Согласно приведенным в таблице 9 данным, свиноматки принесли 18 живых здоровых поросят (78,3%) и у одной свиноматки родилось 2 нежизнеспособных поросенка (8,7%) и 3 с патологией глаз (13%). Два нежизнеспособных поросенка погибли в первые сутки после рождения. За время подсосного периода у оставшихся поросят, в том числе и у родившихся с патологией глаз, каких-либо клинических признаков РРСС не наблюдали.

В сыворотках крови у поросят до приема молозива антител к вирусу РРСС не было выявлено. Исследование проб плацент свиноматок и внутренних органов двух вынужденно убитых поросят до приема ими молозива на наличие генома вируса РРСС дало отрицательный результат. В то же время в сыворотках крови свиноматок, отобранных в день опороса, выявляли антитела к вирусу РРСС на высоком уровне s/p 1,76 и 2,24 (в ИФА, IDEXX).

Проведено сравнительное изучение вирулентных свойств штаммов CNCM №I-1