Композиция для стимуляции иммунного ответа (варианты), способы ее получения, применения и способы стимуляции иммунного ответа с использованием этих композиций

Композиция для стимуляции иммунного ответа (варианты), способы ее получения, применения и способы стимуляции иммунного ответа с использованием этих композиций

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится в целом к вакцинным композициям. В частности изобретение относится к вакцинным композициям E1E2 HCV, включающим антигены E1E2, субмикронные эмульсии масла в воде и/или олигонуклеотиды CpG.

Известный уровень техники

Вирус гепатита С (HCV) является основной причиной парентерального гепатита не-A, не-В (NANBH). Вирус присутствует в крови от 0,4 до 2,0% доноров крови. Хронический гепатит развивается у приблизительно 50% инфицированных и из них у приблизительно 20% инфицированных индивидуумов развивается цирроз печени, который иногда ведет к гепатоклеточной карциноме. Соответственно этому исследование и контроль заболевания имеет существенное медицинское значение.

HCV был впервые идентифицирован и охарактеризован Houghton et al. как случай NANBH. Геномная последовательность вируса HCV известна, также как и способы получения последовательности. Смотри, например, международные публикации №№ 89/04669; WO 90/11089 и WO 90/14436. HCV имеет смысловую, односпиральную геномную РНК с 9,5 т.н. и является членом семейства вирусов Flaviridae. На основе филогенетического анализа идентифицировано, по меньшей мере, шесть различных, но родственных генотипов HCV (Simmonds et al., J. Gen. Virol. (1993) 74:2391-2399). Вирус кодирует единственный полипротеин, имеющий более 3000 аминокислотных остатков (Choo et al., Science (1989) 244:359-362; Choo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991) 88:2451-2455; Han et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991) 88:1711-1715). Процессинг полипротеина осуществляется во время трансляции и посттрансляционно с образованием как структурных, так и неструктурных (NS) белков.

В частности, как показано на фиг.1, геномом HCV кодируется несколько белков. Порядок и номенклатура расщепляемых продуктов полипротеина HCV являются следующими: NH₂-C-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4a-NS4b-NS5a-NS5b-COOH. Первоначальное расщепление полипротеина катализируется протеазами хозяина, которые высвобождают три структурных белка, N-концевой нуклеокапсидный белок (обозначаемый как «остов») и два гликопротеина оболочки, "E1" (также известный как E) и "E2" (также известный как E2/NS1), а также неструктурные (NS) белки, которые содержат ферменты вируса. Области NS обозначают NS2, NS3, NS4 и NS5. NS2 представляет собой интегральный белок мембраны с протеолитической активностью, и в сочетании с NS3 расщепляет NS2-NS3 sissle связь, что, в свою очередь, дает NS3 N-конец и высвобождает большой полипротеин, который имеет как активность сериновой протеазы, так и РНК-геликазную активность. Протеаза NS3 служит для процессинга оставшегося полипротеина. В данных реакциях NS3 высвобождает кофактор NS3 (NS4a), два белка (NS4b и NS5a) и РНК-зависимую РНК-полимеразу (NS5b). Завершение созревания полипротеина инициируется автокаталитическим расщеплением в месте соединения NS3-NS4a, катализируемым сериновой протеазой NS3.

E1 определяется как группа с 32-35 кДа и превращается в одиночную H-чувствительную эндополосу с приблизительно 18 кДа. Наоборот, E2 при иммунопреципитации проявляется в виде сложного образа, связанного с генерацией множественных видов полос (Spaete et al., Virol., (1992) 188:819-830; Selby et al., J. Virol. (1996) 70:5177-5182; Grakoui et al., J. Virol. (1993) 67:1385-1395; Tomei et al., J. Virol. (1993) 67:4017-4026). Гликопротеины E1 и E2 оболочки HCV образуют стабильный комплекс, который характеризуется совместной иммунопреципитацией (Grakoui et al., J. Virol. (1993) 67:1385-1395; Lanford et al., Virology (1993) 197:225-235; Ralston et al., J. Virol. (1993) 67:6753-6761).

E1 и E2 остаются в клетках и не имеют сложных углеводов при стабильной экспрессии или при экспрессии во временной системе вируса коровьей оспы (Spaete et al., Virology (1992) 188:819-830; Ralston et al., J. Virol. (1993) 67:6753-6761). Так как белки E1 и E2 обычно являются связанными с мембранами в данных экспрессионных системах, получали секретируемые формы, для того, чтобы облегчить очистку белков. Смотри, например, патент США № 6121020. Кроме того, описана внутриклеточная продукция E1E2 в клетках Hela. Смотри, например, международную публикацию № WO 98/50556.

Гликопротеины E1 и E2 HCV представляют существенный интерес, потому что они, как показано, защищают против заражения вирусом при исследовании на приматах (Choo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994) 91:1294-1298). Однако сохраняется потребность в эффективных вакцинных композициях, включающих данные антигены для профилактики инфицирования HCV.

Вакцинные композиции часто включают иммунологические адъюванты для увеличения иммунных ответов. Например, полный адъювант Фрейнда (ПАФ) является сильным иммуностимулирующим агентом, который успешно применялся со многими антигенами в эксперименте. ПАФ включает три компонента: минеральное масло, эмульгированный агент и убитые микобактерии, такие как Mycobacterium tuberculosis. Водные растворы антигенов смешивают с данными компонентами для создания эмульсии вода в масле. Несмотря на то, что ПАФ эффективен как адъювант, он вызывает тяжелые побочные эффекты, включая боль, образование нарывов и лихорадку, в первую очередь из-за присутствия микобактериального компонента. ПАФ, следовательно, не применяют в медицинских и ветеринарных вакцинах.

Мурамилдипептид (MDP) представляет собой минимальную единицу комплекса стенки микобактериальной клетки, которая создает адъювантную активность, наблюдаемую у ПАФ. Смотри, например, Ellouz et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. (1974) 59:1317. Создано несколько синтетических аналогов MDP, которые проявляют широкий спектр адъювантной способности и побочных эффектов. Для обзора данных аналогов смотри Chedid et al., Prog. Allergy (1978) 25:63. Представители аналогов MDP включают треонильные производные MDP (Byars et al., Vaccine (1987) 5:223), н-бутильные производные MDP (Chedid et al., Infect. Immun. 35:417) и липофильное производное мурамилтрипептида (Gisler et al., in Immunomodulations of Microbial Products and Related Synthetic Compounds (1981) Y. Yamamura and S. Kotani, eds., Excerpta Medica, Amsterdam, p. 167).

Одно липофильное производное MDP представляет собой N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглутаминил-L-аланин-2-(1'-2'-дипальмитоил-sn-глицеро-3-гидроксифосфорилокси)-этиламин (MTP-PE). Данный мурамиловый трипептид включает фосфолипидные хвосты, которые создают возможность для ассоциации гидрофобной части молекулы с липидным окружением, в то время как мурамилпептидная часть связана с водным окружением. Таким образом, сам MTP-PE способен действовать как эмульгирующий агент для создания стабильных эмульсий масла в воде. MTP-PE применяли в эмульсии 4% сквалена с 0,008% Твином™ 80, обозначаемой как MTP-PE-LO (низшее масло), для доставки антигена gD вируса простого герпеса, что давало эффективные результаты (Sanchez-Pescador et al., J. Immunol. (1988) 141:1720-1727), несмотря на плохую физическую стабильность. Недавно была разработана безопасная, высокоиммуногенная, субмикронная эмульсия масла в воде, MF59, которая содержит 4-5% мас./об. сквалена, 0,5% мас./об. Твина 80™, 0,5% Спана 85™, и, необязательно, варьирующие количества MTP-PE, для применения в вакцинных композициях. Смотри, например, Ott et al., "MF59 - Design and Evaluation of a Safe and Potent Adjuvant for Human Vaccines" in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (Powell M.F. and Newmann M.J. eds.) Plenum Press, New York, 1995, pp. 277-296. Choo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994) 91:1294-1298 и Houghton et al., in Viral Hepatitis and Liver Disease (1997), p. 656, описывают применение комплексов E1/E2 HCV с субмикронными эмульсиями масла в воде, которые включают MTP-PE.

Бактериальная ДНК включает неметилированные динуклеотиды CpG, которые характеризуются иммуностимулирующими эффектами на мононуклеарные клетки периферической крови in vitro. Смотри Kreig et al., J. Clin. Immunol. (1995) 15:284-292. Олигонуклеотиды CpG применяли для увеличения иммунных ответов. Смотри, например, патенты США №№ 6207646; 6214806; 6218371 и 6406705.

Несмотря на использование таких адъювантов, традиционные вакцины часто не способны обеспечить адекватную защиту против патогена, на который они направлены. Соответственно продолжает существовать потребность в эффективных вакцинных композициях против HCV, которые включают безопасные и нетоксичные адъюванты.

Краткое изложение существа изобретения

Настоящее изобретение частично основано на неожиданном открытии того, что применение антигенов E1E2 HCV в сочетании с субмикронными эмульсиями масла в воде и олигонуклеотидами, содержащими иммуностимулирующие последовательности нуклеиновой кислоты (ISS), такими как мотивы CpY, CpR и неметилированный CpG (цитозин, за которым следует гуанозин, связанные через фосфат), дает существенно более высокие титры антител, чем таковые, выявляемые без таких адъювантов. Альтернативно, представленные здесь композиции могут быть использованы только с ISS, без субмикронных эмульсий масла в воде, или только с субмикронными эмульсиями масла в воде, в которых отсутствует MTP-PE, без ISS. Применение таких сочетаний обеспечивает безопасный и эффективный подход к увеличению иммуногенности антигенов E1E2 HCV.

Соответственно в одном осуществлении изобретение направлено на композицию, включающую антиген E1E2 HCV и субмикронную эмульсию масла в воде, в которой отсутствует MTP-PE, где субмикронная эмульсия масла в воде способна увеличивать иммунный ответ на антиген E1E2 HCV. Композиция может дополнительно включать ISS, такую как олигонуклеотиды, содержащие мотивы неметилированных CpG ("олигонуклеотид CpG"), который, когда он присутствует, действует, увеличивая иммунный ответ на антиген.

В еще одном осуществлении объект изобретения направлен на способ стимуляции иммунного ответа у субъекта, являющегося позвоночным, который включает введение субъекту терапевтически эффективного количества антигена E1E2 HCV и субмикронной эмульсии масла в воде, в которой отсутствует MTP-PE, где субмикронная эмульсия масла в воде способна увеличивать иммунный ответ на антиген E1E2 HCV. Субъекту может быть также введена одна или более ISS, такая как один или более олигонуклеотидов, содержащих мотивы неметилированных CpG, где ISS способна увеличивать иммунный ответ на антиген E1E2 HCV. Субмикронная эмульсия масла в воде может присутствовать в той же композиции, что и антиген, или может вводиться в виде отдельной композиции. Более того, если присутствует ISS, она может присутствовать в той же композиции, что и антиген и/или субмикронная эмульсия масла в воде, или в отличной композиции.

В еще одних осуществлениях изобретение направлено на способ получения композиции, включающий соединение субмикронной эмульсии масла в воде, в которой отсутствует MTP-PE, с антигеном E1E2 HCV. В определенных осуществлениях способ дополнительно включает соединение ISS, такой как олигонуклеотид, содержащий мотивы неметилированных CpG, способный увеличивать иммунный ответ на антиген E1E2 HCV, с антигеном E1E2 и субмикронной эмульсией масла в воде.

В дополнительных осуществлениях изобретение направлено на композицию, включающую антиген E1E2 HCV и ISS, такую как олигонуклеотид CpG, способный увеличивать иммунный ответ на антиген E1E2 HCV.

В еще одном осуществлении изобретение направлено на способ стимуляции иммунного ответа у субъекта, являющегося позвоночным, который включает введение субъекту терапевтически эффективного количества антигена E1E2 HCV и ISS, такой как олигонуклеотид CpG, где ISS способна увеличивать иммунный ответ на антиген E1E2 HCV. ISS может присутствовать в той же композиции, что и антиген, или может вводиться в виде отдельной композиции.

В еще одних осуществлениях изобретение направлено на способ получения композиции, включающий комбинацию ISS, такой как олигонуклеотид CpG, с антигеном E1E2 HCV, где ISS способна увеличивать иммунный ответ на антиген E1E2 HCV.

Молекула CpG в любом из осуществлений, представленных выше, может иметь формулу 5'-X₁X₂CGX₃X₄, где X₁ и X₂ представляют собой последовательность, выбранную из группы, состоящей из GpT, GpG, GpA, ApA, ApT, ApG, CpT, CpA, CpG, TpA, TpT и TpG, а X₃ и X₄ выбраны из группы, состоящей из TpT, CpT, ApT, ApG, CpG, TpC, ApC, CpC, TpA, ApA, GpT, CpA и TpG, где "p" обозначает связь через фосфат. В определенных осуществлениях олигонуклеотид CpG включает последовательность GACGTT, GACGTC, GTCGTT или GTCGCT, с несколькими прилегающими дополнительными нуклеотидами.

В дополнительном осуществлении олигонуклеотид CpG для применения в композициях настоящего изобретения имеет последовательность 5'-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3' (SEQ ID NO:1) или последовательность 5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3' (SEQ ID NO:5).

В определенных осуществлениях субмикронная эмульсия масла в воде включает:

(1) метаболизируемое масло, где масло присутствует в количестве от 0,5% до 20% от суммарного объема и

(2) эмульгирующий агент, где эмульгирующий агент составляет от 0,01% до 2,5% по массе (мас./об.) и где масло и эмульгирующий агент присутствуют в форме эмульсии масла в воде, имеющей капельки масла, по существу все из которых имеют диаметр от приблизительно 100 нм до менее 1 микрона,

где субмикронная эмульсия масла в воде способна увеличивать иммунный ответ на антиген E1E2 HCV.

В других осуществлениях субмикронная эмульсия масла в воде представляет собой описанное выше и не имеет блоксополимера полиоксипропилен-полиоксиэтилена, также как и какого-либо мурамилпептида.

В дополнительных осуществлениях эмульгирующий агент включает моно-, ди- или триэфир полиоксиэтиленсорбитана и/или моно-, ди- или триэфир сорбитана.

В определенных осуществлениях масло присутствует в количестве от 1% до 12%, таком как от 1% до 4% от суммарного объема и эмульгирующий агент составляет величину от 0,01% до 1% по массе (мас./об.), такую как от 0,01% до 0,05% по массе (мас./об.).

В других описанных здесь осуществлениях субмикронная эмульсия масла в воде включает 4-5% мас./об. сквалена, 0,25-1,0% мас./об. Твина 80™ (моноолеат полиоксиэтиленсорбитана) и/или 0,25-1,0% Спана 85™ (триолеат сорбитана) и необязательно N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглутаминил-L-аланин-2-(1'-2'-дипальмитоил-sn-глицеро-3-гидроксифосфорилокси)-этиламин (MTP-PE).

В других осуществлениях субмикронная эмульсия масла в воде состоит по существу из:

(1) 5% сквалена по объему; и

(2) одного или более эмульгирующих агентов, выбранных из группы, состоящей из Твина 80™ (моноолеат полиоксиэтиленсорбитана) и Спана 85™ (триолеат сорбитана), где суммарное количество присутствующего эмульгирующего(их) агента(ов) составляет 1% по массе (мас./об.); где сквален и эмульгирующий(ие) агент(ы) присутствуют в форме эмульсии масла в воде, имеющей капельки масла, по существу все из которых имеют диаметр от приблизительно 100 нм до менее 1 микрона, и где в композиции отсутствует блоксополимер полиоксипропилен-полиоксиэтилена, и дополнительно, где субмикронная эмульсия масла в воде способна увеличивать иммунный ответ на антиген HCV.

В других осуществлениях один или более эмульгирующих агентов представляют собой моноолеат полиоксиэтиленсорбитана и триолеат сорбитана, а суммарное количество присутствующих моноолеата полиоксиэтиленсорбитана и триолеата сорбитана составляет 1% по массе (мас./об.).

В определенных осуществлениях в композиции отсутствует мурамилпептид.

Данный и другие аспекты изобретения должны быть понятны при отсылке к последующему подробному описанию и прилагаемым фигурам.

Краткое описание фигур

На фигуре 1 показано диаграммное представление генома HCV с изображением различных областей полипротеина HCV.

На фигурах 2A-2С (SEQ ID NOS:3 и 4) представлена нуклеотидная и соответствующая аминокислотная последовательность области E1/E2/p7 HCV-1. Номера, представленные на фигуре, даны относительно полноразмерного полипротеина HCV-1. Представлены области E1, E2 и p7.

Фигура 3 представляет собой диаграмму плазмиды pMHE1E2-809, кодирующей E1E2₈₀₉, типичный белок Е1Е2 для применения в настоящем изобретении.

На фигуре 4 представлены ИФА титры антител к E1E2₈₀₉ мышей, иммунизированных E1E2₈₀₉ плюс CpG; Е1Е2₈₀₉ плюс MF59; E1E2₈₀₉ плюс CpG и MF59; и E1E2₈₀₉ плюс 4XMF59, как описано в примерах. Кружками обозначены титры антител в индивидуальных мышиных сыворотках. Прямоугольники представляют собой среднее геометрическое титра антител (GMT) в группе из 10 мышей. Линии, отражающие величины ошибки, представляют собой интервалы сравнения для статистически значимых различий, определяемых по односторонней оценке дисперсии.

Подробное описание изобретения

В практике настоящего изобретения будут применяться, если не указано иначе, общепринятые для специалистов в данной области техники способы химии, биохимии, технологий рекомбинантных ДНК и иммунологии. Такие способы полностью объяснены в литературе. Смотри, например, Fundamental Virology, 2^nd Edition, vol. I & II (B.N. Fields and D.M. Knipe, eds.); Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell eds., Blackwell Scientific Publications); T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993); A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., текущее издание); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2^nd Edition, 1989); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.).

Следует отметить, что применяемые в данном описании и прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа включают множественное число, если в содержании ясно не указано иначе. Таким образом, например, ссылка на антиген включает смесь двух и более антигенов и тому подобное.

В тексте применяются следующие сокращения аминокислот:

Аланин: Ala (A)	Аргинин: Arg (R)
Аспарагин: Asn (N)	Аспарагиновая кислота: Asp (D)
Цистеин: Cys (C)	Глютамин: Gln (Q)
Глутаминовая кислота: Glu (E)	Глицин: Gly (G)
Гистидин: His (H)	Изолейцин: Ile (I)
Лейцин: Leu (L)	Лизин: Lys (K)
Метионин: Met (M)	Фенилаланин: Phe (F)
Пролин: Pro (P)	Серин: Ser (S)
Треонин: Thr (T)	Триптофан: Trp (W)
Тирозин: Tyr (Y)	Валин: Val (V)

I. Определения

В описании настоящего изобретения будут применяться следующие термины, и они предназначаются для определения указанного ниже.

Термины «полипептид» и «белок» относятся к полимеру из аминокислотных остатков и не ограничиваются минимальной длиной продукта. Таким образом, пептиды, олигопептиды, димеры, мультимеры и тому подобное включаются в данное определение. Как полноразмерные белки, так и их фрагменты охватываются этим определением. Термины также включают постэкспрессионные модификации полипептида, например, гликозилирование, ацетилирование, фосфорилирование и тому подобное. Более того, в целях настоящего изобретения термин «полипептид» относится к белку, который включает модификации относительно природной последовательности, такие как делеции, вставки и замены (обычно консервативные по природе), до тех пор, пока белок сохраняет желаемую активность. Данные модификации могут быть направленными за счет сайт-направленного мутагенеза или могут быть случайными за счет мутации хозяев, которые продуцируют белки, или за счет ошибок, обусловленных амплификацией ПЦР.

Термином «полипептид E1» обозначают молекулу, происходящую из области E1 HCV. Зрелая область E1 HCV-1 начинается приблизительно с аминокислоты 192 полипротеина и продолжается до приблизительно аминокислоты 383, пронумерованных относительно полноразмерного полипротеина HCV-1 (смотри фигуры 1 и 2A-2C. Аминокислоты 192-383 фигур 2A-2C соответствуют положениям аминокислот 20-211 SEQ ID NO:4). Аминокислоты от около 173 до приблизительно 191 (аминокислоты 1-19 SEQ ID NO: 4) служат сигнальной последовательностью для E1. Таким образом, термином «полипептид E1» обозначают либо предшественник белка E1, включающий сигнальную последовательность, или зрелый белок E1, у которого отсутствует сигнальная последовательность, или даже полипептид E1 с гетерологичной сигнальной последовательностью. Полипептид E1 включает С-концевую последовательность для заякоревания в мембране, которая соответствует приблизительно положениям аминокислот 360-383 (смотри международную заявку № WO 95/04301, опубликованную 15 февраля 1996 г.). Полипептид E1, как здесь определяется, может включать для заякоревания или не включать С-концевую последовательность или ее часть.

Термином «полипептид E2» обозначают молекулу, происходящую из области E2 HCV. Зрелая область E2 HCV-1 начинается приблизительно с аминокислот 383-385, пронумерованных относительно полноразмерного полипротеина HCV-1 (смотри фигуры 1 и 2A-2C. Аминокислоты 383-385 фигур 2A-2C соответствуют положениям аминокислот 211-213 SEQ ID NO:4). Сигнальный пептид начинается приблизительно с аминокислоты 364 полипротеина. Таким образом, термином «полипептид E2» обозначают либо предшественник белка E2, включающий сигнальную последовательность, или зрелый белок E2, у которого отсутствует сигнальная последовательность, или даже полипептид E2 с гетерологичной сигнальной последовательностью. Полипептид E2 включает С-концевую последовательность для заякоревания в мембране, которая соответствует приблизительно положениям аминокислот 715-730, и может продолжаться до приблизительно аминокислотного остатка 746 (смотри Lin et al., J. Virol. (1994)68:5063-5073). Полипептид E2, как здесь определяется, может включать или не включать С-концевую последовательность для заякоревания или ее часть. Более того, полипептид E2 может также включать всю область p7 или ее часть, которая непосредственно прилегает к C-концу E2. Как показано на фигурах 1 и 2A-2C область p7 найдена в положениях 747-809, пронумерованных относительно полноразмерного полипротеина HCV-1 (положения аминокислот 575-637 SEQ ID NO:4). Кроме того, известно, что существует много видов E2 HCV (Spaete et al., Virol. (1992) 188:819-830; Selby et al., J. Virol. (1996) 70:5177-5182; Grakoui et al., J. Virol. (1993) 67:1385-1395; Tomei et al., J. Virol. (1993) 67:4017-4026). Соответственно в целях настоящего изобретения термин «E2» охватывает любой из данных видов E2, включая, без ограничения, виды, которые имеют делеции 1-20 или более аминокислот с N-конца E2, такие как делеции 1, 2, 3, 4, 5 ... 10 ... 15, 16, 17, 18, 19 ... и т.д. аминокислот. Такие виды E2 включают те, которые начинаются с аминокислоты 387, аминокислоты 402, аминокислоты 403 и т.д.

Типичные области E1 и E2 HCV-1 представлены на фигурах 2A-2C и SEQ ID NO:4. В целях настоящего изобретения области E1 и E2 определяют по отношению к номеру аминокислоты полипротеина, кодируемого геномом HCV-1, с первого метионина, обозначаемому как положение 1. Смотри, например, Choo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991) 88:2451-2455. Однако следует отметить, что применяемый здесь термин «полипептид E1» или «полипептид E2» не ограничивается последовательностью HCV-1. В этом отношении соответствующие области E1 или E2 в других изолятах HCV могут быть легко определены согласованием последовательностей изолятов таким образом, чтобы привести последовательности к максимальному согласованию. Это может быть осуществлено с помощью любого из ряда пакетов компьютерных программ, такого как ALIGN 1.0, имеющегося в распоряжении University of Virginia, Department of Biochemistry (Attn: Dr. William R. Pearson). Смотри Pearson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85:2444-2448.

Более того, термин «полипептид E1» или «полипептид E2», как здесь определено, не ограничен полипептидом, имеющим точную последовательность, изображенную на фигурах. Конечно, геном HCV находится в состоянии постоянного изменения in vivo и содержит несколько вариабельных доменов, которые проявляют относительно высокие степени вариабельности между изолятами. Ряд консервативных и вариабельных областей в данных штаммах известен и в целом аминокислотные последовательности эпитопов, происходящие из данных областей, должны иметь высокую степень гомологии последовательностей, например, гомологию аминокислотных последовательностей более 30%, предпочтительно более 40%, более 60% и даже более 80-90% гомологии, при выравнивании двух последовательностей. Вполне очевидно, что термины охватывают полипептиды E1 и E2 из любого из различных штаммов и изолятов HCV, включая изоляты, имеющие любой из 6 генотипов HCV, описанных Simmonds et al., J. Gen. Virol. (1993) 74:2391-2399 (например, штаммы 1, 2, 3, 4 и т.д.), также как вновь идентифицированные изоляты и подтипы данных изолятов, такие как HCV1a, HCV1b и т.д.

Таким образом, например, термин полипептид "E1" или "E2" относится к природным последовательностям E1 или E2 любого из различных штаммов HCV, а также к аналогам, мутеинам и иммуногенным фрагментам, как далее определено ниже. Полные генотипы многих из данных штаммов известны. Смотри, например, патент США № 6150087 и номера в GenBank №№ AJ238800 и AJ238799.

Кроме того, термины «полипептид E1» и «полипептид E2», охватывают белки, которые включают модификации по отношению к природной последовательности, такие как внутренние делеции, вставки и замены (обычно консервативные по природе). Данные модификации могут быть направленными за счет сайт-направленного мутагенеза или могут быть случайными за счет возникающих в природе случайных мутаций. Все данные модификации охватываются настоящим изобретением до тех пор, пока модифицированные полипептиды E1 и E2 действуют в плане предназначенной для них цели. Таким образом, например, если полипептиды E1 и/или E2 предназначены для применения в вакцинных композициях, модификации должны быть такими, чтобы иммунологическая активность (т.е. способность вызывать гуморальный или клеточный иммунный ответ на полипептид) не была потеряна.

Комплексом "E1E2" обозначают белок, содержащий, по меньшей мере, один полипептид E1 и, по меньшей мере, один полипептид E2, как описано выше. Такой комплекс может также включать всю или часть области p7, которая непосредственно прилегает к С-концу E2. Как показано на фигурах 1 и 2A-2C область p7 найдена в положениях 747-809, пронумерованных относительно полноразмерного полипротеина HCV-1 (положения аминокислот 575-637 SEQ ID NO:4). Типичный комплекс E1E2, который включает белок p7, обозначают здесь как "E1E2₈₀₉".

Способ ассоциации E1 и E2 в комплекс E1E2 несущественен. Полипептиды E1 и E2 могут ассоциироваться в результате нековалентных взаимодействий, таких как электростатические силы, или в результате образования ковалентных связей. Например, полипептиды E1E2 настоящей заявки могут быть в форме гибридного белка, который включает иммуногенный полипептид E1 и иммуногенный полипептид E2, как определено выше. Гибрид может быть экспрессирован с полинуклеотида, кодирующего химеру E1E2. Альтернативно, комплексы E1E2 могут образовываться спонтанно просто в результате смешивания белков E1 и E2, которые были получены индивидуально. Сходно, при коэкспрессии и секреции в среды белки E1 и E2 могут спонтанно образовывать комплекс. Таким образом, термин охватывает комплексы E1E2 (также называемые агрегатами), которые спонтанно образуются при очистке E1 и/или E2. Такие агрегаты могут включать один или более мономеров E1 в ассоциации с одним или более мономерами E2. Не требуется, чтобы количество присутствующих мономеров E1 и E2 было равным до тех пор, пока присутствуют, по меньшей мере, один мономер E1 и один мономер E2. Определение присутствия комплекса E1E2 легко осуществляется при применении стандартных способов определения белка, таких как электрофорез в полиакриламидном геле и иммунологические способы, такие как иммунопреципитация.

Термины «аналог» и «мутеин» относятся к биологически активным производным базовой молекулы или к фрагментам таких производных, которые сохраняют желаемую активность, такую как иммунореактивность в описанных здесь тестах. В целом термин «аналог» относится к соединениям, имеющим природную полипептидную последовательность и структуру с добавлениями, заменами (обычно консервативными по природе) и/или делециями одной или более аминокислот по отношению к природной молекуле, до тех пор, пока модификации не нарушают иммуногенной активности. Термин «мутеин» относится к пептидам, имеющим один или более пептидных миметиков («пептоидов»), таких как описанные в международной публикации № WO 91/04282. Предпочтительно, чтобы аналог или мутеин имели, по меньшей мере, такую же иммуноактивность, что и природная молекула. Способы создания полипептидных аналогов и мутеинов известны специалистам в данной области техники и описаны далее ниже.

Особенно предпочтительные аналоги включают замены, которые являются консервативными по природе, т.е. те замены, которые имеют место в пределах семейства аминокислот, которые сходны в отношении своих боковых цепей. Конкретно, аминокислоты обычно подразделяют на четыре семейства: (1) кислые - аспартат и глутамат; (2) основные - лизин, аргинин, гистидин; (3) неполярные - аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан; и (4) незаряженные полярные - глицин, аспарагин, глутамин, цистеин, серин, треонин, тирозин. Фенилаланин, триптофан и тирозин иногда относят к классу ароматических аминокислот. Например, есть основания предположить, что отдельная замена лейцина на изолейцин или валин, аспартата на глутамат, треонина на серин или сходная консервативная замена аминокислоты на структурно сходную аминокислоту не должна оказывать существенный эффект на биологическую активность. Например, интересующий полипептид может включать до приблизительно 5-10 консервативных или неконсервативных аминокислотных замен или даже до приблизительно 15-25 или 50 консервативных или неконсервативных аминокислотных замен, или любое целое число между 5-50 до тех пор, пока желаемая функция молекулы остается интактной. Специалист в данной области техники может легко определить области интересующей молекулы, которые легко позволяют сделать замену, при обращении к схемам Hopp/Woods и Kyte-Doolittle, которые хорошо известны в данной области техники.

Под «фрагментом» подразумевается полипептид, состоящий только из части интактной полноразмерной полипептидной последовательности и структуры. Фрагмент может включать С-концевую делецию и N-концевую делецию, и/или внутреннюю делецию природного полипептида. «Иммуногенный фрагмент» конкретного белка HCV обычно должен включать, по меньшей мере, приблизительно 5-10 смежных аминокислотных остатков полноразмерной молекулы, предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно 15-25 смежных аминокислотных остатков полноразмерной молекулы и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно 20-50 или более смежных аминокислотных остатков полноразмерной молекулы, которые определяют ее эпитоп, или любое целое число между 5 аминокислотами и полноразмерной последовательностью, предлагаемое так, чтобы рассматриваемый фрагмент сохранял способность проявлять иммунный ответ, как здесь определено. Для описания известных иммуногенных фрагментов E1 и E2 HCV смотри, например, Chien et al., международная публикация № WO 93/00365.

Применяемый здесь термин «эпитоп» относится к последовательности из, по меньшей мере, приблизительно от 3 до 5, предпочтительно приблизительно от 5 до 10 или 15, и не более чем приблизительно 500 аминокислот (или любое целое число между ними), которые определяют последовательность, которая сама или как часть более длинной последовательности, вызывает иммунный ответ у субъекта, которому она вводится. Часто эпитоп должен связываться с антителом, вырабатываемым в ответ на такую последовательность. Не существует верхнего критического лимита длины фрагмента, который может включать последовательность почти полноразмерного белка, или даже гибридный белок, включающий два или более эпитопов из полипротеина HCV. Эпитоп, используемый в целях изобретения, не ограничивается полипептидом, имеющим точную последовательность части родительского белка, из которого он произошел. Конечно, геномы вирусов находятся в состоянии постоянного изменения и содержат несколько вариабельных доменов, которые проявляют относительно высокие степени вариабельности между изолятами. Таким образом, термин «эпитоп» охватывает последовательности, идентичные природной последовательности, а также модификации природной последовательности, такие как делеции, добавки и замены (обычно консервативные по природе).

Области данного полипептида, которые включают эпитоп, могут быть идентифицированы с применением ряда способов картирования эпитопов, хорошо известных в данной области техники. Смотри, например, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, New Jersey. Например, линейные эпитопы могут быть определены, например, с помощью одновременного синтеза большого числа пептидов на твердых подложках, пептидов, соответствующих частям белковой молекулы, и взаимодействия пептидов с антителами, пока пептиды все еще привязаны к подложкам. Такие способы известны в данной области техники и описаны в, например, патенте США № 4708871; Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002; Geysen et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:178-182; Geysen et al. (1986) Molec. Immunol. 23:709-715. При применении таких способов был идентифицирован ряд эпитопов HCV. Смотри, например, Chien et al., Viral Hepatitis and Liver Disease (1994) pp. 320-324 и далее ниже. Сходно, конформационные эпитопы с легкостью идентифицируют путем определения пространственной конформации аминокислот таким способом, как, например, рентгеноструктурной кристаллографией и двумерным ядерным магнитным резонансом. Смотри, например, Epitope Mapping Protocols, выше. Антигенные области белков могут быть также идентифицированы с применением стандартной антигенности и кривых гидропатии, таких как рассчитанные с применением, например, компьютерной программы версии 1.0 Omiga, предлагаемой Oxford Molecular Group. В данной компьютерной программе применяется способ Hoop/Woods, Hopp et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA (1981) 78:3824-3828, для определения профилей антигенности и способ Kyte-Doolittle, Kyte et al., J. Mol. Biol. (1982) 157:105-132, для кривых гидропатии.

Применяемый здесь термин «конформационный эпитоп» относится к части полноразмерного белка или его аналога, или мутеина, имеющей структурные характеристики, нативные по отношению к аминокислотной последовательности, кодирующей эпитоп в пределах полноразмерного природного белка. Нативные структурные характеристики включают, но не ограничиваются этим, гликозилирование и трехмерную пространственную структуру. Длина последовательности, определяющей эпитоп, может широко варьироваться, так как данные эпитопы, как считается, образуются при трехмерной конфигурации антигена (например, укладки). Таким образом, аминокислоты, определяющие эпитоп, могут существовать в относительно небольшом количестве, но быть широко разбросанными по длине молекулы (или даже находиться в различных молекулах в случае димеров и т.д.), объединяясь в правильную эпитопную конформацию в результате укладки. Части антигена между остатками, определяющими эпитоп, могут не быть решающими для конформационной структуры эпитопа. Например, делеция или замена данных промежуточных последовательностей может не влиять на предлагаемый конформационный эпитоп, пока поддерживаются решающие для конформации эпитопа последовательности (например, цистеины, участвующие в образовании дисульфидной связи, сайты гликозилирования и т.д.).

Конформационные эпитопы легко идентифицируют, применяя способы, обсуждаемые выше. Более того, присутствие или отсутствие конформационного эпитопа в данном полипептиде может быть легко определено путем скрининга интересующего антигена в отношении взаимодействия с антителами (поликлональной сывороткой или моноклональной по отношению к конформационному эпитопу) и сравнения его взаимодействия с таковой денатурированного варианта антигена, в котором остаются только линейные эпитопы (если они есть). При таком скрининге с применением поликлональных антител может быть выгодно истощить поликлональную сыворотку сначала денатурированным антигеном и посмотреть остались ли антитела к интересующему антигену. Конформационные эпитопы, происходящие из областей E1 и E2, описаны, например, в международной публикации № WO 94/01778.

«Иммунный ответ» на антиген HCV или композицию представляет собой развитие у субъекта гуморального и/или клеточного иммунного ответа на молекулы, присутствующие в интересующей композиции. В целях настоящего изобретения «гуморальный иммунный ответ» обозначает иммунный ответ, опосредуемый молекулами антител, в то время как «клеточный иммунный ответ» представляет собой ответ, опосредованный Т-лимфоцитами и/или другими белыми клетками крови. Один важный аспект клеточного иммунитета включает антиген-специфический ответ цитолитических Т-клеток ("CTL"). CTL характеризуются специфичностью в отношении пептидных антигенов, которые презентируются в связи с белками, кодируемыми главным комплексом гистосовместимости (MHC) и экспрессируемыми на поверхности клеток. CTL помогают индуцировать и усиливать внутриклеточное разрушение внутриклеточных микробов или лизис клеток, инфицированных такими микробами. Другой аспект клеточного иммунитета включает антиген-специфический ответ хелперных Т-клеток. Хелперные Т-клетки действуют, помогая стимулировать функцию и сфокусировать активность неспецифических эффекторных клеток против клеток, представляющих на своей поверхности антигены пептида в комплексе с молекулами MHC. «Клеточный иммунный ответ» также относится к продукции цитокинов, хемокинов и других таких молекул, продуцируемых активированными Т-клетками и/или другими белыми клетками крови, включая происходящие от CD4+ и CD8+ T-клеток. Ком