Новые изоформы ингибитора роста васкулярных эндотелиальных клеток

Новые изоформы ингибитора роста васкулярных эндотелиальных клеток

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Данная заявка претендует на приоритет предварительной патентной заявки США с регистрационным номером 60/331190, поданной 9 ноября 2001 г. Эта приоритетная заявка включена тем самым в настоящее описание путем отсылки в ее полном виде.

Данное изобретение было сделано при поддержке правительства США по гранту Министерства обороны DAMD17-98-1-8093, гранту Национального Института Здравоохранения NHLBI RО1 HL60660 и гранту Национального Института Рака СА58185-08. Правительство имеет определенные права на данное изобретение.

Область техники, к которой относится изобретение

Данное изобретение относится к композициям, которые применимы в лечении состояний, в которых выгодно, чтобы ангиогенез был ингибированным, например в лечении солидных опухолей, диабетической ретинопатии, саркомы Капоши, псориаза и ревматоидного артрита. В частности, данное изобретение относится к новым изоформам ингибитора роста васкулярных эндотелиальных клеток (VEGI), их ДНК и ассоциированным белковым последовательностям, их композициям и вариантам и их применению в лечении движимых ангиогенезом заболеваний.

Уровень техники

При нормальных физиологических условиях люди и животные подвергаются ангиогенезу, возникновению новых кровеносных сосудов в ткани или органе, в очень специфических ограниченных ситуациях. Например, ангиогенез обычно наблюдается при заживлении ран, при эмбриональном развитии и при образовании желтого тела, эндометрия и плаценты. Термин "эндотелий" обозначает тонкий слой плоских эпителиальных клеток, которые выстилают серозные полости, лимфатические сосуды и кровеносные сосуды. Термин "антиангиогенная" или "ингибирующая ангиогенез активность" обозначает способность молекулы ингибировать ангиогенез вообще.

Считается, что как контролируемый, так и неконтролируемый ангиогенез происходит сходным образом. Эндотелиальные клетки активно участвуют в воспалении, клеточной адгезии, свертывании, тромбозе, фибринолизе и ангиогенезе. Эндотелиальные клетки и перициты (периваскулярные клетки), окруженные базальной мембраной, образуют капиллярные кровеносные сосуды. Ангиогенез начинается с эрозии базальной мембраны ферментами, высвобождаемыми эндотелиальными клетками и лейкоцитами. Затем эндотелиальные клетки, которые выстилают просвет кровеносных сосудов, выпячиваются через базальную мембрану. Стимуляторы ангиогенеза индуцируют эндотелиальные клетки к миграции через эрозированную базальную мембрану. Мигрирующие клетки образуют "росток" из исходного кровеносного сосуда, где эндотелиальные клетки подвергаются митозу и пролиферируют. Эндотелиальные ростки сливаются друг с другом с образованием капиллярных петель, создающих новый кровеносный сосуд.

Стойкий нерегулируемый ангиогенез происходит при многих патологических состояниях, метастазировании опухолей и отклоняющемся от нормы росте эндотелиальных клеток и поддерживает патологическое повреждение, наблюдаемое в этих условиях. Разнообразные патологические состояния, при которых присутствует нерегулируемый ангиогенез, были объединены вместе как ангиогенез-зависимые или ангиогенез-ассоциированные заболевания.

Во время роста опухоли эндотелиальные клетки пролиферируют, инвазируют строму, мигрируют в направлении источника ангиогенных стимулов, такого как раковые клетки, взаимодействуют с периваскулярными клетками и стромальными клетками и, в конце концов, образуют капиллярные сосуды, связывающие ткань опухоли с кровотоком (J.Folkman (1995) Nat.Med. 1:27-31). Хотя механизм несомненно высокой сложности, который регулирует ангиогенез, является все еще невыясненным, становится ясно, что инициация или терминация этого процесса является результатом баланса между положительными и отрицательными регуляторами ангиогенеза. Ряд ангиогенных факторов, зачастую испытывающих выраженную повышающую регуляцию в тканях опухолей, был описан, в том числе несколько членов семейства факторов роста фибробластов, таких как FGF-I (G.Gimenez-Gallego et al. (1985) Science 230:1385), FGF-2 (L.Schweigerer et al. (1987) Nature 325:257), и членов семейства факторов роста васкулярных эндотелиальных клеток (VEGF) (D.W.Leung et al. (1989) Science 246:1390), а также рецепторов этих факторов роста (L.W.Burros and В.В.Olwin (1989) J.Biol.Chem. 264:18647; S.Wemistrom et al. (1991) Growth Factors 4:197; В.Tennan et al. (1992) Biochem. Biopys. Res. Comm. 187:1579). С.de Vries et al. (1992) Science 255:989). Недавно было обнаружено, что два новых белковых фактора, пролиферин и родственный пролиферину белок, участвуют в регуляции инициации и прекращения неоваскуляризации в плаценте мыши (Jackson D, et al. Science 266, 1581-4, 1994). Все документы, цитируемые здесь supra и infra, специально включены в описание путем отсылки в их полном виде.

Сообщалось также о нескольких ингибиторах ангиогенеза, в том числе тромбоспондине (D.J.Good et al. (1990) Proc. Natl.Acad.Sci. USA 87:6624), ангиостатине (M.S.O'Reilly et al. (1994) Cell 79:315), эндостатине (M.S.O'Reilly et al. (1997) Cell 88:277) и факторе-4 тромбоцитов (Е.Maione et al. (1997) Science 247:77). Очевидно, что нормальный ангиогенез быстро активируется при необходимости и быстро терминируется, когда он больше не требуется, тогда как патологический ангиогенез, начавшись, часто продолжается, и его трудно остановить. Это указывает на то, что механизм отрицательной регуляции, функционирующий в процессе нормального ангиогенеза, отсутствует или является подавленным в процессе патологического ангиогенеза. Было высказано предположение, что протеолитические активности, которые высвобождают ингибиторы ангиогенеза из ряда предшественников, могут быть частично ответственными за понижающую регуляцию ангиогенеза, как показывает протеолитическая активация ангиостатина из плазминогена и протеолитическая активация эндостатина из коллагена XVIII (M.S.O'Reilly (1997) Cell 88:277). Многие известные регуляторы ангиогенеза являются плейотропными и могут действовать на другие типы клеток, а также на клетку, которая продуцирует эти регуляторы, хотя возможно, что эндотелиальные клетки могут продуцировать аутокринные факторы для супрессии процесса ангиогенеза или поддержания состояния покоя зрелой сосудистой сети. Таким образом, целью данной заявки является описание новых аутокринных отрицательных регуляторов ангиогенеза класса, называемого ингибиторами роста васкулярных эндотелиальных клеток (VEGI), которые специфически экспрессируются эндотелиальными клетками.

Опубликованная заявка РСТ WO 99/23105 описывает белок VEGI (VEGI-₁₇₄) и сплайсинговый вариант VEGI-₂₅₁ и их соответствующие нуклеотидные последовательности, раскрытие которой специально включено тем самым в данную заявку путем отсылки в полном виде. Была описана антиангиогенная активность укороченных с N-конца форм VEGI-₁₇₄. Белок VEGI-₁₇₄ обнаруживал 20-30% гомологию последовательности с TNFα, TNFβ и Fas-лигандом. Белок с молекулярной массой 22 кДа образовывался в эксперименте с транскрипцией и трансляцией in vitro с использованием кДНК-клона в качестве матрицы, что согласуется с предсказанной открытой рамкой считывания из 174 аминокислот. Здесь этот белок называется VEGI-₁₇₄. Анализ гидрофобности этого белка позволил предсказать гидрофобный район из 12 аминокислот непосредственно после N-концевого сегмента из 14 негидрофобных аминокислот. Это согласовалось со структурой трансмембранного белка типа II, сходного с TNF (В.В.Aggarwal and К.Natarajan (1996) Eur. Cytokine News. 7:93). Была также описана изоформа VEGI. Этот белок называется здесь VEGI-₂₅₁, который, как предсказано, является мембранным белком.

Недавний Нозерн-анализ препаратов тотальной РНК из 22 различных типов культивируемых клеток различных линий дифференцировки показал, что транскрипты для этого белка могут быть детектированы только в двух линиях эндотелиальных клеток: в клетках HUVE и венозных эндотелиальных клетках человека раннего пассажа. мРНК не детектировалась в венозных эндотелиальных клетках более позднего пассажа и не обнаруживалась в артериальных клетках человека. В резком противоречии с этим, члены семейства TNF экспрессируются, в основном, в иммунных клетках (В.В.Aggarwal and К.Natarajan (1996) (supra). Например, TNFα продуцируется макрофагами, моноцитами, нейтрофилами и Т-клетками, тогда как TNFβ преимущественно продуцируется стимулированными митогеном Т-лимфоцитами и лейкоцитами. Подобным образом, лиганды для Fas и других членов семейства TNF, CD27, CD30, CD40, OХ40 и 4-1 ВВ все экспрессируются в типах клеток иммунной системы. С использованием Нозерн-блотов множества тканей было обнаружено, что транскрипт EGI экспрессируется в плаценте, легком, почке, скелетной мышце, головном мозгу, печени, тимусе, яичке, яичнике и лимфоцитах периферической крови.

Ингибирование ангиогенеза в опухоли является важным подходом для лечения рака, такого как рак молочной железы и другие солидные опухоли. Прежде всего, рост и метастазирование опухоли зависят от ангиогенеза. В модельной системе было показано, что блокирование капилляров новообразованной сосудистой сети специфически индуцированным свертыванием вызывает ликвидацию сосудистой сети опухоли и приводит к подавлению опухолей. Кроме того, было сделано предположение, что эндотелиальные клетки являются высокопролиферативными в тканях опухоли, но большей частью покоящимися в нормальных тканях. Это делает новообразованную сосудистую сеть опухоли специфической и привлекательной мишенью. Кроме того, хотя свойства раковых клеток могут в значительной степени варьировать в различных опухолях, популяция эндотелиальных клеток в большинстве солидных опухолей является, по всей вероятности, нетрансформированной и, следовательно, остается гомогенной. Это относится как к человеку, так и животным. Таким образом, возможно, что может быть разработан антиангиогенный терапевтический агент, который может быть применен универсально для лечения многочисленных различных раков.

Кроме солидных опухолей, другие важные движимые ангиогенезом заболевания включают в себя диабетическую ретинопатию, саркому Калоши, псориаз, ревматоидный артрит. Пациенты, которые страдают от этих заболеваний, могут получить пользу от антиангиогенного терапевтического подхода.

Данное изобретение идентифицирует и описывает последовательности, функции, композиции и терапевтическое применение новых изоформ членов семейства белков VEGI. Две новые изоформы, названные соответственно VEGI-_192a и VEGI-_192b, содержат новую N-концевую последовательность, которая существенно изменяет свойства этого белка, касающиеся его экспрессии, секреции и антиангиогенных свойств.

Описаны две новые изоформы VEGI, названные VEGI-_192a и VEGI-_192b, состоящие обе из 192 аминокислотных остатков. Обе изоформы обнаруживают специфическую для эндотелиальных клеток экспрессию и имеют общий С-концевой сегмент из 151 остатка с ранее описанными VEGI-₁₇₄ и VEGI-₂₅₁. Эти изоформы образуются из гена размером 17 т.п.н. человека альтернативным сплайсингом. VEGI-₂₅₁, наиболее обильная изоформа, содержит предположительный сигнал секреции. Белок VEGI детектируется в кондиционированных средах эндотелиальных клеток, сыворотках человека и трансфицированных VEGI-₂₅₁ клетках млекопитающих. Распределение субклеточной локализации VEGI-₂₅₁ предполагает, что он является секреторным белком. Сверхэкспрессия VEGI-₂₅₁ в эндотелиальных клетках вызывает зависимую от дозы смерть клеток. VEGI-₂₅₁-трансфицированные раковые клетки дают начало опухолям ксенотрансплантатов с уменьшенной скоростью роста и уменьшенной плотностью микрососудов в сравнении с опухолями VEGI-₁₇₄-трансфектантов. Данное изобретение обосновывает точку зрения, что секретируемый эндотелиальными клетками VEGI может функционировать в качестве аутокринного ингибитора ангиогенеза и природно существующего модулятора васкулярного гомеостаза.

Все цитируемые здесь публикации включены тем самым в описание путем отсылки в их полном виде.

Раскрытие изобретения

Данное изобретение относится к ингибиторам пролиферации эндотелиальных клеток вообще и к ингибиторам ангиогенеза, в частности, и к способам их применения. Полные нуклеотидные последовательности VEGI-_192a, VEGI-_192b и VEGI-₂₅₁ показаны в таблице 1 (SEQ ID NO:1), таблице 2 (SEQ ID NO:2) и таблице 3 (SEQ ID NO:3), a предсказанные аминокислотные последовательности показаны в таблице 4 (SEQ ID NO:4), таблице 5 (SEQ ID NO:5) и таблице 6 (SEQ ID NO:6) соответственно.

Таким образом, в одном воплощении данное изобретение обеспечивает изолированный полинуклеотид, который содержит последовательность, показанную в таблице 1 (SEQ ID NO:1), или ее комплемент. Данное изобретение обеспечивает также изолированный полинуклеотид, который содержит, по меньшей мере, 10, по меньшей мере, 15, по меньшей мере, 18, по меньшей мере, 20, по меньшей мере, 25, по меньшей мере, 30, по меньшей мере, 50 и, по меньшей мере, 100 или более смежных нуклеотидов SEQ ID NO:1, где эти смежные нуклеотиды находятся в пределах нуклеотидов 1-93 SEQ ID NO:1. Данное изобретение обеспечивает также изолированный полинуклеотид, который содержит, по меньшей мере, 10, по меньшей мере, 15, по меньшей мере, 18, по меньшей мере, 20, по меньшей мере, 25, по меньшей мере, 30, по меньшей мере, 50 и, по меньшей мере, 100 или более смежных нуклеотидов SEQ ID NO:1, где эти смежные нуклеотиды включают нуклеотиды 93 и 94 SEQ ID NO:1.

В других воплощениях данное изобретение обеспечивает изолированный полинуклеотид, который содержит последовательность, показанную в таблице 2 (SEQ ID NO:2), или ее комплемент. Данное изобретение обеспечивает также изолированный полинуклеотид, который содержит, по меньшей мере, 10, по меньшей мере, 15, по меньшей мере, 18, по меньшей мере, 20, по меньшей мере, 25, по меньшей мере, 30, по меньшей мере, 50 и, по меньшей мере, 100 или более смежных нуклеотидов SEQ ID NO:2, где эти смежные нуклеотиды находятся в пределах нуклеотидов 1-386 SEQ ID NO:2. Данное изобретение обеспечивает также изолированный полинуклеотид, который содержит, по меньшей мере, 10, по меньшей мере, 15, по меньшей мере, 18, по меньшей мере, 20, по меньшей мере, 25, по меньшей мере, 30, по меньшей мере, 50 и, по меньшей мере, 100 или более смежных нуклеотидов SEQ ID NO:2, где эти смежные нуклеотиды включают нуклеотиды 386 и 387 SEQ ID NO:2.

В некоторых воплощениях данное изобретение обеспечивает изолированный полинуклеотид, который содержит последовательность, кодирующую полипептид SEQ ID NO:4. Данное изобретение обеспечивает также изолированный полинуклеотид, который содержит полинуклеотид, кодирующий, по меньшей мере, 5, по меньшей мере, 10, по меньшей мере, 15, по меньшей мере, 20, по меньшей мере, 25 или более смежных аминокислот SEQ ID NO:4, где эти смежные аминокислоты находятся в пределах аминокислот 1-26 SEQ ID NO:4. Данное изобретение обеспечивает также изолированный полинуклеотид, который содержит полинуклеотид, кодирующий, по меньшей мере, 5, по меньшей мере, 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере, 20, по меньшей мере, 25 или более смежных аминокислот SEQ ID NO:4, где эти смежные аминокислоты включают аминокислоты 26 и 27 SEQ ID NO:4. В некоторых воплощениях эти смежные аминокислоты являются аминокислотами приблизительно 5-192, 10-192, 15-192, 20-192 или 25-192 последовательности, показанной в таблице 4 (SEQ ID NO:4).

В некоторых воплощениях данное изобретение обеспечивает изолированный полинуклеотид, который содержит последовательность, кодирующую полипептид SEQ ID NO:5. Данное изобретение обеспечивает также изолированный полинуклеотид, который содержит полинуклеотид, кодирующий, по меньшей мере, 5, по меньшей мере, 10, по меньшей мере, 15, по меньшей мере, 20, по меньшей мере, 25 или более смежных аминокислот SEQ ID NO:5, где эти смежные аминокислоты находятся в пределах аминокислот 1-26 SEQ ID NO:5. Данное изобретение обеспечивает также изолированный полинуклеотид, который содержит полинуклеотид, кодирующий, по меньшей мере, 5, по меньшей мере, 10, по меньшей мере, 15, по меньшей мере, 20, по меньшей мере, 25 или более смежных аминокислот SEQ ID NO:5, где эти смежные аминокислоты включают аминокислоты 26 и 27 SEQ ID NO:5. В некоторых воплощениях эти смежные аминокислоты являются аминокислотами приблизительно 5-192, 10-192, 15-192, 20-192 или 25-192 последовательности, показанной в таблице 5 (SEQ ID NO:5).

В некоторых воплощениях полинуклеотид данного изобретения обеспечивает последовательность, кодирующую функционально-сохранные варианты последовательностей нуклеиновых кислот, описанных здесь, которые включают в себя замены, добавления и/или делеции нуклеиновых кислот. Варианты включают в себя природно встречающиеся варианты этой полинуклеотидной последовательности (например, вырожденные варианты, аллельные варианты и т.д.).

В некоторых воплощениях данное изобретение обеспечивает изолированный полинуклеотид, имеющий, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 88%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 92%, по меньшей мере, 94%, по меньшей мере, 96%, по меньшей мере, 98% или, по меньшей мере, 99% идентичность последовательности с полинуклеотидами данного изобретения, описанными здесь. Одно воплощение обеспечивает изолированный полинуклеотид, имеющий, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 88%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 92%, по меньшей мере, 94%, по меньшей мере, 96%, по меньшей мере, 98% или, по меньшей мере, 99% идентичность последовательности с последовательностью нуклеотидов 1-93, показанной в таблице 1 (SEQ ID NO:1), или нуклеотидов 1-386, показанной в таблице 2 (SEQ ID NO:2).

В некоторых воплощениях полинуклеотиды данного изобретения дополнительно содержат детектируемую метку. В некоторых воплощениях полинуклеотид данного изобретения иммобилизован на поверхности. В некоторых воплощениях данного изобретения полинуклеотид данного изобретения является одноцепочечным. В некоторых воплощениях данного изобретения полинуклеотид данного изобретения выбран из группы, состоящей из ДНК и РНК. В некоторых воплощениях данного изобретения полинуклеотид данного изобретения получают частично химическим синтезом.

Понятно, что (если обратное не указано или не требуется) любое описанное здесь воплощение данного изобретения, которое представлено, является полинуклеотидом, включает в себя как двухцепочечную форму, так и каждую из двух комплементарных одноцепочечных форм, которые, как это известно или предсказано, образуют эту двухцепочечную форму.

Понятно также, что данное изобретение обеспечивает воплощения, "состоящие из" или "состоящие, по существу, из" полинуклеотида, полипептидов и/или антител, описанных здесь.

В другом аспекте данное изобретение обеспечивает векторы и экспрессирующие векторы, содержащие любые из описанных здесь полинуклеотидов.

В других аспектах данное изобретение обеспечивает клетку-хозяина, содержащую любой из полинуклеотидов или векторов, описанных здесь. В некоторых воплощениях эта клетка-хозяин является прокариотической, такой как Е.coli. В некоторых вариантах клетка-хозяин является эукариотической, такой как клетки яичника китайского хомячка (СНО).

Данное изобретение включает в себя также клетки, содержащие рекомбинантные полинуклеотиды, которые содержат полинуклеотид VEGI-_192a или VEGI-_192b или варианты полинуклеотида VEGI-_192a или VEGI-_192b. В одном воплощении данное изобретение обеспечивает генетически сконструированную клетку млекопитающего или бактериальнную клетку, такую как Е.coli, содержащую рекомбинантно модифицированный полинуклеотид VEGI-_192a или VEGI-_192b, так что этот полинуклеотид сверхэкспрессируется. В другом воплощении данное изобретение обеспечивает клетки, содержащие вариант полинуклеотида VEGI-_192a или VEGI-_192b. В другом воплощении полинуклеотид VEGI-_192a или VEGI-_192b функционально связан с индуцибельным промотором. В других воплощениях генетически сконструированные клетки имеют вариантный ген VEGI-_192a или VEGI-_192b вместо природного гена VEGI-_192a или VEGI-_192b.

Данное изобретение обеспечивает также полипептиды VEGI-_192a. Таким образом, данное изобретение обеспечивает изолированный полипептид, содержащий последовательность SEQ ID NO:4. Данное изобретение обеспечивает также изолированный полипептид, содержащий полипептид, кодируемый любым из полинуклеотидов данного изобретения, описанных здесь. В других воплощениях данное изобретение обеспечивает также изолированный полипептид, который содержит, по меньшей мере, 5, по меньшей мере, 10, по меньшей мере, 15, по меньшей мере, 20, по меньшей мере, 25 или более смежных аминокислот последовательности, изображенной в таблице 4 (SEQ ID NO:4), где эти смежные аминокислоты находятся в пределах аминокислот 1-26 последовательности, изображенной в таблице 4 (SEQ ID NO:4). В других воплощениях данное изобретение обеспечивает также выделенный полипептид, который содержит, по меньшей мере, 5, по меньшей мере, 10, по меньшей мере, 15, по меньшей мере, 20, по меньшей мере, 25 или более смежных аминокислот последовательности, изображенной в таблице 4 (SEQ ID NO:4), где эти смежные аминокислоты включают аминокислоты 26 и 27 SEQ ID NO:4. В некоторых воплощениях эти смежные аминокислоты являются аминокислотами приблизительно 5-192, 10-192, 15-192, 20-192, 25-192 SEQ ID NO:4.

Данное изобретение обеспечивает также полипептиды VEGI-_192b. Таким образом, данное изобретение обеспечивает изолированный полипептид, содержащий последовательность SEQ ID NO:5. Данное изобретение обеспечивает также изолированный полипептид, содержащий полипептид, кодируемый любым из полинуклеотидов данного изобретения, описанных здесь. В других воплощениях данное изобретение обеспечивает также изолированный полипептид, который содержит, по меньшей мере, 5, по меньшей мере, 10, по меньшей мере, 15, по меньшей мере, 20, по меньшей мере, 25 или более смежных аминокислот последовательности, изображенной в таблице 5 (SEQ ID NO:5), где эти смежные аминокислоты находятся в пределах аминокислот 1-26 последовательности, изображенной в таблице 5 (SEQ ID NO:5). В других воплощениях данное изобретение обеспечивает также изолированный полипептид, который содержит, по меньшей мере, приблизительно 5, по меньшей мере, 10, по меньшей мере, 15, по меньшей мере, 20, по меньшей мере, 25 или более смежных аминокислот последовательности, изображенной в таблице 5 (SEQ ID NO:5), где эти смежные аминокислоты включают аминокислоты 26 и 27 SEQ ID NO:5. В некоторых воплощениях эти смежные аминокислоты являются аминокислотами приблизительно 5-192, 10-192, 15-192, 20-192, 25-192 SEQ ID NO:5.

В других воплощениях данное изобретение обеспечивает любой описанный здесь полипептид, где этот полипептид включает в себя эпитоп. В других воплощениях данное изобретение обеспечивает любой описанный здесь полипептид, где этот полипептид иммобилизован на твердой подложке.

В других воплощениях данное изобретение обеспечивает полипептиды, которые сохраняют биологическую активность VEGI-_192a, и/или VEGI-_192b, и/или VEGI-₂₅₁. Как показано в примерах, VEGI-_192a ингибирует рост васкулярных эндотелиальных клеток; и VEGI-₂₅₁, будучи экспрессирован, ингибирует рост васкулярных эндотелиальных клеток, образование капилляроподобных трубочек в модели ангиогенеза in vitro и также ингибирует рост опухолей ксенотрансплантатов в бестимусных голых мышах.

Данное изобретение обеспечивает также антитела, которые селективно связывают VEGI-_192a и/или VEGI-_192b. Таким образом, данное изобретение обеспечивает антитело, которое селективно связывается с любым из полипептидов VEGI-_192a и/или VEGI-_192b, описанных здесь. В одном воплощении антитело способно связываться селективно с VEGI-_192a или VEGI-_192b. В другом воплощении это антитело способно селективно связываться как с VEGI-_192a, так и с VEGI-_192b, но не с другими изоформами VEGI. В некоторых воплощениях антитело связывается с полипептидом, кодируемым любым из описанных здесь полинуклеотидов. В одном воплощении данное изобретение обеспечивает антитело, способное связываться с полипептидом данного изобретения. В другом воплощении антитело способно селективно связываться с полипептидом, содержащим (а) последовательность, показанную в таблице 4 (SEQ ID NO:4) и/или таблице 5 (SEQ ID NO:5); или (b) по меньшей мере, 10 смежных аминокислот SEQ ID NO:4 и/или SEQ ID NO:5, где эти смежные аминокислоты находятся в пределах аминокислот 1-26, показанных в таблице 4 (SEQ ID NO:4) и/или в таблице 5 (SEQ ID NO:5). Данное изобретение обеспечивает также антитело, которое способно связываться с участком полипептида, показанного в таблице 4 (SEQ ID NO:4) и/или в таблице 5 (SEQ ID NO:5), где указанный участок представляет собой, по меньшей мере, приблизительно 5, по меньшей мере, 10, по меньшей мере, 15, по меньшей мере, 20, по меньшей мере, 25 или более смежных аминокислот SEQ ID NO:4 и/или SEQ ID NO:5, и указанный участок содержит аминокислоты 26 и 27 SEQ ID NO:4 и/или SEQ ID NO:5.

В некоторых воплощениях антитело является поликлональным антителом. В других воплощениях антитело является моноклональным антителом. В других воплощениях антитело иммобилизовано на твердой подложке. В других воплощениях антитело дополнительно содержит детектируемую метку.

Данное изобретение обеспечивает также композиции, в том числе фармацевтические композиции, содержащие полинуклеотиды, полипептиды, антитела, рекомбинантные векторы и клетки-хозяева данного изобретения. В некоторых воплощениях данное изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию, содержащую полипептид SEQ ID NO:4 или его фрагмент, где этот фрагмент содержит аминокислоты 26 и 27, в фармацевтически приемлемом носителе.

Данное изобретение обеспечивает также ингибитор ангиогенеза, где этот ингибитор содержит полинуклеотиды, полипептиды или производные VEGI-_192a, VEGI-_192b или VEGI-₂₅₁ в фармацевтически приемлемом носителе, в фармацевтически приемлемом количестве.

В другом воплощении данное изобретение обеспечивает композицию репрессора или ингибитора роста рака, содержащую, по существу, очищенные полинуклеотиды или полипептиды изоформ VEGI (т.е. VEGI-_192a; VEGI-_192b или VEGI-₂₅₁) данного изобретения.

В другом воплощении данное изобретение обеспечивает ускоритель ангиогенеза, содержащий антитело, антисмысловой олигонуклеотид, антагонист, рибозим, лекарственное средство или агент, который уменьшает или элиминирует функцию VEGI-_192a, VEGI-_192b или VEGI-₂₅₁ при доставке в фармацевтически приемлемом носителе, в фармацевтически приемлемом количестве.

Данное изобретение обеспечивает также наборы, массивы, содержащие любой из полинуклеотидов, полипептидов и антител, описанных здесь. В одном воплощении данное изобретение обеспечивает наборы или массивы для оценки количества полинуклеотида в образце, содержащие любой из описанных здесь полинуклеотидов. В другом воплощении данное изобретение обеспечивает наборы или массивы для оценки уровня полипептида в образце, содержащие любое из антител, описанных здесь.

В другом воплощении данное изобретение обеспечивает способ ингибирования ангиогенеза, предусматривающий введение индивидууму (такому как человек или животное) композиции, содержащей, по существу, очищенные полинуклеотид, полипептиды VEGI-_192a, VEGI-_192b или VEGI-₂₅₁ данного изобретения или модифицированную форму этих раскрытых изоформ VEGI, описанных здесь, в дозе, достаточной для ингибирования ангиогенеза. В одном воплощении данная композиция содержит вектор доставки гена, содержащий полинуклеотид, показанный в таблице 3 (SEQ ID NO:3), или полинуклеотид, кодирующий полипептид SEQ ID NO:6. В некоторых воплощениях этот полинуклеотид функционально связан с регуляторной последовательностью, которая управляет экспрессией гена. В другом воплощении композиция содержит, по существу, очищенный полипептид VEGI-_192a с последовательностью, показанной в таблице 4 (SEQ ID NO:4), или функциональный фрагмент, где этот фрагмент включает аминокислоты 26 и 27 SEQ ID NO:4 или включает, по меньшей мере, одну аминокислоту из аминокислот 1-26 SEQ ID NO:4.

В другом воплощении данное изобретение обеспечивает способ лечения или облегчения заболевания и процессов, которые опосредованы неконтролируемым ангиогенезом, предусматривающий стадию введения индивидууму композиции, содержащей полинуклеотид, полипептиды VEGI-_192a, VEGI-_192b или VEGI-₂₅₁, или модифицированную форму этих раскрытых изоформ VEGI, описанных здесь, в дозе, достаточной для контроля ангиогенеза. В одном воплощении эта композиция содержит вектор для доставки генов, содержащий полинуклеотид, показанный в таблице 3 (SEQ ID NO:3), или полинуклеотид, кодирующий полипептид SEQ ID NO:6. В некоторых воплощениях этот полинуклеотид функционально связан с регуляторной последовательностью, которая управляет экспрессией гена. В другом воплощении эта композиция содержит, по существу, очищенный полипептид VEGI-_192a с последовательностью, показанной в таблице 4 (SEQ ID NO:4), или функциональный фрагмент, где этот фрагмент включает аминокислоты 26 и 27 SEQ ID NO:4 или включает, по меньшей мере, одну аминокислоту из аминокислот 1-26 SEQ ID NO:4.

В другом воплощении данное изобретение обеспечивает способ лечения рака или подавление роста опухоли, предусматривающий введение индивидууму композиции, содержащей полинуклеотид, полипептиды VEGI-_192a; VEGI-_192b, или VEGI-₂₅₁, или модифицированную форму этих раскрытых изоформ VEGI, описанных здесь, в дозе, достаточной для подавления роста опухоли. В одном воплощении эта композиция содержит вектор для доставки генов, содержащий полинуклеотид, показанный в таблице 3 (SEQ ID NO:3), или полинуклеотид, кодирующий полипептид SEQ ID NO:6. В некоторых воплощениях этот полинуклеотид функционально связан с регуляторной последовательностью, которая управляет экспрессией гена. В другом воплощении эта композиция содержит, по существу, очищенный полипептид VEGI-_192a с последовательностью, показанной в таблице 4 (SEQ ID NO:4), или функциональный фрагмент, где этот фрагмент включает аминокислоты 26 и 27 SEQ ID NO:4 или включает, по меньшей мере, одну аминокислоту из аминокислот 1-26 SEQ ID NO:4.

В другом воплощении данное изобретение обеспечивает способ ускорения ангиогенеза, предусматривающий введение человеку или животному композиции, содержащей антитело, антисмысловой олигонуклеотид, антагонист, рибозим, лекарственное средство или агент, который снижает или элиминирует активность VEGI-_192a, VEGI-_192b и/или VEGI-₂₅₁.

Еще в одном воплощении данное изобретение обеспечивает терапевтический способ и композицию для лечения или облегчения заболеваний или процессов, которые опосредованы ангиогенезом, в том числе, но не ограничиваясь, гемангиомы, солидных опухолей, лейкоза, метастазирования, телеангиэктазии, псориаза, склеродермии, пиогенной гранулемы, ангиогенеза миокарда, plagie неоваскуляризации, коронарных коллатералей, ангиогенеза ишемических конечностей, заболеваний роговицы, покраснения кожи, неоваскулярной глаукомы, диабетической ретинопатии, ретролентальной фиброплазии, артрита, диабетической неоваскуляризации, увеита, ретинопатии недоношенности, дегенерации желтого пятна, неоваскуляризации роговичного трансплантата, реакции трансплантат против хозяина, воспалительного заболевания кишечника, миелосупрессии и рестеноза; где ангиогенез является неконтролируемым или избыточным и требует ингибирования, причем данный способ предусматривает предоставление индивидууму, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества полинуклеотидов или полипептидов изоформ VEGI (т.е. VEGI-_192a, VEGI-_192b или VEGI-₂₅₁) данного изобретения, так что ангиогенез ингибируется.

Еще в одном воплощении данное изобретение обеспечивает терапевтический способ и композицию для лечения или ослабления заболеваний, таких как дегенерация желтого пятна, плохое заживление ран, пептическая язва, переломы, келоиды, образование и развитие сосудов (васкулогенез), гемопоэз, овуляция, менструация и образование плаценты, в которых ангиогенез является желательным, причем данный способ предусматривает введение индивидууму, нуждающемуся в таком лечении, антагониста полинуклеотидов или полипептидов изоформ VEGI (т.е. VEGI-_192a, VEGI-_192b или VEGI-₂₅₁) данного изобретения; антисмысловых олигонуклеотидов, специфичных к полинуклеотидам изоформ VEGI или анти-VEGI-антител, агентов или лекарственных средств, которые снижают или элиминируют функцию VEGI, в фармацевтически приемлемом носителе, в фармацевтически приемлемом количестве.

В другом воплощении данное изобретение обеспечивает способ обнаружения полипептида изоформы VEGI (VEGI-_192a или VEGI-_192b), предусматривающий контактирование пробы из индивидуума с антителом, описанным здесь, которое селективно связывается с полипептидом VEGI данного изобретения, и детектирование присутствия или отсутствия комплекса, образованного между полипептидом в пробе и этим антителом. Эти способы детектирования применимы также для обнаружения любого из VEGI-_192a или VEGI-_192b, описанных здесь.

В другом воплощении данное изобретение обеспечивает также способ обнаружения полинуклеотидов изоформ VEGI (VEGI-_192a или VEGI-_192b), предусматривающий контактирование пробы из индивидуума с полинуклеотидом (таким как олигонуклеотид), который селективно связывается с полинуклеотидом VEGI данного изобретения; и детектирование присутствия или отсутствия дуплекса, образованного между этим олигонуклеотидом и полинуклеотидом пробы. Эти способы применимы также для обнаружения любого из полинуклеотидов VEGI-_192a или VEGI-_192b, описанных здесь.

Еще в одном воплощении данное изобретение обеспечивает способ диагностики состояний, включающих в себя патологический ангиогенез, причем этот способ предусматривает детектирование присутствия или отсутствия полипептидов, происходящих из VEGI-_192a или VEGI-_192b, в пробе, предусматривающий стадии:

(i) контактирования пробы из субъекта, у которого подозревают наличие патологического ангиогенеза, с антителами, которые являются специфическими для полипептидов VEGI-_192a и/или VEGI-_192b данного изобретения; и

(ii) детектирования присутствия или отсутствия комплекса, образованного между VEGI-_192a и/или VEGI-_192b и антителами.

Еще в одном воплощении данное изобретение обеспечивает способ диагностики патологического ангиогенеза, предусматривающий обнаружение присутствия или отсутствия полинуклеотидов VEGI-_192a или VEGI-_192b (предпочтительно РНК) в пробе, причем этот способ предусматривает стадии:

(i) контактирования пробы из субъекта, у которого подозревают наличие патологического ангиогенеза, с полинуклеотидами (такими как олигонуклеотиды), которые специфически связывают полинуклеотиды VEGI-_192a или VEGI-_192b данного изобретения (например, РНК); и

(ii) детектирования присутствия или отсутствия комплекса, образованного между полинуклеотидами и олигонуклеотидами, происходящими из VEGI-_192a или VEGI-_192b.

В другом воплощении данное изобретение обеспечивает способ диагностики патологического ангиогенеза с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР), предусматривающий конструирование праймеров с использованием нуклеотидной последовательности изоформы VEGI (т.е. VEGI-_192a, VEGI-_192b), показанной в SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:2, в котором полимеразная цепная реакция специфически амплифицирует район VEGI в качестве основы для детектирования. Эти праймеры могут быть использованы для амплификации ДНК VEGI или РНК VEGI, причем последняя амплификация происходит после превращения РНК в комплементарную ДНК (кДНК) обратной транскрипцией этой РНК. ПЦР-анализ может быть сделан количественным посредством сравнения амплифицированного продукта со стандартом, который может быть получен с использованием способов, известных в данной области.

Еще в одном воплощении данное изобретение обеспечивает способ обнаружения полинуклеотидов изоформ VEGI (т.е. VEGI-_192a или VEGI-_192b) в пробе, предусматривающий анализ на присутствие или отсутствие РНК или ДНК изоформы VEGI-_192a или VEGI-_192b в пробе с использованием гибридизационного анализа.

В следующем воплощении данное изобретение обеспечивает диагностический или прогностический набор, содержащий антитела, которые связывают полинуклеотиды или полипептиды изоформ VEGI (т.е. VEGI-_192a или VEGI-_192b) данного изобретения; олигонуклеотиды, которые гибридизуются с ДНК или РНК VEGI; и/или ПЦР-праймеры для амплификации ДНК или РНК VEGI и вспомогательные реагенты, пригодные для использования в детектировании присутствия изоформы VEGI в пробе. Поскольку VEGI может функционировать как мембранный белок, природно существующая растворимая форма мембраносвязанного VEGI может функционировать как его антагонист, и способы обнаружения такой растворимой формы включены в другое воплощение данного изобретения.

Еще