Способ обнаружения эндотоксинов грамотрицательных бактерий

Способ обнаружения эндотоксинов грамотрицательных бактерий

Реферат

Изобретение относится к медицине, а именно к электропунктурной диагностике, и может быть использовано для обнаружения эндотоксинов (липополисахаридов) грамотрицательных бактерий в образцах крови и в препаратах для парентерального введения.

Известен способ обнаружения бактериальных эндотоксинов по их способности вызывать коагуляцию белков, содержащихся в лизате амебоцитов краба Limulus polyphemus (Novitsky T.J. Limulus amebocyte lysate (LAL) detection of endotoxin in human blood. J.Endotox Research. 1994.1,253).

Однако этот способ недостаточно специфичен и выявляет не только эндотоксины, но и некоторые компоненты клеточной стенки грамположительных бактерий и грибов. С лизатом амебоцитов интерферируют также гепарин и некоторые антибиотики, в частности аминогликозиды и пенициллин. Для выявления эндотоксина в кровотоке при помощи лизата амебоцитов необходимо взятие пробы крови из вены и ее обработка перхлористой кислотой или прогреванием для инактивации компонентов плазмы крови, влияющих на результаты теста. Применение способа полностью зависит от импорта препаратов лизата амебоцитов. Все это затрудняет возможность применения лизата амебоцитов в широкой лабораторной практике.

Целью изобретения является повышение специфичности и упрощение способа обнаружения эндотоксинов.

Сущность способа заключается в обнаружении эндотоксинов в образцах крови и в препаратах для парентерального введения методом электропунктурной диагностики с использованием резонансно-частотного эффекта электромагнитных излучений путем применения спектра частот колебаний 37,9; 39,5; 42,6 и 44,2 Гц, характерного для гликолипида хемотипа Re из бактерий Salmonella minnesota R595, который входит в состав липополисахаридов большинства грамотрицательных бактерий.

В качестве источника, генерирующего электромагнитные излучения, используют аппарат "МИНИ- ЭКСПЕРТ-ДТ" (регистрационный номер 95/311-121) производства Центра интелектуальных медицинских систем "ИМЕДИС" (Москва) или аппарат "Bicom" фирмы "Regumed"(ФРГ) или любой другой источник, генерирующий требуемые излучения. Диагностику осуществляют по методу электропунктурного вегетативного резонансного теста (Электропунктурный вегетативный резонансный текст. Методические рекомендации. Минздрав РФ. Москва, 2001). Вегетативный резонансный тест заключается в регистрации изменений показателей электропроводности избранной воспроизводимой точки измерений при внесении в контур измерения тест-препарата или тестируемых частот. Для выявления эндотоксина в пробах крови или в инъекционных растворах используют пробанта (помощника оператора), подключение которого к сети прибора и внесение в контур измерений тестируемых частот не приводит к изменению показателей электропроводности воспроизводимой точки измерений.

Пример 1. Определение специфичности способа. К сети прибора подключают пробанта и подбирают воспроизводимую точку измерений на концевой фаланге пальцев его руки по показаниям стрелки на шкале прибора. Затем на приборе выставляют частоты 37,9; 39,5; 42,6 и 44,2 Гц и каждую частоту проверяют путем нажатия щупом на воспроизводимую точку измерений, регистрируя при этом показания стрелки на шкале прибора. При отсутствии отклонений стрелки прибора влево при проверке ответа на каждую частоту к сети прибора подключают образцы растворов, содержащих липополисахариды (ЛПС) или другие бактериальные продукты в концентрации 100 нанограмм в 1 мл, и все частоты вновь проверяют путем нажатия щупом на воспроизводимую точку измерений. При наличии эндотоксина в образце стрелка на шкале прибора при проверке ответа на каждую частоту отклоняется влево не менее чем на 5-10 условных единиц.

Таблица 1
Объект исследования	Наличие эндотоксина
Re-гликолипид S.minnesota R595	+
Бактерии S. minnesota R595	+
ЛПС S.typhimurium	+
Бактерии S.typhimurium	+
ЛПС S-enteritidis	+
ЛПС S. sonnei	+
ЛПС S.flexneri	+
ЛПС E.coli О14	+
Бактерии E.coli О14	+
Бактерии Proteus vulgaris	+
Бактерии K. pneumoniae	+
Бифидобактерии	-
Лактобактерии	-
Бактерии S.aureus	-
Грибы Candida albicans	-
Пенициллин	-

Результаты исследований приведены в табл.1, из которой видно, что предложенный способ выявляет ЛПС различных грамотрицательных бактерий и сами грамотрицательные бактерии, в состав которых входит ЛПС. В то же время способ не обнаруживает грамположительные бактерии, грибы Candida albicans и пенициллин, то есть те объекты, с которыми может взаимодействовать лизат амебоцитов краба Limulus polyphemus. Эти данные свидетельствуют о специфичности предложенного способа.

Пример 2. Определение чувствительности способа. Готовят разведения Re-гликодипида S.minnesota R595, ЛПС S.typhimurium и ЛПС E.coli O14 в концентрациях 100 нг, 10 нг, 1 нг, 100 пкг, 10 пкг и 1 пкг в 1 мл и наличие в них эндотоксина определяют так же, как описано в примере 1. Результаты изучения соответствующих образцов приведены в табл.2.

Таблица 2
Объекты исследования
1	2	3	4	5	6
Re-гликолипид S.minnesota R595	+	+	+	+	+	+
ЛПС S.typhimurium	+	+	+	+	+	+
ЛПС Е.coli O14	+	+	+	+	+	+
* пробы 1 - 100 нг, 2 - 10 нг, 3 - 1 нг, 4 - 100 пкг, 5 - 10 пкг, 6 - 1 пкг в 1мл.

Предложенный способ характеризуется очень высокой чувствительностью и выявляет 1 пкг эндотоксина в 1 мл (далее не исследовали).

Пример 3. Выявление эндотоксина в пробах крови и в растворах для парентерального введения.

К сети прибора подключают пробанта и подбирают воспроизводимую точку измерений на концевой фаланге пальцев его руки. Затем на приборе выставляют частоты 37,9; 39,5; 42,6 и 44,2 Гц и каждую частоту проверяют путем нажатия щупом на воспроизводимую точку, регистрируя показания стрелки на шкале прибора. При отсутствии отклонений стрелки прибора влево при проверке ответа на каждую частоту к сети прибора подключают образец с каплей крови, взятой из пальца исследуемого пациента, или образец препарата для парентерального введения и все частоты проверяют путем нажатия щупом на воспроизводимую точку измерений. При наличии эндотоксина в образце крови или в инъекционном препарате стрелка на шкале прибора отклоняется влево не менее чем на 5-10 условных единиц при проверке ответа на каждую частоту. В этой серии исследований изучали образцы крови, взятой из пальца у различных пациентов. Кроме того, обследовали инъекционные растворы пиридоксина, анальгина, баралгина, лидокаина и реглана. Результаты этих исследований представлены в табл.3.

Таблица 3
Пробы крови обследованных пациентов и растворы	Кол-во обследованных	Кол-во ЛПС* случаев
Здоровые (18-20 лет)	22	2
Здоровые (50-77 лет)	5	3
Дисбиоз кишечника	10	8
Ревматоидный артрит	3	3
Болезнь Бехтерева	1	1
Опухоль головн. мозга	1	1
Ишемич. болезнь сердца	3	3
Инъекционные растворы	5	0

Таким образом, предлагаемый способ с использованием электромагнитных излучений с частотами колебаний 37,9; 39,5; 42,6 и 44,2 Гц может быть применен для выявления эндотоксина в образцах крови, взятой из пальца, и в растворах для парентерального введения. Предлагаемый способ характеризуется специфичностью и высокой чувствительностью, не требует взятия крови из вены и ее предварительной обработки и доступен для применения в медицинской практике.

Способ обнаружения эндотоксинов грамотрицательных бактерий в пробах крови или растворах для парентерального введения с применением электропунктурного вегетативного резонансного теста, заключающийся в подключении пробанта к прибору «МИНИ-ЭКСПЕРТ-ДТ» или к другому прибору, генерирующему электромагнитные излучения, и выборе воспроизводимой точки измерения на концевой фаланге пальцев его руки, после чего на приборе выставляют частоты колебаний 37,9; 39,5; 42,6 и 44,2 Гц и проверяют ответ на каждую путем нажатия щупом на воспроизводимую точку измерений пробанта, регистрируя при этом показания стрелки на шкале прибора, и при отсутствии отклонении стрелки прибора при проверке ответа на каждую частоту к сети прибора подключают пробы крови или растворы для парентерального введения, вновь выставляют на приборе указанные частоты, проверяют ответ на каждую частоту путем нажатия щупом на воспроизводимую точку измерений пробанта и при отклонении стрелки прибора влево не менее чем на 10 условных единиц при проверке ответа на каждую частоту делают заключение о наличие эндотоксина в пробах крови или растворах для парентерального введения.