Конъюгаты, состоящие из полимера и пептидов, происходящих от gp41 вич, и их применение в терапии

Конъюгаты, состоящие из полимера и пептидов, происходящих от gp41 вич, и их применение в терапии

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к конъюгатам, состоящим из полимера и синтетических пептидов, происходящих от gp41 вируса иммунодефицита человека (ВИЧ). Более конкретно настоящее изобретение относится к конъюгату, образованному путем функционального присоединения к полимеру не менее двух молекул синтетического пептида, содержащего аминокислотную последовательность, происходящую либо от области HR1, либо от области HR2 gp41 ВИЧ-1.

Предшествующий уровень техники

В настоящее время хорошо известно, что клетки могут быть инфицированы ВИЧ в соответствии с механизмом, при котором происходит слияние клеточной мембраны и вирусной мембраны. Общепринятая модель такого механизма заключается в том, что гликопротеиновый комплекс вирусной оболочки (gp120/gp41) взаимодействует с рецепторами клеточной поверхности на мембранах клеток-мишеней. После связывания gp120 с клеточными рецепторами (например, CD4 в комбинации с хемокиновым ко-рецептором, таким как CCR-5 или CXCR-4), индуцируется конформационное изменение в комплексе gp120/gp41, которое способствует внедрению gp41 в мембрану клетки-мишени и опосредует слияние мембран.

Аминокислотная последовательность gp41 и ее варианты в различных штаммах ВИЧ хорошо известны. На фиг.1 схематически представлены общеизвестные функциональные домены gp41 (следует отметить, что число аминокислотных последовательностей может слегка варьировать в зависимости от штамма ВИЧ). Очевидно, что гибридный пептид (фузогенный домен) участвует во внедрении вируса в мембрану клетки-мишени и ее дизрупции. Трансмембранный домен, содержащий трансмембранную якорную последовательность, расположен на С-конце этого белка. Между гибридным пептидом и трансмембранным якорем находятся две различных области, известные как области гептадных повторов (HR), каждая из которых имеет множество гептад. Область HR1, которая ближе расположена к N-концу белка, чем область HR2, в основном описана как область, содержащая аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO:1. Однако из-за природного полиморфизма аминокислотная последовательность (а также нумерация остатков) области HR1 gp41 ВИЧ-1 может варьировать в зависимости от вирусного штамма, от которого происходит эта аминокислотная последовательность. Другая область, HR2, также представленная на фиг.1 и в SEQ ID NO:2, может варьировать также вследствие полиморфизма. Каждая аминокислотная последовательность, содержащая область HR1, и аминокислотная последовательность, содержащая область HR2, представляет собой одну из наиболее высококонсервативных областей в белке оболочки ВИЧ-1 (Shu et al., 1999, Biochemistry, 38:5378-5385; Hanna et al., 2002, AIDS 16:1603-8). Области HR имеют множество участков, состоящих из 7 аминокислотных остатков, или "гептад" (7 аминокислот в каждой гептаде обозначены "а"-"g"), где аминокислоты в положении "а" и в положении "d" являются в основном гидрофобными. В каждой области HR также присутствует один или несколько мотивов типа "лейциновой молнии" (называемых также повторами типа "лейциновой молнии"), содержащих 8 аминокислотных последовательностей, начинающихся с изолейцина или лейцина и заканчивающихся ими. В большинстве случаев область HR2 имеет только один мотив типа "лейциновой молнии", тогда как область HR1 имеет пять мотивов типа "лейциновой молнии". Гептады и мотивы типа "лейциновой молнии" участвуют в образовании суперспирализованной структуры gp41 и суперспирализованной структуры пептидов, происходящих от областей HR. В общих чертах известно, что суперспирали состоят из двух или более спиралей, которые закручены друг относительно друга, образуя олигомеры, причем характерным признаком таких суперспиралей является гептадный повтор, состоящий из аминокислот с преобладанием гидрофобных остатков в первом ("а") и в четвертом ("d") положениях, и заряженных остатков, чаще всего локализованных в пятом ("е") и в седьмом ("g") положениях, где аминокислоты в положении "а" и в положении "d" представляют собой детерминанты, влияющие на статус олигомера и ориентацию цепи (см., например, Akey et al., 2001, Biochemistry, 40:6352-60).

Было обнаружено, что синтетические пептиды, происходящие либо от области HR1 ("пептиды HR1"), либо от области HR2 ("пептиды HR2") gp41 ВИЧ, ингибируют передачу ВИЧ клеткам-хозяевам в in vitro-анализах и в клинических in vivo-исследованиях (см. например, Wild et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:9770-9774; патенты США № 5464933 и 5656480, и Kilby et al., 1998, Nature Med. 4:1302-1306). Более конкретно пептиды HR1, представленные DP107 (также известные как Т-21; SEQ ID NO:3), блокируют инфицирование Т-клеток при 50%-ной эффективной концентрации (ЕС50), составляющей 1 мкг/мл (см. например, Lawless et al., 1996, Biochemistry, 35:13697-13708). Пептиды HR2, представленные DP178 (также известные как Т-20; SEQ ID NO:4), обычно блокируют инфицирование Т-клеток при 50%-ной эффективной концентрации (ЕС50) в масштабе нг/мл. Первые упоминания о высокоэффективных синтетических пептидах, которые включают одну или несколько энхансерных последовательностей, присоединенных к аминокислотной последовательности корового gp41 ВИЧ, и ингибируют слияние мембраны ВИЧ с клеточной мембраной, предотвращая тем самым передачу вируса клетке-хозяину, уже встречались в литературе (см. например, патенты США №№ 6258782 и 6348568). Однако синтетические пептиды, происходящие от gp41 ВИЧ, имеют относительно низкую молекулярную массу. Для достижения и поддержания в кровотоке уровня, достаточного для продуцирования терапевтического эффекта, эти синтетические пептиды подобно другим известным пептидам, которые являются эффективными терапевтическими агентами, требуют частого введения (например, ежедневных инъекций). Для решения этой проблемы исследователями были предприняты попытки химически модифицировать терапевтический агент, такой как пептид или пептидомиметик, например, путем присоединения этого терапевтического агента к водорастворимому полимеру, такому как полиэтиленгликоль (ПЭГ), так чтобы обеспечивалось более длительное присутствие этого терапевтического агента in vivo (например, увеличение его времени полужизни в кровотоке и/или ингибирование разложения терапевтического агента в кровотоке). Однако как известно специалистам (см., например, патенты США 6258774 и 6113906), такие модификации терапевтического агента имеют естественные ограничения, то есть такие модификации обычно ограничивают биологическую доступность терапевтического агента. Более конкретно присоединение водорастворимого полимера к терапевтическому агенту, а в частности к небольшому пептиду, часто приводит к негативной модуляции биологической активности терапевтического агента. Такая потеря активности и терапевтической эффективности часто происходит у пептидов с более низкой молекулярной массой (например, менее 4000 дальтон), у которых имеется мало сайтов связывания, не ассоциированных с биоактивностью. Хотя в предшествующих работах могло быть описано конъюгирование терапевтических агентов с водорастворимым полимером, однако в этих работах нет каких-либо упоминаний о конъюгате, который содержал бы полимер, присоединенный к двум или более молекулам синтетического пептида и который сохранял бы значительную биоактивность (например, сохранял бы значительную биологическую активность по сравнению с активностью отдельно взятого синтетического пептида) и усиленное действие (значительную биологическую активность против штамма ВИЧ-1, резистентного к синтетическому пептиду, взятому отдельно, то есть не форме конъюгата, по сравнению с биологической активностью синтетического пептида).

Таким образом, необходимо получить такие конъюгаты, которые могли бы предотвращать взаимодействие вирусных доменов gp41, участвующих в процессе слияния вируса, а более предпочтительно предотвращать конформационные изменения в gp41, необходимые для такого слияния, и которые обеспечивали бы ингибирование слияния gp41 ВИЧ с мембраной клетки-мишени. Кроме того, необходимо получить конъюгаты, которые могли бы ингибировать передачу ВИЧ клетке-мишени и в то же самое время сохраняли бы значительную биологическую активность и имели бы более сильное действие. Настоящее изобретение направлено на удовлетворение этих требований.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение относится к конъюгату, включающему полимер, к которому присоединены два или несколько синтетических пептидов, происходящих от области HR gp41 (области HR1, области HR2 или их комбинаций), где указанный конъюгат имеет то преимущество, что он сохраняет значительный уровень биологической активности (то есть активности против ВИЧ) и обладает усиленным действием (по сравнению с синтетическим пептидом, взятым отдельно (например, без полимерной части конъюгата)). Другие отличительные признаки, такие как увеличение биологической полужизни синтетического пептида, который является частью конъюгата (например, способствующее увеличению времени полужизни синтетического пептида in vivo перед его разложением в кровотоке и/или удалением из кровотока по сравнению с отдельно взятым синтетическим пептидом), будут очевидны специалистам из нижеследующего описания изобретения. Конъюгат согласно настоящему изобретению, кроме того, может содержать фармацевтически приемлемый носитель.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу применения конъюгата согласно настоящему изобретению для ингибирования передачи ВИЧ клетке-мишени, где указанный способ предусматривает введение в вирус и в клетку определенного количества конъюгата согласно настоящему изобретению, эффективного для ингибирования инфицирования клетки указанным вирусом. Этот способ может быть использован для лечения ВИЧ-инфицированных индивидуумов. В предпочтительном варианте осуществления изобретения ингибирование передачи ВИЧ клетке-мишени предусматривает ингибирование gp41-опосредованного слияния ВИЧ-1 с клеткой-мишенью.

Настоящее изобретение также относится к способам получения конъюгатов в соответствии с настоящим изобретением. Один из таких описанных здесь способов включает стадии: (а) проведения реакции первой молекулы синтетического пептида с полимером с образованием интермедиата, включающего первый интермедиат, где первая молекула синтетического пептида функционально присоединена к первой реакционноспособной функциональной группе полимера; (b) проведения реакции указанного интермедиата, включающего первый интермедиат, со второй молекулой синтетического пептида с образованием конъюгата, где вторая молекула синтетического пептида функционально присоединена к интермедиату, включающему первый интермедиат, посредством второй реакционноспособной функциональной группы данного полимера. Для специалиста очевидно, что такой способ может также предусматривать одновременное присоединение множества молекул синтетического пептида к полимеру, где более чем одна молекула синтетического пептида функционально присоединяется к полимеру с образованием конъюгата, где каждая молекула синтетического пептида, которая становится функционально присоединенной, функционально связывается с реакционноспособной функциональной группой полимера.

Вышеуказанные и другие цели, отличительные признаки и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из нижеследующего подробного описания изобретения со ссылками на прилагаемый графический материал.

Краткое описание графического материала

На фиг.1 схематически представлен gp41 ВИЧ-1, где показана область 1 гептадного повтора (HR1) и область 2 гептадного повтора (HR2) вместе с другими функциональными областями gp41. Примеры аминокислотных последовательностей, соответствующих HR1 и HR2, и нумерация положений аминокислот приводятся лишь в целях иллюстрации, и относятся к gp160, штамму ВИЧ_IIIB.

На фиг.2 схематически проиллюстрирован вариант синтеза конъюгата согласно настоящему изобретению.

Подробное описание изобретения

Определения:

В настоящем описании термины "первый", "второй", "третий" и т.д. могут быть использованы для: (а) указания порядка; или (b) для идентификации этих молекул (например, синтетических пептидов, интермедиатов или конъюгатов, которые по своему составу отличаются друг от друга); либо (с) для той и другой цели ((а) и (b)). Однако термины "первый", "второй", "третий" и т.д. не должны рассматриваться как ограничение настоящего изобретения.

Термин "функционально присоединенный" (и его грамматические формы), используемый в описании и формуле изобретения, относится к гибриду, связи или к ассоциации, обладающих стабильностью, достаточной для того, чтобы полимер независимо от условий, имеющихся in vivo, оставался присоединенным к двум или более молекулам синтетического пептида в течение определенного периода времени, достаточного для увеличения биологического времени полужизни синтетического пептида, который является частью конъюгата согласно настоящему изобретению (по сравнению с отдельно взятым синтетическим пептидом). Как известно специалистам, указанная связь может включать одну или несколько ковалентных, ионных, водородных, ван-дер-ваальсовых, электростатических связей и т.п. Как известно специалистам и как будет более очевидно из нижеследующего описания вариантов изобретения, существует несколько методов и композиций, в которых две или более молекулы могут быть функционально связаны с использованием реакционноспособных функциональных групп. Как будет подробно описано в настоящем изобретении, такими реакционноспособными группами являются, но не ограничиваются ими, свободные химические группы (например, тио, карбоксил, гидроксил, амин, сульфо и т.п.) и реакционноспособные химические группы (реагирующие со свободными химическими группами).

Термин "индивидуум", используемый в описании и в формуле изобретения, относится к млекопитающему, а предпочтительно к человеку.

Термин "клетка-мишень", используемый в описании и формуле изобретения, означает клетку, которая может подвергаться ВИЧ-инфицированию. Такой клеткой предпочтительно является клетка или клетки человека, а более предпочтительно клетки человека, которые могут подвергаться ВИЧ-инфицированию по определенному механизму, включая мембранное слияние.

Термин "фармацевтически приемлемый носитель", используемый в описании и формуле изобретения, означает среду-носитель, которая не оказывает значительного влияния на биологическую активность активного ингредиента (например, конъюгата по изобретению или соединения, полученного способом по изобретению), при его добавлении в эту среду. Как известно специалистам, подходящий фармацевтически приемлемый носитель может содержать одно или несколько веществ, включая, но не ограничиваясь ими, воду, забуференную воду, физиологический раствор, 0,3% глицин, водные спирты, изотонический водный буфер; и, кроме того, он может включать одно или несколько веществ, таких как глицерин, масла, соли, такие как соли натрия, калия, магния и аммония, фосфонаты, сложные эфиры карбоновых кислот, жирные кислоты, сахариды, полисахариды, гликопротеины (для повышения стабильности), наполнители, консерванты и/или стабилизаторы (предназначенные для увеличения срока хранения, если это необходимо, и подходящие для изготовления и коммерческого распределения этой композиции). Предпочтительно, чтобы носитель был подходящим для внутривенного, внутримышечного, подкожного или парентерального введения (например, путем инъекции).

Термин "аминокислота", используемый в описании и в формуле изобретения и относящийся к синтетическим пептидам по изобретению, означает молекулу, которая имеет по крайней мере одну свободную аминогруппу и по крайней мере одну свободную карбоксильную группу. Такая аминокислота может иметь более чем одну свободную аминогруппу или более чем одну свободную карбоксильную группу либо, кроме того, она может содержать одну или несколько свободных химических реакционноспособных групп, не являющихся аминогруппой или карбоксильной группой (например, гидроксил, сульфгидрил и т.п.). Такой аминокислотой может быть природная аминокислота (например, L-аминокислота), неприродная аминокислота (например, D-аминокислота), синтетическая аминокислота, модифицированная аминокислота, аминокислотное производное, предшественник аминокислоты и ее консервативная замена. Специалисту известно, что выбор аминокислот, включаемых в пептид, отчасти зависит от конкретных физических, химических или биологических свойств, необходимых для противовирусного пептида. Так, например, из описания изобретения специалисту будет очевидно, что аминокислоты в синтетическом пептиде могут представлять собой одну или несколько природных (L)-аминокислот и неприродных (D)-аминокислот. Аминокислоты, не являющиеся предпочтительными, могут быть заменены предпочтительными аминокислотами.

Термин "аминокислотная замена", относящийся к аминокислотной последовательности синтетического пептида, полученного в соответствии с настоящим изобретением, и используемый в описании и в формуле изобретения, означает одну или несколько аминокислотных замен в последовательности синтетического пептида, а именно таких замен, при которых способность пептида связываться с областью HR gp41 ВИЧ и ингибировать gp41-опосредованное слияние остается в основном неизменной (как может быть определено по противовирусной активности, выраженной в IC₅₀ в пределах величин нг/мл или мкг/мл, как более подробно проиллюстрировано ниже). Обычно число аминокислотных замен составляет примерно от 1 аминокислоты до 10 аминокислот в синтетическом пептиде, а более предпочтительно от 1 аминокислоты до 5 аминокислот в синтетическом пептиде. Как известно специалистам, аминокислотная замена может включать "консервативную замену", которая определяется вышеупомянутыми функциями, и предусматривает замены аминокислот, имеющих в основном тот же самый заряд и размер и такую же гидрофильность и/или ароматичность, как и удаленная аминокислота. Такими консервативными заменами, известными специалистам, являются, но не ограничиваются ими, замены: глицин-аланин-валин; изолейцин-лейцин; триптофан-тирозин; аспарагиновая кислота-глутаминовая кислота; аргинин-лизин; аспарагин-глутамин и серин-треонин. Аминокислотная замена может включать полиморфизм в различных положениях аминокислот в области HR1 или в области HR2 в зависимости от области, от которой происходит синтетический пептид, имеющийся в лабораторных и/или в клинических изолятах ВИЧ. Такие последовательности с полиморфизмом имеются в доступной базе данных генов, такой как GenBank, и в других доступных базах данных аминокислотных последовательностей ВИЧ.

Термин "реакционноспособная функциональная группа", используемый в описании и в формуле изобретения, означает химическую группу или химическую молекулу, способную образовывать ковалентную связь или связь для функционального присоединения полимера к синтетическому пептиду. Что касается химических групп, то реакционноспособными функциональными группами, известными специалистам, являются, но не ограничиваются ими, малеимидная группа, тиоловая группа, карбоксигруппа, фосфорильная группа, ацильная группа, гидроксильная группа, ацетильная группа, гидрофобная группа, амидогруппа, дансильная группа, сульфогруппа, сукцинимидная группа, группа, реагирующая с тиолом, группа, реагирующая с амином, группа, реагирующая с карбоксилом и т.п. Химическая молекула может содержать линкер. Известно, что линкер представляет собой соединение или группу, которая действует как молекулярный мостик, функционально связывающий две различные молекулы (например, одна часть линкера связывается с синтетическим пептидом, а другая часть линкера связывается с полимером с образованием конъюгата настоящего изобретения). Эти две различных молекулы могут быть присоединены к линкеру постадийно. Конкретный размер или состав линкера не имеет ограничений при условии, что он может быть использован в качестве молекулярного мостика. Линкерами, известными специалистам, являются, но не ограничиваются ими, химические цепи, химические соединения (например, реагенты), аминокислоты и т.п. Такими линкерами могут быть, но не ограничиваются ими, гомобифункциональные линкеры, гетеробифунциональные линкеры, биологически стабильные линкеры и биологически разлагаемые линкеры, также известные специалистам. Если используется линкер, то предпочтительным является непланарный линкер (например, такой линкер, который действует так, чтобы функционально присоединенный синтетический пептид не был жестко связан с полимером). Гетеробифункциональные линкеры, хорошо известные специалистам, содержат один конец, имеющий первую реакционноспособную функциональную группу, специфически связанную с первой молекулой, и противоположный конец, имеющий вторую реакционноспособную функциональную группу, специфически связанную со второй молекулой. Для специалиста очевидно, что различные бифункциональные или полифункциональные реагенты, такие как гомо- и гетерофункциональные реагенты (например, реагенты, описанные в каталоге Pierce Chemical Co., Rockford, III), могут быть использованы в качестве линкера по изобретению. Для оптимизации таких свойств, как сохранение стабильности биологических функций, резистентности к некоторым химическим и/или температурным параметрам и достаточной стереоселективности или размера, длина и состав линкера может варьировать в зависимости от таких факторов, как связываемые молекулы и условия, в которых происходит такое связывание. Так, например, линкер не должен оказывать значительного влияния на способность синтетического пептида (с которым он связан) функционировать как ингибитор слияния ВИЧ с клеткой-мишенью и передачи ВИЧ клетке-мишени, или того и другого. В соответствии с настоящим изобретением реакционноспособная функциональная группа, не являющаяся предпочтительной, может быть заменена предпочтительной реакционноспособной функциональной группой.

Термин "полимер", используемый в описании и в формуле изобретения, включает гомополимеры и сополимеры, а также полимеры, которые могут иметь структуру, включая разветвленную или линейную структуру, известную специалистам. Предпочтительным полимером является водорастворимый полимер, а более предпочтительно водорастворимый полимер, который является в основном нетоксичным при его in vivo введении индивидуумам. Иллюстративными примерами таких водорастворимых полимеров являются, но не ограничиваются ими, полиолы, полиэтиленгликоль ("ПЭГ"), полипропиленгликоль ("ППГ"), декстран, карбоксиметилцеллюлоза, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, поли-1,3-диоксолан, поли-1,3,6-триоксан, полиаминокислоты (гомополимеры, например, полилизины или гетерополимеры, например, поли(D-L-аланин)-поли(L-лизин)), поли(алкиленоксид), сополимеры этиленгликоля и ППГ, сополимеры ПЭГ и аминокислоты, сополимеры ПЭГ и тиояблочной кислоты, и сополимеры полипропиленоксида и этиленоксида. Предпочтительно, чтобы используемый полимер представлял собой дискретную молекулу, т.е. молекулу, состоящую из одинакового числа полимерных звеньев (например, 6 этиленовых звеньев в ПЭГ), но не смесь полимерных молекул, где каждые из этих молекул по своему размеру отличаются друг от друга. Используемый в настоящем изобретении термин "полимер" может также включать алкил с разветвленной или прямой цепью (как будет видно ниже, например, из таблицы 5). Полимер, используемый для получения конъюгата по изобретению, может иметь молекулярную массу в очень широком интервале, при этом в предпочтительном варианте осуществления изобретения указанный полимер имеет молекулярную массу в пределах примерно от 200 дальтон до 100000 дальтон, а в более предпочтительном варианте осуществления изобретения указанный полимер имеет молекулярную массу в пределах примерно от 300 дальтон до 20000 дальтон. Многочисленные реакционноспособные функциональные группы могут быть присоединены к полимеру или составлять часть полимера, к которому функционально присоединен синтетический пептид, и на этом полимере могут присутствовать реакционноспособные функциональные группы более чем одного типа для селективного связывания с синтетическими пептидами (например, реакционноспособная функциональная группа каждого типа является доступной для функционального связывания с молекулой синтетического пептида, где каждая молекула синтетического пептида может иметь последовательность, аналогичную или отличающуюся от последовательности другой(их) молекулы (молекул) присоединяемого синтетического пептида). Примерами реакционноспособных функциональных групп, описанных выше, и других групп могут быть, но не ограничиваются ими, кетоны, сложные эфиры, карбоновые кислоты, альдегиды, спирты, амины и т.п. В этой связи, для создания или представления реакционноспособных функциональных групп полимера, который может быть использован для функционального связывания двух или более молекул синтетического пептида с образованием конъюгата по изобретению, этот полимер может быть соответствующим образом сконструирован, модифицирован или соответствующим образом функционализирован стандартными методами органического химического синтеза. Поскольку в настоящем изобретении могут быть использованы многие водорастворимые полимеры и множество реакционноспособных функциональных групп, то метод химического синтеза для создания или присоединения реакционноспособной функциональной группы будет зависеть от полимера и реакционноспособной функциональной группы, которую желательно присоединить к полимеру. Полимер, используемый в настоящем изобретении, предпочтительно имеет следующие характеристики: (а) он является водорастворимым и предпочтительно растворимым в водных системах, которые обычно присутствуют in vivo; (b) он имеет более чем одну реакционноспособную функциональную группу (либо одного и того же типа, либо различных типов, например, по химическому составу), где две или более молекул синтетического пептида могут быть функционально присоединены к полимеру посредством более чем одной реакционноспособной функциональной группы полимера (предпочтительно, чтобы каждая реакционноспособная функциональная группа полимера, подходящая для функционального связывания с синтетическим пептидом, была функционально присоединена к реакционноспособной функциональной группе одной молекулы синтетического пептида); и (с) при функциональном связывании с синтетическим пептидом с образованием конъюгата по изобретению он не оказывает значительного влияния на биологическую активность (например, противовирусную активность) синтетического пептида, как можно определить методами оценки противовирусной активности in vitro и/или in vivo и как будет более подробно описано ниже. Полимер, предпочтительный для использования в настоящем изобретении, включает полиол, а более предпочтительно ПЭГ. В соответствии с настоящим изобретением полимер, не являющийся предпочтительным, может быть заменен предпочтительным полимером.

Термин "усиленное действие", относящийся к конъюгату по изобретению и используемый в описании и в формуле изобретения, означает, что этот конъюгат обладает более сильной противовирусной активностью против штаммов ВИЧ-1, резистентных к одному или нескольким отдельно взятым синтетическим пептидам (мономеру, который не связан с полимером) по сравнению с противовирусной активностью отдельно взятого синтетического пептида (как будет более очевидно из нижеследующего описания). Предпочтительно, чтобы такое "усиленное действие" конъюгата означало противовирусную активность против резистентных штаммов ВИЧ-1, измеренную как IC50 или EС50 и составляющую менее (например, в нг/мл) или равную 1 мкг/мл (по отношению к активности синтетического пептида) (см., например, таблицу 5).

Термин "синтетический пептид", относящийся к пептиду по изобретению и используемый в описании и в формуле изобретения, означает пептид, (а) полученный методами химического синтеза, рекомбинантной экспрессии, биохимической или ферментативной фрагментации более крупной молекулы, химического расщепления более крупной молекулы, или их комбинацией, либо, в общих чертах, полученный другими известными методами и выделенный; (b) имеющий аминокислотную последовательность, включающую не менее чем примерно 16 аминокислотных остатков и не более чем примерно 60 аминокислотных остатков, и состоящую из не менее чем 14 смежных аминокислот, принадлежащих либо к области HR1, либо к области HR2 gp41 ВИЧ (которые могут включать одну или несколько аминокислотных замен); и (с) способный ингибировать передачу ВИЧ клетке-мишени (предпочтительно путем образования комплекса с любой из областей HR gp41 ВИЧ и/или предотвращения слияния между ВИЧ-1 и клеткой-мишенью), как может быть определено путем оценки противовирусной активности in vitro и/или in vivo, и как будет более подробно описано ниже. Термин "выделенный", относящийся к пептиду, означает, что синтетический пептид в основном не содержит компонентов, которые не являются частью целой структуры самого пептида, например в основном не содержит клеточного материала или культуральную среду, используемых при продуцировании рекомбинантными методами, или в основном не содержит химических предшественников или других химических веществ, используемых при химическом синтезе или продуцированных в биохимических или химических реакциях. Аминокислотная последовательность синтетического пептида может включать одну или несколько аминокислотных замен и/или одну или несколько модификаций, образующихся в результате полиморфизма и присутствующих в последовательности в релевантной области gp41 ВИЧ, либо она может включать одну или несколько аминокислотных замен, которые вводят для стабилизации спиральной структуры и/или для воздействия на олигомеризацию так, чтобы происходила самосборка пептидов в тример. Кроме того, аминокислотная последовательность помимо того, что она имеет коровый пептид, происходящий от gp41 ВИЧ, может содержать один или несколько энхансерных пептидов, присоединенных к коровому пептиду, например, у N-конца, у С-конца или у обоих N- и С-концов, либо она может содержать коровый пептид, происходящий от одного или нескольких ВИЧ-1, ВИЧ-2 и SIV (см, например, патент США № 6258782; см. также синтетический пептид, содержащий аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO:5 и 46-59). В зависимости от используемого синтетического пептида синтетический пептид, функционально присоединенный в полимеру, может присутствовать в виде мономера или в олигомерной форме, такой как тример. В примере, где синтетический пептид присутствует в качестве тримера, только одна молекула может быть функционально присоединена к полимеру, тогда как остальная часть молекулы синтетического пептида, содержащего тример, подвергается самосборке вокруг функционально присоединенной молекулы синтетического пептида. Так, например, иллюстративные синтетические пептиды, содержащие пептиды HR1, имеющие аминокислотные замены (по сравнению с SEQ ID NO:1) и предпочтительно подвергающиеся самосборке в тримеры (например, в тример, состоящий из трех молекул синтетического пептида), содержат аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NN:61-74.

Предпочтительно синтетический пептид по изобретению может содержать последовательность длиной примерно не менее 16 аминокислотных остатков и примерно не более 60 аминокислотных остатков, предпочтительно не менее 36 аминокислот и примерно не более 52 аминокислот, а более предпочтительно примерно не менее 41 аминокислоты и примерно не более 51 аминокислоты. Предпочтительно, чтобы синтетический пептид, содержащий последовательность, происходящую от области HR1 gp41 ВИЧ, включал непрерывную последовательность, состоящую, по крайней мере, из смежных аминокислотных остатков 18-54 SEQ ID NO:1 (обозначенных однобуквенными кодами, NNLLRAIEAQQHLLQL TVWGIKQLQARILAVERYL KD), или ее вариант, образованный в результате полиморфизма, поскольку было обнаружено, что ключевые детерминанты в этой части области HR1 влияют на биохимические и противовирусные свойства, описанные в настоящем изобретении. Репрезентативными синтетическими пептидами, происходящими от области HR1, являются, но не ограничиваются ими, пептиды, имеющие аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO:3 и 6-31. Предпочтительный синтетический пептид, происходящий от области HR1, может быть использован для продуцирования конъюгата по изобретению вместо пептида HR1, не являющегося предпочтительным синтетическим пептидом. Предпочтительно, чтобы последовательность синтетического пептида, происходящего от области HR2 gp41 ВИЧ, включала непрерывную последовательность, состоящую, по крайней мере, из аминокислотных остатков 43-51 SEQ ID NO:2 (например, QQEKNEQEL), поскольку было обнаружено, что ключевые детерминанты в этой части области HR2 влияют на биохимические и противовирусные свойства, описанные в настоящем изобретении. Репрезентативными синтетическими пептидами, происходящими от области HR2, являются, но не ограничиваются ими, пептиды, имеющие аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO:4, 32, 75-99 и 114. Предпочтительный синтетический пептид, происходящий от области HR2, может быть использован для продуцирования конъюгата по изобретению вместо пептида HR2, не являющегося предпочтительным синтетическим пептидом. Большое число таких синтетических пептидов, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, были описаны ранее (например, в патентах США № 5656480, 6133418 и 6258782, которые во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки). Термин "отдельно взятый синтетический пептид", используемый в описании и в формуле изобретения, означает синтетический пептид, который функционально не связан с полимером, то есть пептид, который имеет неконъюгированную форму, не содержащую полимера.

Настоящее изобретение проиллюстрировано на нижеследующих примерах, которые не должны рассматриваться как ограничение настоящего изобретения.

Пример 1

В одном из вариантов осуществления изобретения проиллюстрирован способ получения конъюгатов по изобретению. Один из описанных здесь способов включает стадии: (а) проведения реакции первой молекулы синтетического пептида с полимером с получением интермедиата, включающего первый интермедиат, где первая молекула синтетического пептида функционально присоединена к первой реакционноспособной функциональной группе полимера; (b) проведения реакции указанного интермедиата, включающего первый интермедиат, со второй молекулой синтетического пептида с получением конъюгата, где вторая молекула синтетического пептида функционально присоединена к интермедиату, включающему первый интермедиат, посредством второй реакционноспособной функциональной группы данного полимера. Для специалиста очевидно, что такой способ может также предусматривать одновременное присоединение множества молекул синтетического пептида к полимеру, где более чем одна молекула синтетического пептида функционально связывается с полимером с образованием конъюгата и где каждая молекула синтетического пептида, которая становится функционально присоединенной, функционально связана с реакционноспособной функциональной группой полимера.

Пептиды синтезировали на пептидном синтезаторе стандартными методами твердофазного синтеза и стандартными методами пептидной химии с использованием FMOC (см. также патент США № 6015881, переуступленный настоящему правоприемнику). В этом примере синтетические пептиды, кроме того, включали реакционноспособные функциональные группы, то есть были блокированы по N-концу ацетильной группой, а по С-концу - амидной группой. После отщепления от смолы пептиды осаждали и осадок лиофилизовали. Затем пептиды очищали обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографией и идентичность пептидов подтверждали с помощью масс-спектрометрии электрораспылением. В этом примере Т20 (SEQ ID NO:4) использовали для функционального присоединения к полимеру, в результате чего получали конъюгат по изобретению. Как было подробно описано ранее, конъюгаты, состоящие из синтетических пептидов, не являющихся Т20 (SEQ ID NO:4), независимо от того, происходят ли они от области HR1 или от области HR2 gp41 ВИЧ-1, должны быть функционально сходными с различными кон