Способ определения стимулирующего действия препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения на защитную активность фагоцитов

Способ определения стимулирующего действия препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения на защитную активность фагоцитов

Реферат

Изобретение относится к области медицины, а именно к вопросам проверки биологических свойств препаратов крови, и может быть использовано для лабораторного определения стимулирующего влияния препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения на защитные свойства фагоцитов по отношению к различным биологическим объектам, включая клетки микробов - возбудителей инфекций.

Препараты иммуноглобулинов, в том числе и препараты иммуноглобулинов человеческих нормальных для внутривенного введения, в числе прочего применяются для лечения тяжелых системных и местных инфекций [2, 3, 5, 7, 13]. Препараты иммуноглобулинов человеческих нормальных для внутривенного введения производства разных изготовителей ввиду особенностей технологии получения существенно различаются по составу и соответственно - биологическим свойствам, в том числе и защитной эффективности при лечении инфекций [12]. В настоящее время лабораторные методы проверки антимикробных свойств различных препаратов, содержащих иммуноглобулины, включают определение концентрации антител, способных непосредственно нейтрализовать факторы патогенности микроорганизмов - токсины (иммуноглобулин человека антистафилококковый, проивосинегнойная плазма) или инактивировать сами микроорганизмы (иммуноглобулин человека противоклещевой) [4, 6]. В то же время одним из основных иммунных механизмов защитного действия иммуноглобулинов при инфекциях является активация процессов поглощения и инактивации микробов - возбудителей или их киллинг с использованием других механизмов (контактное взаимодействия, экзоцитоз) фагоцитирующими клетками макроорганизма [7, 8, 12]. В настоящее время стимулирующее влияние препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения на защитные свойства фагоцитов определяется только в процессе их клинического применения in vivo [1, 7, 15]. Лабораторные методы предварительного определения возможности такого влияния препаратов иммуноглобулинов на фагоциты не разработаны. В то же время известно, что различным препаратам иммуноглобулинов для внутривенного введения может быть свойственно противовоспалительное действие, и ряд данных препаратов используется для купирования воспалительного ответа [17] и явлений воспалений аутоиммунной и аллергической природы [3, 10]. Одним из ведущих компонентов данного действия является угнетение различных проявлений активности фагоцитирующих клеток, в том числе и их кислородзависимых микробицидных факторов [16]. С учетом вышеизложенного весьма важным представляется лабораторное определение способности выпускаемых препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения влиять на защитную активность фагоцитов в отношении основных микроорганизмов - возбудителей инфекций, при лечении которых показано их применение (сепсис и локальные острые гнойно-воспалительные заболевания - стафилококки, синегнойные палочки, протеи и так далее).

Авторами в научно-медицинской и патентной литературе не было обнаружено сведений о возможности определения стимулирующего влияния препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения на защитную активность фагоцитов in vitro.

Ввиду этого задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является разработка метода лабораторного определения влияния различных препаратов иммуноглобулинов на защитную активность фагоцитов в отношении различных объектов, в том числе микробов.

Известно, что взаимодействию фагоцитов с объектами фагоцитоза, в том числе микробами, включающему явления аттракции объекта, его поглощения и фагоцитарного киллинга, сопутствует активация фагоцитирующих клеток, обусловливающая усиление защитного действия фагоцитоза. В процессе такой активации в клетках отмечается активация процессов кислородзависимого метаболизма с генерацией микробицидных биоокислителей, накопление которых обеспечивает защитное действие фагоцитов и может быть выявлено с помощью цитохимического метода - реакции спонтанного восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест), а также в реакции хемилюминесценции (ХЛ), усиливаемой люминолом [11, 14, 16]. В НСТ-тесте у фагоцитов определяется активация процессов кислородзависимого метаболизма фагоцитов по увеличению активности NADH.H - оксидазы, восстанавливающей нитросиний тетразолий до водонерастворимого диформазана, регистрирующегося в клетке фагоцита при микроскопии [8, 11] или реже - после его экстракции спектрофотометрически [16], а при определении ХЛ - непосредственную генерацию дающих сверхслабое свечение, усиливаемое люминолом, микробицидных биоокислителей [14].

Заявляемый метод основан на регистрации хемилюминесценции фагоцитов с помощью аппаратов хемилюминометров в образцах крови и других биологических жидкостей после инкубации с активаторами, в том числе объектами фагоцитоза, в присутствии люминола. Установлено, что отклонения в интенсивности хемилюминесценции фагоцитов от нормальных показателей (увеличение, снижение) в достаточной степени соответствуют изменениям поглотительной активности и уровню активации кислородзависимого метаболизма по результатам НСТ-теста [9, 14]. При этом метод регистрации ХЛ отличает от определения поглотительной активности и НСТ-теста простота и быстрота выполнения (автоматическая регистрация результатов ХЛ в течении 10 минут). С учетом вышеперечисленных фактов предлагаемый метод предусматривает лабораторное определение стимулирующего влияния препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения на защитную активность фагоцитов в отношении различных объектов фагоцитоза, включая микробные клетки, регистрацией ХЛ фагоцитов при взаимодействии с названными объектами после их предварительной инкубации с препаратами.

Технический результат - выявление уровня активирующего влияния препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения на защитную активность фагоцитов с помощью определения их ХЛ с целью отбора препарата для лечения больных с инфекциями.

Указанный технический результат достигается за счет того, что к полученным из нормальных организмов образцам биологических жидкостей, содержащих фагоцитирующие клетки и гепарин из расчета 50 ЕД/мл (кровь, перитонеальных экссудат животных и так далее) добавляются препараты иммуноглобулинов для внутривенного введения в соотношении 1:5-1:10000 и инкубируются (температура инкубации +5 - +37°С, время инкубации 30 минут - 24 часа; объем реакционной смеси и плотность содержания в ней фагоцитов могут варьировать; в контрольном образце к фагоцитарной популяции вместо препарата добавляется не содержащая белков жидкость - забуференный физиологический раствор или среда 199). После предварительной инкубации с препаратами иммуноглобулинов (к контрольному и исследуемому образцам добавляются объекты фагоцитоза (микробные клетки, микросферы латекса и так далее) или другие фагоцит-активирующие факторы (зимозан, липополисахариды и прочие) и дополнительно инкубируются при +37°С в течение 5-20 минут. Затем 0,1 мл. клеточных суспензий вносят в 2,0 мл физиологического раствора рН 7,2 с растворенными в нем 0,1·10⁶ М люминола (5-амино,2-3-дегидро-4-фталазиндион) и температурой 37°С и помещают в камеру хемилюминомера. Уровень ХЛ регистрируется в течение 10 минут и выражается в виде светосуммы (суммарное количество световых импульсов за 10 минут регистрации в условных единицах - у.е.), вычисляется разность светосумм испытуемого образца (с препаратом иммуноглобулинов) и контрольного (без добавления препаратов); увеличение светосумм на 10% и более свидетельствует о наличии стимулирующего влияния. Исследованиями авторов была доказана возможность предварительной клиническому применению лабораторной оценки активирующего влияния препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения на механизмы фагоцитарной защиты организма. Предлагаемый способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1

С помощью разработанного метода проведено изучение влияния препарата иммуноглобулинов для внутривенного введения «Иммуновенин» (производства ФГУП «НПО «Микроген» МЗ и СР РФ «Иммунопрепарат» в г.Уфе) на функциональную активность фагоцитов крови крыс. Периферическая венозная гепаринизированная (50 ЕД/мл) кровь интактных крыс (содержание лейкоцитов 5,7×10⁹/л) в количестве 0,09 мл вносилась в лунки 96-луночного пластикового планшета. В лунки исследуемых образцов добавляли 0,01 мл препарата «Иммуновенин» (в контрольные - препарат заменен адекватным объемом среды 199). После предварительной инкубации при 37°С в течение 30 минут во все лунки добавляли по 0,01 мл суспензии микросфер латекса (10¹⁰/л) и дополнительно инкубировали при 37°С в течение 15 минут. Определение уровня ХЛ проводили как указывалось выше - 0,1 мл клеточных суспензий вносили в 2,0 мл физиологического раствора рН 7,2 с растворенными в нем 0,1·10⁶ М люминола и определяли светосумму ХЛ на приборе ХЛ-003 с компьютерным режимом регистрации (производства Межвузовской лаборатории технических систем медико-биологических исследований Уфимского государственного авиационного технического университета, г.Уфа) в течение 10 минут. В материале из параллельных лунок исследуемых и контрольных образцов определяли поглотительную способность фагоцитов и индуцируемую латексом активацию кислородзависимого метаболизма фагоцитов в НСТ-тесте общепринятыми методами. Результаты регистрировали микроскопией и выражали: уровень поглотительной активности - вычислением фагоцитарного индекса (% поглотивших объекты лейкоцитов из числа потенциальных фагоцитов) и фагоцитарного показателя (количество поглощенных частиц в перерасчете на один потенциальный фагоцит), активации кислородзависимого метаболизма - % активированных в НСТ-тесте клеток и цитохимического индекса активации [11]. Результаты данных исследований приведены в таблице 1.

Таблица 1
Уровень индуцированной латексом ХЛ лейкоцитов крови крыс после предварительной инкубации клеток с препаратом иммуноглобулинов для внутривенного введения (Иммуновенин)
Показатели активности	Контроль	С Иммуновенином
Фагоцитарный индекс (%)	55,77±1,85	58,60±4,12
Фагоцитарный показатель	5,82±0,22	7,14±0,60*
НСТ индуцированный (%)	55,77±1,85	58,60±4,12
НСТ индуцированный (индекс активации)	5,98±0,13	8,38±0,25*
Светосумма ХЛ (у.е.)	5,16±0,56	7,26±0,85*
* - различие показателей достоверно (р<0,05).

Как видно из материалов таблицы 1, предварительная инкубация фагоцитов крови с Иммуновенином достоверно усиливало их ХЛ ответ на частицы латекса, которое отмечалась параллельно с увеличением интенсивности поглощения такими фагоцитами частиц латекса (достоверное увеличение фагоцитарного показателя) и уровня активации лейкоцитов при фагоцитозе латекса в НСТ-тесте (достоверное увеличение индекса активации).

Пример 2

Предлагаемым методом проведена сравнительная проверка влияния препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения -Иммуновенина, Хумоглобулина и Пентаглобина на способность к активации фагоцитов крови при взаимодействии с зимозаном. При данной проверке периферическая венозная гепаринизированная (50 ЕД/мл) кровь интактных крыс (содержание лейкоцитов 4,9×10⁹/л) в количестве 0,09 мл вносилась в лунки 96-луночного пластикового планшета. В лунки исследуемых образцов добавляли 0,01 мл вышеназванных препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения. После предварительной инкубации при 37°С в течение 30 минут во все лунки добавляли по 0,01 мл суспензии частиц зимозана (10¹⁰/л) и дополнительно инкубировали при 37°С в течение 15 минут. Определение уровня ХЛ проводили так же, как указано выше. Результаты приведены в таблице 2.

Таблица 2
Уровень индуцированной зимозаном ХЛ лейкоцитов крови крыс после предварительной инкубации клеток с препаратом иммуноглобулинов для внутривенного введения
Инкубация с препаратом:	Светосумма ХЛ (у.е.)
Контроль (без препарата)	6,43±2,66
Иммуновенин	15,20±2,40*
Хумоглобулин	10,64±2,76
Пентаглобин	17,34±4,40*
* - различие показателей с контролем (без препаратов) достоверно(р<0,05).

Как видно из материалов таблицы 2, Иммуновенин и Пентаглобин вызывали достоверную комплемент зависимую активацию фагоцитов крови (активирующее воздействие зимозана обусловлено активацией на нем белков системы комплемента - С, и осуществляется присутствующие на мембране фагоцитов рецепторы для С3b компонента комплемента), в то время как для Хумоглобулина такая активация не была достоверной.

Пример 3

Предлагаемый метод был использован для сравнительной оценки стимулирующего действия препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения - Иммуновенина, Хумоглобулина и Пентаглобина, на способность к активации защитных свойств "спровоцированных" перитонеальных фагоцитов крыс (полиморфно-ядерные лейкоциты из очага острого асептического воспаления, содержащиеся в перитонеальном экссудате крыс через 24 часа после внутрибрюшинного введения раствора пептона) при взаимодействии частиц зимозана, микросфер латекса и микробных клеток (живые клетки из культуры стафилококка). Суспензия фагоцитов перитонеальной жидкости (плотность клеток 3,9×10⁹ /л) исследовалась как это описано в Примере 1. В качестве индукторов частицы зимозана, микросферы латекса и клетки культуры Staphylococcus aureus в концентрациях 10¹⁰/л. Результаты исследования приведены в таблице 3.

Таблица 3
Уровень индуцированной зимозаном, латексом и стафилококком ХЛ «спровоцированных» перитонеальных нейтрофилов крыс после предварительной инкубации клеток с препаратами иммуноглобулинов для внутривенного введения
Инкубация с препаратом:	Светосумма (у.е.) при индукции:
зимозаном	латексом	стафилококком
Без препаратов	1,22±0,15	5,16±0,56	33,93±6,14
Иммуновенин	4,57±1,43*	7,26±0,85*	60,16±9,82*
Хумоглобулин	3,54±0,44*	5,24±0,64	56,18±17,03
Пентаглобин	5,27±2,91*	6,21±1,12	58,98±8,92*
* - различие показателей с контролем (без препаратов) достоверно р<0,05).

Как следует из приведенных в таблице 3 данных, все исследованные препараты иммуноглобулинов для внутривенного введения вызывали достоверное усиление комплементзависимой активации "островоспалительных" фагоцитов. В то же время защитную активность в отношении стафилококков достоверно усиливали только Иммуновенин и Петнаглобин, а реакцию с инородными корпускулярными частицами небиологической природы, микросферами латекса (взаимодействие опосредуется лектиноподобными рецепторами мембран фагоцитов) - только Иммуновенин.

Таким образом, как видно из примера 1, предлагаемый метод достаточно четко отражает влияние препаратов иммуноглобулинов на защитную активность фагоцитов, о чем свидетельствует сходство результатов ее определения названным методом и ее определения по изменениям поглотительной способности и активации кислородзависимого метаболизма в НСТ-тесте. Как следует из результатов, приведенных в примере 2, предлагаемый метод позволяет сравнительно оценивать степень стимулирующего влияния разных препаратов иммуноглобулинов на защитную активность фагоцитов в отношении определенного объекта. Пример 3 демонстрирует, что указанным методом может быть определен уровень воздействия различных препаратов на протективную активность фагоцитирующих клеток в отношении конкретных объектов - потенциальных патогенов, защита от которых реализуется через разные рецепторы фагоцитирующих клеток.

Предлагаемым способом была проведена проверка влияния восьми препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения и их отдельных серий на разные виды фагоцитов и везде был получен указанный технический результат. Способ легко воспроизводим в условиях лаборатории.

Источники информации

1. Алсынбаев М.М. Разработка алгоритма клинического применения иммуномодуляторов эндогенной природы для направленной иммунокоррекции при гнойно-септических заболеваниях. Автореф. дисс. докт. мед. наук. - Челябинск. - 2002. - С.48.

2. Алсынбаев М.М., Медведев Ю.А., Бобкова Е.В., Кулагин В.Ф., Исрафилов А.Г., Попова Е.П., Корженевский А.А., Пахомов Д.В., Максютова Л.Ф., Гизатуллин Р.Х. Возможности использования некоторых иммуномодуляторов эндогенной природы в лечении больных гнойно-воспалительной патологией // Медицинская иммунология. - 2001. - Т.3, - №2. - С.302.

3. Анастасиев В.В. Применение иммуноглобулинов: Обзор. - Н.Новгород: Изд-во НГМИ. - 1993. - С.27.

4. Бодрова Г.Н., Клюкевин И.В., Кобаева Е.Н., Хватов В.Б., Михайлова Н.А., Садыкова А.Ф. Использование антитоксической противосинегнойной плазмы для профилактики гнойных осложнений у больных с открытыми переломами // Госпитальная инфекция в реанимации и интенсивная терапия. Актуальные вопросы анестезиологии и реаниматологии. Уфа. - 1996. - С.59-60.

5. Гизатуллин Р.Х., Галеев Ф.С., Халикеева Е.Ю., Вакеев Б.В. Комплексное лечение инфекционно-воспалительных осложнений сочетанных и множественных повреждений с применением иммуновенина. // Актуальные вопросы инфекционной патологии человека, клинической и прикладной иммунологии. Материалы Всероссийской конференции молодых ученых. Уфа, 2004, - С.201-203.

6. Каталог иммунобиологических препаратов и лекарственных средств. Уфа, «Иммунопрепарат». - 2005. - С.188.

7. Корженевский А.А., Алсынбаев М.М., Медведев Ю.А., Кулагин В.Ф., Исрафилов А.Г. Особенности иммуномодулирующего действия препарата иммуноглобулинов для внутривенного введения у больных гнойно-септической хирургической инфекцией в зависимости от состояния В-звена иммунной системы. // Материалы II Конференции иммунологов Урала. - Пермь, 2002.

8. Медведев Ю.А. Неспецифические механизмы и факторы иммунитета. / Ю.А.Медведев, В.В.Сперанский, С.Н.Хунафин. - Уфа, 1994. - С.32.

9. Медведев Ю.А., Фархутдинов P.P., Бондарев А.И. Функционально-метаболическая характеристика фагоцитоза дерматофитов. // Восьмой Всесоюзный съезд дерматовенерологов. Тезисы. Москва, 1985, - С.298.

10. Пат. 2238106, РФ. Препарат противоаллергического внутривенного иммуноглобулина и способ его получения. / М.М.Алсынбаев, А.Г.Исрафилов, С.А.Еникеева и др. - Заявл. 29.07.2002; Опубл. 20.10.2004 // Бюл. - 2004. - №29.

11. Петров Р.В. Оценка иммунного статуса человека при массовых обследованиях. / Р.В.Петров, P.M.Хаитов, Б.В.Пенегин // Методические рекомендации для научных работников и врачей практического здравоохранения (разработаны сотрудниками Института иммунологии МЗ России). - Иммунология." 1992. - №6. - С.51-52.

12. Пинегин, Б.В. Иммунодиагностика и иммунотерапия хирургических инфекций. / Б.В.Пинегин, Т.М.Андронова, Т.И.Юдина // Int. J. Immunorehabilitation. - 1998. - №10. - Р.86-99.

13. Сибиряк С.В., Садыков Р.Ф., Магазов Р.Ш., Сергеева С.А. Иммуномодуляторы: справочник для врачей. - Уфа, ГУП "Иммунопрепарат", 1999. - С.145.

14. Фархутдинов P.P., Лиховских В.А. Хемилюминесцентные методы исследования свободно-радикального окисления в биологии и медицине. - Уфа. - 1995. - 92 с.

15. Фархутдинова Л.В., Медведев Ю.А., Алсынбаев М.М. Диагностика и коррекция иммунной реактивности детей с заболеваниями респираторного тракта при различных вариантах нарушения функционального резерва фагоцитирующих клеток крови. Уфа, 2005. - С.133.

16. Хаитов Р.М. Экологическая иммунология. / P.M.Хаитов, Б.В.Пинегин, Х.И.Истамов. - М., ВНИРО. - 1995. - С.220.

17. Хвойнов Д.В., Викторов В.В., Галлеев Ф.С.и др. Применение препарата "Иммуновенин" как компонента интенсивной терапии системного воспалительного ответа в детской неврологии. // Медицинские иммунобиологические препараты в XXI веке: разработка, производство и применение. Часть 1. Уфа, 2005, - С.24-28.

1. Способ определения стимулирующего действия препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения на защитную активность фагоцитов, заключающийся в том, что к образцам биологических жидкостей, содержащим фагоцитирующие клетки, добавляют препараты иммуноглобулинов для внутривенного введения в соотношении 1:5-1:10000, после предварительной инкубации при температуре 5÷37°С в течение 30 мин-24 ч проводят дополнительную инкубацию при температуре 37°С в течение 5-20 мин с объектом фагоцитоза, определяют интенсивность хемилюминесценции образцов, индуцированных люминолом, и вычисляют разницу светосумм хемилюминесцентного ответа в сравнении с контролем, величина которой в 10% и выше свидетельствует о наличии стимулирующего влияния.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что объектом фагоцитоза являются микробные клетки, клетки животного происхождения и другие биологические объекты.