Способ снижения повышенной функциональной активности тромбоцитов в условиях in vitro

Способ снижения повышенной функциональной активности тромбоцитов в условиях in vitro

Реферат

Изобретение относится к медицине, в частности к кардиологии, и может быть использовано для снижения повышенной агрегационной активности тромбоцитов.

Одним из основных патогенетических факторов ишемической болезни сердца, в частности нестабильной стенокардии, является нарушения сосудисто-тромбоцитарного звена системы гемостаза (Киричук В.Ф., Шварц Ю.Г. Показатели сосудисто-тромбоцитарного механизма гемостаза и ближайший прогноз нестабильной стенокардии // Кардиология - 1998 - т.38 (5) - с.14-17). У больных данной категории показано выраженное повышение агрегационной активности тромбоцитов (Киричук В.Ф., Шварц Ю.Г. Показатели сосудисто-тромбоцитарного механизма гемостаза и ближайший прогноз нестабильной стенокардии // Кардиология - 1998 - т.38 (5) - с.14-17). Одним из факторов, принимающих участие в регуляции агрегационной активности тромбоцитов и сосудистого тонуса, является оксид азота - эндогенный вазодилататор и ингибитор агрегации тромбоцитов (De Caterina R., Libby P., Peng H., et al. Nitric oxide decreasis cytokine-induced endothelial activation: NO selectively reduces endothelial expression of adhesion molecules and proinflammatory cytokines // J. Clin. Invest - 1995 - 96 - p.60-68). Недостаточная продукция или ускоренный распад оксида азота приводит к развитию тяжелых сердечно-сосудистых заболеваний, связанных с нарушением функции эндотелия, патологическим повышением сосудистого тонуса и агрегационной активности тромбоцитов (Журавлева И.А., Мелентьев С.А., Виноградов Н.А. Роль оксида азота в кардиологии и гастроэнтерологии // Клиническая медицина - 1997 - №4 - с.18-21). Лечение этих состояний требует компенсации недостаточной продукции эндотелиального оксида азота. В клинике чаще всего это осуществляется с помощью нитровазодилататоров типа нитроглицерина или нитропруссида натрия, которые применяют при стабильной и нестабильной стенокардии (Зефиров А.Л., Халиулина P.P., Анугин А.А. Влияние эндогенного оксида азота на функцию нервно-мышечного синапса // Российский физиологический журнал им. И.М.Сеченова - 2001 - №4 - с.499-506). Вместе с тем фармакологические средства коррекции дефицита оксида азота имеет свои отрицательные стороны. Так эффект нитровазодилататоров оказывается непродолжительным, а их хроническое применение может способствовать ускоренному атерогенезу и развитию гипертензии (Зефиров А.Л., Халиулина P.P., Анугин А.А. Влияние эндогенного оксида азота на функцию нервно-мышечного синапса // Российский физиологический журнал им. И.М.Сеченова - 2001 - №4 - с.499-506).

В настоящее время достаточно эффективно исследуются вопросы взаимодействия биологических объектов в терагерцовом диапазоне частот, в частности с излучением, имитирующим молекулярные спектры излучения и поглощения (МСИП) ряда биологически активных веществ (Киричук В.Ф., Малинова Л.И., Креницкий А.П., Майбородин А.В., Тупикин В.Д. Гемореология и электромагнитное излучение КВЧ-диапазона. Саратов, Изд-во СарГМУ, 2003, 188 с.). Значительный интерес представляет изучение тромбоцитарных эффектов терагерцового излучения, имитирующего молекулярный спектр излучения и поглощения оксида азота (NO) (Киричук В.Ф., Майбородин А.В., Волин М.В., Креницкий А.П., Тупикин В.Д. Влияние электромагнитных КВЧ-колебаний на частотах молекулярных спектров излучения и поглощения оксида азота на функциональную активность тромбоцитов // Цитология, 2001, т.43, №8, с.759-763), являющегося нейротрансмиттером, эндогенным вазодилататором, ингибитором агрегации тромбоцитов (Волин М.С., Девидсон К.А., Каминска П.М. и др. Механизмы передачи сигнала оксидант-оксид азота в сосудистой ткани // Биохимия, 1998, №63 (7). С.958-965). Показано, что облучение в условиях in vitro на частоте МСИП NO 150,176-150,664 ГГц тромбоцитов больных нестабильной стенокардией приводит к снижению повышенной их агрегационной способности (Киричук В.Ф., Волин М.В., Креницкий А.П., Майбородин А.В., Тупикин В.Д. Тромбоциты в реакциях системы гемостаза на КВЧ-воздействия. Саратов, Изд-во СарГМУ, 2002, 190 с.). Однако оксид азота имеет МСИП, соответствующей частоте 400 ГГц (Бецкий О.В., Креницкий А.П., Майбородин А.В., Тупикин В.Д. Биофизические эффекты волн терагерцового диапазона и перспективы развития новых направлений и биомедицинской технологии: терагерцовая терапия и терагерцовая диагностика. // Биомедицинские технологии и радиоэлектроника, 2003, №12, с.3-6), которая имеет наибольшую энергию кванта в указанном диапазоне, а следовательно, - наибольшую реакционную способность.

Прототипом настоящего исследования является способ снижения повышенной агрегационной активности тромбоцитов в условиях in vitro у больных нестабильной стенокардией терагерцовым излучением на частоте МСИП оксида азота 240 ГГц (Киричук В.Ф., Андронов Е.В., Тупикин В.Д. Эффект влияния излучения терагерцового молекулярного спектра оксида азота на частоте 240 ГГц на процесс активации и агрегации тромбоцитов больных нестабильной стенокардией // Миллиметровые волны в биологии и медицине, 2004, №2 (34), с.35-40). Образцы обогащенной тромбоцитами плазмы (ОТП) больных нестабильной стенокардией подвергались облучению на частоте МСИП оксида азота 240 ГГц (плотность мощности = 1 мВт/см²), в течение 15 минут. Было показано частичное нормализующее воздействие на показатели активации и агрегации тромбоцитов. Недостатком данного метода является недостаточное снижение повышенной агрегационной активности тромбоцитов у больных нестабильной стенокардией.

Нами впервые предложен способ снижения повышенной функциональной активности тромбоцитов в условиях in vitro, включающий облучение обогащенной тромбоцитами плазмы (ОТП) на частоте МСИП оксида азота 400 ГГц в течение 15 минут.

Забор крови у больных производился из локтевой вены в первые 6-12 часов после поступления в стационар (до проведения специфической терапии). Кровь стабилизировалась 3.8% раствором цитрата натрия в соотношении 1:9. Для получения обогащенной тромбоцитами плазмы (ОТП) стабилизированную кровь подвергали центрифугированию в режиме 1000 об/мин в течение 10 минут. Полученная ОТП разделялась на две части: опытную и контрольную. Опытный образец ОТП подвергался облучению на частоте МСИП оксида азота на частоте 400 ГГц (плотность мощности = 1 мВт/см²) в течение 15 минут.

Контрольный образец ОТП не облучался. Исследование функциональной активности тромбоцитов в контрольных и опытных образцах ОТП производилось одновременно.

По окончании воздействия производилось измерение АДФ-индуцированной (2,5 мкМ) агрегации тромбоцитов в обоих образцах ОТП (контрольном и облученном) (Габбасов З.А., Попков Е.Г., Гаврилов И.Ю. и др. Новый высокочувствительный метод анализа агрегации тромбоцитов. Набор, дело 1989; 10:15-18). При анализе агрегатограмм принимались во внимание следующие показатели: максимальный размер образующихся тромбоцитарных агрегатов; максимальная скорость образования наибольших тромбоцитарных агрегатов; максимальная степень агрегации; максимальная скорость агрегации.

При 15 минутном режиме ТГЧ-облучения происходило статистически достоверное снижение всех изучаемых показателей агрегатограммы: максимального размера образующихся тромбоцитарных агрегатов, максимальной скорости образования тромбоцитарных агрегатов, максимальной степени агрегации, максимальной скорости агрегации по сравнению с показателями больных нестабильной стенокардии (Таблица 1).

Пример 1.

Больной Р., диагноз: нестабильная стенокардия. Забор крови произведен через 6 часов после поступления в стационар. Приготовлены образцы ОТП - контрольный и опытный. Опытный образец ОТП подвергнут воздействию электромагнитного излучения на частоте 400 ГГц (плотность мощности = 1 мВт/см²), в течение 15 минут (Таблица 2). В контрольном образце обнаружено изменение большинства показателей, свидетельствующие о повышении функциональной активности тромбоцитов, по сравнению с показателями относительно здоровых людей, в опытном образце - снижение большинства показателей до уровня относительной физиологической нормы и ниже: максимальный размер образующихся тромбоцитарных агрегатов - 3.6 условных единиц и 2.5 условных единиц; максимальная скорость образования наибольших тромбоцитарных агрегатов - 5.1 условных единиц и 3.32 условных единиц; максимальная степень агрегации - 78.4% и 34.6%; максимальная скорость агрегации - 69.3 условных единиц и 30.1 условных единиц соответственно.

Предлагаемый способ, основан на воздействии на тромбоциты ТГЧ-излучения на частоте МСИП оксида азота 400 ГГц, что дает возможность снизить повышенную функциональную активность тромбоцитов больных нестабильной стенокардией.

Таблица 1Воздействие в течение 15 минут терагерцовых волн на частоте МСИП оксида азота 400 ГГц на агрегационную активность больных нестабильной стенокардией в условиях in vitro
Показатели	Относительно здоровые доноры (n=40)	Больные нестабильной стенокардией (n=180)	Облучение 15 минут (n=20)
Максимальный размер образующихся тромбоцитарных агрегатов, у.е.	3.3 (2.8; 3.7)	3.43 (2.5; 4) P1=0.860431 Z1=0.17	2.39 (2.01; 2.77) P2=0.009323 Z2=2.6
Максимальная скорость образования наибольших тромбоцитарных агрегатов, у.е.	3.26 (2.84; 3.79)	5.05(3.1; 6.4) P1=0.008028 Z1=2.65	2.95 (2.16; 3.74) P2=0.010773 Z2=2.55
Максимальная степень агрегации, %	38.8(37.4; 40.1)	71.3(52.6; 91.1) P1=0.000002Z1=4.72	45.4 (30.6; 53.4) P2=0.001542 Z2=3.16
Максимальная скорость агрегации, у.е.	39.3 (33.8; 46.2)	66.7 (57.3; 76.6) P1=0.000001 Z1=5.13	43.6 (31.8; 53.2) P2=0.000017 Z2=4.33
Примечание: в каждом случае приведены средняя величина (медиана - Me), нижний и верхний квартили (25%; 75%). Достоверность при Р<0.05. P1 - интактные тромбоциты и тромбоциты больных нестабильной стенокардией; Р2 - тромбоциты больных нестабильной стенокардией и тромбоциты, подвергнутые 15-минутному облучению

Таблица 2Изменение показателей агрегации тромбоцитов больного Р. до и после 15-минутного облучения терагерцовыми волнами на частотах молекулярного спектра излучения и поглощения NO 400 ГГц в условиях in vitro
Показатели агрегации	До облучения	После облучения
Максимальный размер образующихся тромбоцитарных агрегатов, у.е.	3.6	2.5
Максимальная скорость образования наибольших тромбоцитарных агрегатов, у.е.	5.1	3.32
Максимальная степень агрегации,%	78.4	34.6
Максимальная скорость агрегации, у.е.	69.3	30.1
Примечание: в каждом случае приведены средняя величина (медиана - Me), нижний и верхний квартили (25%; 75%). Достоверность при Р<0.05

Способ снижения повышенной функциональной активности тромбоцитов в условиях in vitro, включающий облучение обогащенной тромбоцитами плазмы терагерцовым излучением на частоте МСИП оксида азота, отличающийся тем, что на обогащенную тромбоцитами плазму воздействуют излучением частотой 400 ГГц, плотность мощности 1 мВт/см² в течение 15 мин.