Композиция для иммунизации (варианты), способ ее получения и применение для лечения аллергических эозинофильных заболеваний

Композиция для иммунизации (варианты), способ ее получения и применение для лечения аллергических эозинофильных заболеваний

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПРЕДПОСЫЛКА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Область изобретения

Данное изобретение относится к областям молекулярной биологии, вирусологии, иммунологии и медицины. Изобретение относится к композиции, содержащей упорядоченную и повторяющуюся матрицу антигенов или антигенных детерминантов и, в частности, матрицу, содержащую белок или пептид IL-5, IL-13 или эотаксина. Более конкретно изобретение относится к композиции, содержащей вирусоподобную частицу и по меньшей мере один связанный с ней белок или пептид IL-5, IL-13 и/или эутаксина. Изобретение также относится к способу получения конъюгатов и, соответственно, упорядоченных и повторяющихся матриц. Композиции согласно изобретению применимы для получения вакцин для лечения аллергических заболеваний с эозинофильным компонентом и в качестве фармацевтической вакцины для профилактики или лечения аллергических заболеваний с эозинофильным компонентом и для эффективной индукции иммунных ответов, в частности гуморальных ответов. Кроме того, композиции согласно изобретению особенно применимы для эффективной индукции специфичных для аутоантигенов иммунных ответов в указанном контексте.

Связанная область

Ряд аллергических заболеваний, включая астму, носовой ринит, носовые полипы, эозинофильные синдромы и атопический дерматит, имеют заметные воспалительные компоненты, характеризующиеся резко выраженной инфильтрацией эозинофилов.

Наиболее важная с медицинской точки зрения группа указанных заболеваний, атопическая астма, считается хроническим воспалительным заболеванием дыхательных путей, которое клинически характеризуется эпизодической обструкцией потока воздуха, воспалением дыхательных путей и повышенной бронхиальной реактивностью на неспецифичные аллергены. Степень обструкции дыхательных путей и гиперреактивность часто коррелирует с уровнем воспаления дыхательных путей. Указанные клинические признаки являются показателем тяжести астмы (Kay, A. B., J. Allergy Clin. Immunol., 1991, 87: 893; De Monchy, J. G. et al., Am. Rev. Respir. Dis., 1985, 131: 373; Beasley, R. et al., Am. Rev. Respir. Dis., 1989, 139: 806; Azzawi, M. et al., Am. Rev. Respir. Dis., 1990, 142: 1407; Ohashi, Y. et al., Am. Rev. Respir. Dis., 1992, 145: 1469; Nakajima, H. et al., Am. Rev. Respir. Dis., 1992, 146: 374; Broide, D. H. et al., Allergy Clin. Immunol., 1991, 88: 637; Warlaw, A. J. et al., Am. Rev. Respir. Dis., 1988, 137: 62). Инфильтрация клеток коррелирует с прогрессированием заболевания и свидетельствует о воспалении дыхательных путей, которое является основным фактором, который вносит вклад в патогенез и патобиологию. Воспалительный инфильтрат при астме является комплексным; однако в настоящее время широко известно, что Th-лимфоциты CD4⁺ с Th2-профилем экспрессии цитокинов (клетки Th2) играют центральную роль в клиническом проявлении и патогенезе данного заболевания (Robinson, D. S. et al., J. Allergy Clin. Immunol., 1993, 92: 397; Walker, C. et al., J. Allergy Clin. Immunol., 1991, 88: 935). Клетки Th2 регулируют прогрессирование заболевания и гиперчувствительность дыхательных путей (AHR), управляя аллергическим воспалением посредством высвобождения ряда цитокинов, таких как IL-4, -5, -9, -10, -13 (Robinson, D. S. et al., N. Eng. J. Med., 1992, 326: 298; Robinson, D. S. et al., J. Allergy Clin. Immunol., 1993, 92: 313; Walker, C. et al., Am. Rev. Respir. Dis., 1992, 146: 109; Drazen, J. M. et al., J. Exp. Med., 1996, 183: 1). Подобно Th2-клеткам уровни эозинофилов и их продуктов воспаления в легком коррелируют с тяжестью заболевания, и накопление указанных лейкоцитов в дыхательных путях является главным признаком бронхиальной дисфункции во время поздней фазы астматического ответа (Bousquet, J. et al., N. Eng. J. Med., 1990, 323: 1033). Хотя клетки Th2 управляют многими аспектами аллергического ответа, считается, что их роль в регуляции эозинофилии посредством секреции IL-5 является главным провоспалительным направлением при астме.

Интерлейкин-5 (IL-5) является провоспалительным цитокином, экспрессируемым у астматиков на высоком уровне. Кроме того, IL-5 является цитокином, главным образом вовлеченным в патогенез атопических заболеваний. Он специфично контролирует продукцию, активацию и локализацию эозинофилов, основную причину повреждения тканей при атопических заболеваниях. Кроме того, IL-5 является индуцируемым цитокином, производимым T-клетками, с заметной специфичностью в отношении линии эозинофилов. Контроль за IL-5 осуществляется на уровне транскрипции, и регуляция гена представляет собой многообещающую мишень для терапии зависимых от эозинофилов аллергических заболеваний, таких как астма, экзема и ринит.

Существует большое количество доказательств, что эозинофилы являются ключевым компонентом аллергического ответа при астме. IL-5 однозначно вовлечен в продукцию эозинофилов и вместе с множеством других цитокинов, таких как IL-13, хемокинов, таких как эотаксин, и других факторов контролирует их активацию, локализацию и жизнеспособность. Таким образом, IL-5 стал важной лекарственной мишенью для новых противоастматических средств (Foster, P. S. et al., Pharmacol. Ther., 2002, 94 (3): 253; Foster, P. S. et al., Trends Mol. Med., 2002, 8 (4): 162).

Имеет место 71% гомология между белками человека и мыши (справочник по цитокинам). IL-5 не проявляет значительной гомологии аминокислотной последовательности с другими цитокинами, за исключением коротких участков в белках: интерлейкине-3 мыши, мышином GM-CSF и интерфероне-γ мыши. Рассчитанная молекулярная масса последовательностей белка и человека, и мыши составляет 13,1 кД. Биологически активный IL-5 является связанным дисульфидными связями гомодимером, который ковалентно связан с помощью высококонсервативных остатков цистеина (44-86' и 86-44'), которые ориентируют мономеры в конфигурации «голова к хвосту» (Takahashi T. et al. Mol. Immunol. 27: 911-920, 1990). Хотя мономерный IL-5 дикого типа неактивен, функциональный мономер IL-5 был сконструирован с помощью инсерционного мутагенеза (Dickason R.R., et al., J. Mol. Med 74: 535-46 1996). Анализ кристаллической структуры IL-5 человека выявил новую конфигурацию, состоящую из двух доменов, при этом каждый домен требует участия двух цепей, укладка которых в высокой степени сходна с укладкой цитокина, обнаруженной в GM-CSF, интерлейкине-3 и интрелейкине-4 (Milburn M.V. et al., Nature 363: 172-176). C-концевая область IL-5, по-видимому, необходима для связывания с рецептором IL-5 и для биологической активности (Proudfoot et al., J. Protein Chem. 15 (5): 491-9, 1996). Считается, что связывание IL-5 с его рецептором происходит в областях, перекрывающих спирали A и D, при этом спираль A главным образом вовлечена в связывание α-субъединицы рецептора (Graber P. et al. J. Biol. Chem. 270: 15762-15769, 1995). Нативный IL-5 человека имеет 2 потенциальных сайта гликозилирования, а IL-5 мыши - три. IL-5 человека как N-гликозилирован, так и O-гликозилирован по Thr 3. Рекомбинантный IL-5, экспрессированный в эукариотических системах, имеет широкие пределы молекулярных масс 45-60 кД вследствие дифференциального гликозилирования. Дегликозилированный IL-5 и IL-5, экспрессированный в прокариотических клетках, полностью сохраняет биологическую активность (Tominaga A. et al., J. Immunol 144: 1345-1352, 1990).

Пути обнаружения лекарственных средств обычно основаны на скринингах ингибиторов продукции IL-5, антагонистов лигандов, контроле экспрессии рецептора и активации рецептора. В частности, ингибирование действия IL-5 может обеспечить путь лечения астмы и других заболеваний, связанных с эозинофилами. Иммунотерапия представляет собой другой и очень привлекательный способ контроля уровней IL-5 и патологических состояний, связанных с эозинофилией, таких как астма.

В настоящее время самым распространенным способом лечения для предотвращения симптомов астмы является применение кортикостероидов путем ингаляции. Обычно применение указанных средств довольно безопасно и дешево. Однако они функционируют, индуцируя общее иммуносупрессирующее действие, и имеют место неблагоприятные побочные эффекты, связанные с их длительным применением, включая высокое кровяное давление, остеопороз и развитие катаракт. Кортикостероиды необходимо принимать каждый день и поэтому соблюдение этого требования пациентом является другой проблемой для успешного применения указанных лекарственных средств. Кроме того, существуют пациенты, не восприимчивые к применению кортикостероидов, которым требуется применение альтернативной терапии. Избирательная направленность на мишень - эозинофилы, с использованием иммунотерапевтических средств, направленных против IL-5, может преодолеть неблагоприятные эффекты использования общих иммуносупрессорных средств плейотропного действия.

В будущем возможное лечение таких заболеваний, как астма, может включать пассивную иммунизацию и, таким образом, применение моноклональных антител, специфичных в отношении IL-5. Ведутся клинические испытания гуманизированных моноклональных антител против IL-5, нацеленные на уменьшение эозинофилии у пациентов, больных астмой. В частности, сообщалось о клинических испытаниях с использованием SCH55700 (эслизумаб, Schering Plough), которое является гуманизированным моноклональным антителом с активностью против IL-5 из различных видов [Egan, R. W. et al., Arneimittel-Forschung, 1999, 49: 779], и SB240563 (меполизумаб, Glaxo Smith Kline), которое является гуманизированным антителом со специфичностью в отношении интерлейкина-5 человека и приматов [Hart, T. K. et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med., 1998, 157: A744; Zia-Amirhosseini, P. et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1999, 291: 1060]. Оба моноклональных антитела показали приемлемые профили безопасности в фазе 1 испытаний и привели к снижению количества эозинофилов, но не наблюдалось уменьшения гиперреактивности дыхательных путей. Полагают, что вредное воздействие, которое оказывают эозинофилы на дыхательные пути больных астмой, является хроническим явлением, в которое вовлечено ремоделирование ткани. Нуждаются в оценке и разрабатываются исследования, предназначенные для того, чтобы тестировать эффективность анти-IL-5-терапии в данном контексте.

Однако лечение с помощью мАт влечет за собой несколько недостатков. Моноклональные антитела являются дорогими терапевтическими средствами, которые необходимо принимать в течение месяца или двух месяцев. Важной проблемой является проблема несоблюдения предписаний пациентами, которая возникает из-за многократных визитов к врачу для введения инъекционного лекарственного средства. Кроме того, отклонения в аллотипах между пациентом и терапевтическим антителом может привести к тому, что терапия моноклональным антителом в конечном итоге станет неэффективной. Высокая доза мАт и возможность образования иммунных комплексов также могут снижать эффективность пассивной иммунизации. Методика активной вакцинации ограничивает указанные трудности.

Другой способ, обеспечивающий терапевтические средства против хронической астмы и других патологических состояний, при которых проявляется эозинофилия, или других состояний, связанных с IL-5, описан в WO 97/45448. В данной заявке предложено применение «модифицированных и вариантных форм молекул IL5, способных антагонизировать активность IL5» для улучшения, ослабления или уменьшения другим образом отклоняющихся от нормы эффектов, вызванных нативными и мутантными формами IL5. Сообщается, что антагонизирующее действие является результатом вариантных форм IL5, связывающихся с низкоаффинной цепью IL5R, но не с высокоаффинными рецепторами. Действуя таким образом, варианты конкурируют с IL5 за связывание с его рецепторами, не влияя на физиологические действия IL5.

Эотаксин является хемокином, специфичным в отношении рецептора хемокинов 3, присутствующего на эозинофилах, базофилах и клетках Th2. Однако эотаксин обладает высокой специфичностью в отношении эозинофилов (Zimmerman et al., J. Immunol. 165: 5839-46 (2000)). Миграция эозинофилов снижается на 70% у мышей, «нокаутированных» по эотаксину-1, у которых, однако, еще может развиваться эозинофилия (Rothenberg et al., J. Exp. Med. 185: 785-90 (1997)). IL-5, по-видимому, ответственен за миграцию эозинофилов из костного мозга в кровь, а эотаксин - за локальную миграцию в ткани (Humbles et al., J. Exp. Med. 186: 601-12 (1997). Таким образом, использование в качестве мишени эотаксина в дополнение к IL-5 может усилить иммунотерапию, направленную на снижение эозинофилии.

Геном человека содержит 3 гена эотаксина, эотаксины 1-3, которые имеют 30% гомологию. В настоящее время известно 2 гена у мышей: эотаксин 1 и эотаксин 2 (Zimmerman et al., J. Immunol. 165: 5839-46 (2000)). Они имеют 38% гомологии. Мышиный эотаксин 2 на 59% гомологичен эотаксину 2 человека. Эотаксин 1 у мышей, по-видимому, экспрессируется повсеместно в желудочно-кишечном тракте, тогда как эотаксин-2, по-видимому, преимущественно экспрессируется в тощей кишке (Zimmerman et al., J. Immunol. 165: 5839-46 (2000)). Эотаксин-1 присутствует в бронхоальвеолярной жидкости (Teixeira et al., J. Clin. Invest. 100: 1657-66 (1997)). Последовательность эотаксина-1 человека показана в SEQ ID No.: 242 (а/к 1-23 соответствуют сигнальному пептиду), последовательность эотаксина-2 человека показана в SEQ ID No.: 243 (а/к 1-26 соответствуют сигнальному пептиду), последовательность эотаксина-3 человека показана в SEQ ID No.: 244 (а/к 1-23 соответствуют сигнальному пептиду), последовательность эотаксина-1 мыши показана в SEQ ID No.: 245 (а/к 1-23 соответствуют сигнальному пептиду) и последовательность эотаксина-2 мыши показана в SEQ ID No.: 246 (а/к 1-23 соответствуют сигнальному пептиду).

Мономер эотаксина имеет массу 8,3 кД и находится в равновесии с димерным эотаксином в широких пределах условий. Определенная Kd равна 1,3 мМ при 37°C, однако мономер является преобладающей формой (Crump et al., J. Biol. Chem. 273: 22471-9 (1998). Структура эотаксина выяснена с помощью ЯМР-спектроскопии. Сайт связывания с его рецептором CCR3 находится на N-конце и область, предшествующая первому цистеину, является наиболее важной (Crump et al., J. Biol. Chem. 273: 22471-9, 1998). Пептиды, полученные из рецепторов хемокинов, связанных с эотаксином, подтвердили это наблюдение. Эотаксин имеет четыре цистеина, образующих два дисульфидных мостика, и его можно синтезировать химическим способом (Clark-Lewis et al., Biochemistry 30: 3128-3135, 1991). Эотаксин 1 по-разному O-гликозилируется по Thr71 (Noso, N. et al., Eur. J. Biochem. 253: 114-122). Также описана экспрессия эотаксина 1 в цитозоле E. coli (Crump et al.,J. Biol. Chem. 273: 22471-9 (1998)). В случае эотаксина-2 сообщалось об экспрессии в E. coli в виде телец включения с последующим рефолдингом (Mayer et al., Biochemistry 39: 8382-95 (2000)) и об экспрессии в клетках насекомых (Forssmann et al., J. Exp. Med. 185: 2171-6 (1997)).

Интерлейкин 13 (IL-13) секретируется в виде биологически активного мономерного цитокина Th2. Зрелая форма IL-13 содержит 112 аминокислот у человека и 111 аминокислот у мышей. Рассчитанная молекулярная масса белка составляет примерно 12,4 кД. IL-13 может быть N-гликозилирован (Fitzgerald K. A. et al., The Cytokines Fact Book 2nd edition Academic Press). IL-13 продуцируется клетками Th2, тучными клетками, базофилами и клетками - природными киллерами (Brombacher F, 2000 Bioessays Jul; 22 (7): 646-56). Функциональный рецептор IL-13 является гетеродимером, состоящим из α-цепи рецептора интерлейкина 4 (α-цепь IL-4R) и одного из двух связывающих белков рецептора α IL-13 (Brombacher F, 2000 Bioassays Jul; 22 (7): 646-56).

IL-13 играет важную роль в патологии астмы. Показано, что IL-13 вовлечен в главные симптомы данного заболевания. Он оказывает непосредственное влияние на индуцированную аллергеном гиперчувствительность дыхательных путей (AHR) и выработку слизи и вовлечен в эозинофилию (Kuperman D. A. 2002, Nature Medicine, в печати). Избирательная нейтрализация IL-13 у мышей в значительной степени ослабляла фенотип астмы. Кроме того, введение IL-13 придавало подобный астме фенотип несенсибилизированным дефицитным по T-клеткам мышам или обычным мышам, соответственно (Grünig G. et al., 1998, Science, 282 (5397): 2261-3; Wills-Karp, M. et al., 1998 Science, 282 (5397): 2258-61). У мышей с целенаправленной делецией IL-13 не могла развиваться индуцированная аллергеном AHR, и наблюдалось заметное снижение выработки слизи (Walter, D. M. et al., 2001, J. Immunol. 167(8): 4668-75). Так как IL-13 также влияет на эозинофилию в модели астмы у мышей (Grünig G. et al., 1998, Science, 282 (5397): 2261-3), возможно, что IL-13 вовлечен во многие другие аллергические заболевания, связанные с эозинофилией, и нейтрализация его активности может служить многообещающим способом лечения пациентов.

Кроме того, повышающая регуляция IL-13 и рецептора IL-13 обнаружена во многих типах опухолей (например, во всех исследованных до настоящего времени линиях клеток лимфомы Ходжкина). Таким образом, иммунизация против IL-13 может обеспечить способ лечения пациентов с опухолями, сверхэкспрессирующими IL-13.

Одним из способов повышения эффективности вакцинации является увеличение степени повторяемости применяемого антигена. В отличие от изолированных белков, вирусы индуцируют немедленные и эффективные иммунные ответы в отсутствие каких-либо адъювантов как с помощью T-клеток, так и без нее (Bachmann and Zinkernagel, Ann. Rev. Immunol. 15: 235-270 (1991)). Хотя вирусы часто состоят из небольшого количества белков, они способны запускать намного более сильные иммунные ответы, чем их изолированные компоненты. В случае ответов B-клеток известно, что одним ключевым фактором для иммуногенности вирусов является повторяемость и порядок поверхностных эпитопов. У многих вирусов обнаружена квазикристаллическая поверхность, на которой экспонирована регулярная матрица эпитопов, которая эффективно перекрестно связывает специфичные для эпитопов иммуноглобулины на B-клетках (Bachmann and Zinkernagel, Immunol. Today 17: 553-558 (1996)). Указанное перекрестное связывание поверхностных иммуноглобулинов на B-клетках является мощным сигналом активации, который непосредственно индуцирует прохождение клеточного цикла и продукцию IgM-антител. Кроме того, такие стимулированные B-клетки способны активировать хелперные T-клетки, которые, в свою очередь, индуцируют переключение с продукции IgM на продукцию IgG-антител в B-клетках и образование долгоживущих B-клеток памяти - цель любой вакцинации (Bachmann and Zinkernagel, Ann. Rev. Immunol. 15:235-270 (1997)). Вирусная структура связана даже с образованием анти-антител, происходящим при аутоиммунном заболевании и являющимся частью естественного ответа на патогены (смотри Fehr, T., et al., J Exp. Med. 185: 1785-1792 (1997)). Таким образом, антитела, презентированные на высокоорганизованной вирусной поверхности, способны индуцировать мощные ответы в виде анти-антител.

Однако, как указано, обычно иммунная система не может продуцировать антитела против структур собственного организма. В случае растворимых антигенов, присутствующих в низкой концентрации, это является следствием толерантности на уровне Th-клеток. При таких условиях связывание аутоантигена с носителем, который может обеспечивать T-помощь, может нарушить толерантность. Для растворимых белков, присутствующих в высоких концентрациях, или мембранных белков в низкой концентрации толерантными могут быть B- и Th-клетки. Однако B-клеточная толерантность может быть обратимой (анергия) и может быть нарушена введением антигена в высокоорганизованной форме, связанного с чужеродным носителем (Bachmann and Zinkernagel, Ann. Rev. Immunol. 15: 235-270 (1997)).

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторы обнаружили, что белок или пептид IL-5, IL-13 или эотаксина, которые связаны с центральной частицей, имеющей структуру с присущей ей повторяющейся организацией, и таким образом, в частности, с вирусоподобными частицами (VLP) и субъединицами VLP, соответственно, приводящими к образованию высокоупорядоченных и повторяющихся конъюгатов, представляют собой эффективные иммуногены для индукции антител, специфичных в отношении IL-5, IL-13 или эотаксина. Кроме того, указанные аутореактивные антитела ингибируют эозинофилию в мышиной модели астмы. Таким образом, данное изобретение относится к терапевтическому способу лечения аллергического эозинофильного заболевания, который основан на упорядоченной и повторяющейся матрице белок или пептид IL-5, IL-13 или эотаксина-центральная частица, и, в частности, к конъюгату или матрице VLP-белок или пептид IL-5, IL-13 или эотаксина, соответственно. Указанное терапевтическое средство способно индуцировать высокие титры антител против IL-5, IL-13 или эотаксина у вакцинированного животного и ингибировать эозинофилию в мышиной модели астмы.

Таким образом, данное изобретение относится к композиции, содержащей (a) центральную частицу по меньшей мере с одним первым сайтом связывания, и (b) по меньшей мере один антиген или антигенную детерминанту по меньшей мере с одним вторым сайтом связывания, где указанный антиген или антигенная детерминанта является белком или пептидом IL-5, IL-13 или эотаксина и где указанный второй сайт связывания выбран из группы, состоящей из (i) сайта связывания неприродного происхождения с указанным антигеном или антигенной детерминантой, и (ii) сайта связывания природного происхождения с указанным антигеном или антигенной детерминантой, где указанный второй сайт связывания способен к ассоциации с указанным первым сайтом связывания и где указанный антиген или антигенная детерминанта и указанная центральная частица взаимодействуют посредством указанной ассоциации, образуя упорядоченную и повторяющуюся антигенную матрицу. Предпочтительными вариантами центральных частиц, подходящих для применения в данном изобретении, являются вирус, вирусоподобная частица, бактериофаг, бактериальная фимбрия или жгутик или любая другая центральная частица, имеющая присущую ей повторяющуюся структуру, способную образовывать упорядоченную и повторяющуюся антигенную матрицу согласно данному изобретению.

Более конкретно, изобретение относится к композиции, содержащей упорядоченную и повторяющуюся матрицу антигенов или антигенных детерминант, и, таким образом, в частности, конъюгаты белка или пептида IL-5, IL-13 или эотаксина-VLP. Более конкретно, изобретение относится к композиции, содержащей вирусоподобную частицу и по меньшей мере один связанный с ней белок или пептид IL-5, IL-13 или эотаксина. Изобретение также относится к способу получения конъюгатов и упорядоченных и повторяющихся матриц, соответственно. Композиции согласно изобретению применимы для получения вакцин для лечения аллергических заболеваний с эозинофильным компонентом и в качестве фармацевтических вакцин для профилактики или лечения аллергических заболеваний с эозинофильным компонентом и для эффективной индукции иммунных ответов, в частности гуморальных ответов. Кроме того, композиции согласно изобретению особенно применимы для эффективной индукции специфичных для аутоантигенов иммунных ответов в указанном контексте.

В данном изобретении белок или пептид IL-5, IL-13 или эотаксина обычно связан с центральной частицей и, соответственно, с VLP ориентированным образом, образуя упорядоченную и повторяющуюся матрицу антигенов белка или пептида IL-5, IL-13 или эотаксина. Кроме того, высокоповторяющаяся и организованная структура центральных частиц и, соответственно, VLP опосредует экспонирование белка или пептида IL-5, IL-13 или эотаксина высокоупорядоченным и повторяющимся образом, приводя к образованию высокоорганизованной и повторяющейся антигенной матрицы. Кроме того, связывание белка или пептида IL-5, IL-13 или эотаксина с центральной частицей и, соответственно, с VLP обеспечивает эпитопы хелперных T-клеток, так как центральная частица и VLP являются чужеродными по отношению к хозяину, иммунизируемому матрицей центральная частица-белок или пептид IL-5, IL-13 или эотаксина и, соответственно, матрицей VLP-белок или пептид IL-5, IL-13 или эотаксина. Указанные матрицы отличаются от конъюгатов предшествующего уровня техники своей высокоорганизованной структурой, размерами и повторяемостью антигена на поверхности матрицы.

В одном аспекте изобретения белок или пептид IL-5, IL-13 или эотаксина экспрессируют в подходящем хозяине экспрессии, совместимом с правильной укладкой белка IL-5, IL-13 или эотаксина или пептида IL-5, IL-13 или эотаксина, или синтезируют, тогда как центральную частицу и, соответственно, VLP экспрессируют и очищают из экспрессирующего хозяина, подходящего для укладки и сборки центральной частицы и, соответственно, VLP. Белок или пептид IL-5, IL-13 или эотаксина можно синтезировать химическим способом. Затем собирают матрицу белка или пептида IL-5, IL-13 или эотаксина посредством связывания белка или пептида IL-5, IL-13 или эотаксина с центральной частицей и, соответственно, с VLP.

В другом аспекте данное изобретение относится к композиции, содержащей (a) вирусоподобную частицу и (b) по меньшей мере один антиген или антигенную детерминанту, где указанный антиген или указанная антигенная детерминанта является белком или пептидом IL-5, IL-13 или эотаксина и относится к фармацевтической композиции, содержащей (a) композицию по п.1 или п. 22 и (b) приемлемый фармацевтический носитель.

В еще одном аспекте данное изобретение относится к композиции вакцины, содержащей композицию, включающую в себя (a) центральную частицу по меньшей мере с одним первым сайтом связывания и (b) по меньшей мере один антиген или антигенную детерминанту по меньшей мере с одним вторым сайтом связывания, где указанный антиген или антигенная детерминанта является белком или пептидом IL-5, IL-13 или эотаксина и где указанный второй сайт связывания выбран из группы, состоящей из (i) сайта связывания неприродного происхождения с указанным антигеном или антигенной детерминантой и (ii) сайта связывания природного происхождения с указанным антигеном или антигенной детерминантой, где указанный второй сайт связывания способен к ассоциации с указанным первым сайтом связывания и где указанный антиген или антигенная детерминанта и указанная центральная частица взаимодействуют посредством указанной ассоциации, образуя упорядоченную и повторяющуюся антигенную матрицу.

В следующем аспекте данное изобретение относится к композиции вакцины, содержащей композицию, где указанная композиция содержит (a) вирусоподобную частицу и (b) по меньшей мере один антиген или антигенную детерминанту, где указанный антиген или указанная антигенная детерминанта является белком или пептидом IL-5, IL-13 или эотаксина и где указанный по меньшей мере один антиген или антигенная детерминанта связаны с указанной вирусоподобной частицей.

В еще одном аспекте данное изобретение относится к способу получения композиции по п.1, включающему в себя (a) получение вирусоподобной частицы и (b) получение по меньшей мере одного антигена или белка или пептида IL-5, IL-13 или эотаксина; (c) объединение указанной вирусоподобной частицы и указанного по меньшей мере одного антигена или антигенной детерминанты так, чтобы указанный по меньшей мере один антиген или антигенная детерминанта были связаны с указанной вирусоподобной частицей.

В еще одном аспекте данное изобретение относится к способу получения композиции по п.22, включающему в себя (a) получение центральной частицы по меньшей мере с одним первым сайтом связывания; (b) получение по меньшей мере одного антигена или антигенной детерминанты по меньшей мере с одним вторым сайтом связывания, где указанный антиген или антигенная детерминанта является белком или пептидом IL-5, IL-13 или эотаксина и где указанный второй сайт связывания выбран из группы, состоящей из (i) сайта связывания неприродного происхождения с указанным антигеном или антигенной детерминантой и (ii) сайта связывания природного происхождения с указанным антигеном или антигенной детерминантой, и где указанный второй сайт связывания способен к ассоциации с указанным первым сайтом связывания; и (c) объединение указанной центральной частицы и указанного по меньшей мере одного антигена или антигенной детерминанты, где указанный антиген или антигенная детерминанта и указанная центральная частица взаимодействуют посредством указанной ассоциации, образуя упорядоченную и повторяющуюся антигенную матрицу.

В другом аспекте данное изобретение относится к способу иммунизации, включающему в себя введение композиции по п.1 или п.22 или по п.74 животному или человеку.

В следующем аспекте данное изобретение относится к применению композиции по п.1 или п.22 или п.74 для производства лекарственного средства для лечения аллергических заболеваний с эозинофильным компонентом.

В еще одном аспекте данное изобретение относится к применению композиции по п.1 или п.22 или п.74 для приготовления лекарственного средства для терапевтического или профилактического лечения аллергических заболеваний с эозинофильным компонентом, предпочтительно астмы. Кроме того, в еще одном аспекте данное изобретение относится к применению композиции по п.1 или п.22 или п.74 либо отдельно, либо в комбинации с другими агентами, для производства композиции, вакцины, лекарственного средства или медицинского препарата для терапии или профилактики аллергических заболеваний с эозинофильным компонентом, в частности астмы.

Таким образом, изобретение, в частности, относится к композициям вакцин, которые подходят для профилактики и/или ослабления аллергических заболеваний с эозинофильным компонентом или связанных с ними состояний. Изобретение, кроме того, относится к способам иммунизации и вакцинации, соответственно, для профилактики и/или ослабления аллергических заболеваний с эозинофильным компонентом и связанных с ними состояний у животных, в частности у коров, овец и крупного рогатого скота, а также у человека. Композиции согласно изобретению можно использовать профилактически или терапевтически.

В конкретных вариантах изобретение относится к способам профилактики и/или ослабления аллергических заболеваний с эозинофильным компонентом или связанных с ними состояний, которые вызваны или обострены продуктами «собственных» генов, т.е. в используемом в данном описании смысле «аутоантигенами». В родственных вариантах изобретение относится к способам индуцирования иммунологических ответов у животных и человека, соответственно, которые приводят к продукции антител, которые предотвращают и/или ослабляют аллергические заболевания с эозинофильным компонентом или связанные с ними состояния, которые вызваны или обострены продуктами «собственных» генов.

Как будет понятно специалисту в данной области, когда композиции согласно изобретению вводят животному или человеку, они могут быть в композиции, которая содержит соли, буферные вещества, адъюванты или другие вещества, которые требуются для повышения эффективности композиции. Примеры веществ, подходящих для применения при получении фармацевтических композиций, приведены во многих источниках, включая Remington's Pharmaceutical Sciences (Osol, A, ed., Mack Publishing Co. (1990)).

Говорят, что композиции согласно изобретению являются «фармакологически приемлемыми», если может быть допустимо их введение человеку-реципиенту. Кроме того, композиции согласно изобретению будут вводиться в «терапевтически эффективном количестве» (т.е. в количестве, которое дает требуемый физиологический эффект).

Композиции согласно изобретению можно вводить различными способами, известными в данной области, но обычно они будут вводиться путем инъекции, инфузии, ингаляции, перорального введения или другими подходящими физическими способами. Альтернативно композиции можно вводить внутримышечно, внутривенно или подкожно. Компоненты композиций для введения включают стерильные водные (например, физиологический раствор соли) или неводные растворы и суспензии. Примерами неводных растворителей являются пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, такие как оливковое масло, и инъекционные органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Можно использовать носители или окклюзионные повязки, чтобы увеличить проницаемость кожи и усилить абсорбцию антигена.

Другие варианты данного изобретения будут очевидны для специалиста в свете того, что известно в данной области, в свете следующих чертежей, описания изобретения и формулы изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг.1. Экспрессия His-C-IL5 мыши. Экстракты из нерастворимой клеточной фракции, полученной после культивирования pMODC6-IL5/BL21-DE3 либо в присутствии, либо без IPTG, получали, как описано выше. Эквивалентные количества экстрактов наносили на 16% SDS-полиакриламидный гель, подвергали электрофорезу и красили Кумасси голубым. Дорожка M, маркер массы (NEB, предварительно окрашенный маркер широкого диапазона), дорожка 1, экстракт из неиндуцированной культуры; дорожка 2, экстракт из культуры, индуцированной в течение 4 час IPTG.

Фиг.2. SDS-ПААГ-анализ очистки His-C-IL-5 с использованием Ni-NTA. Образцы с различных стадий очистки наносили на 16% SDS-ПААГ и разгоняли при восстанавливающих условиях. Белки красили Кумасси голубым. M, маркер; 1: растворенные тельца включения; 2: проходящий поток (несвязанный материал); 3: промывка 1, pH 6,5; 4: промывка 2, pH 6,5; 5: промывка 3, pH 5,9; 6-8: элюат, pH 4,5; 9: чистый рекомбинантный IL-5 мыши.

Фиг.3. SDS-ПААГ, показывающий очистку рекомбинантного мышиного His-C-IL5. Аликвоты по 5 мкг очищенного мышиного His-C-IL5 разделяли в 16% SDS-полиакриламидном геле либо в присутствии (дорожка 2 слева), либо в отсутствие (3-я дорожка слева) дитиотрейтола. Гель красили на белки Кумасси голубым R-250. Дорожка M содержит маркер массы (NEB, предварительно окрашенный маркер широкого диапазона).

Фиг.4. Влияние His-C-IL-5 на пролиферацию клеток BCL1. Клетки BCL1 инкубировали с ³H-тимидином в присутствии следующих добавок: мышиный IL-5 (30 нг/мл), His-C-IL5, (30 нг/мл); Qβ (200 нг/мл); Qβ, химически перекрестно связанный с неродственным цитокином (200 нг/мл) или Qβ-His-C-IL5 (105 нг/мл). Неразбавленные исходные концентрации указаны в круглых скобках, и из указанных исходных концентраций готовили пятикратные серийные разведения. Включение ³H-тимидина определяли с помощью счета в сцинтилляционной жидкости.

Фиг.5. Анализ реакции связывания с помощью SDS-ПААГ, окрашенного Кумасси голубым. Дорожка M: предварительно окрашенный маркер молекулярной массы; дорожка 1, очищенный His-C-IL-5; дорожка 2, Qβ после дериватизации химическим перекрестно сшивающим агентом SMPH. Дорожка 3, реакционная смесь для связывания; дорожка 4, реакционная смесь для связывания после диализа. Идентификация различных молекулярных образцов в реакционной смеси для связывания приведена на фигуре справа.

Фиг.6. Анализ реакции связывания с помощью Вестерн-блоттинга. Дорожка M: маркер молекулярной массы; дорожка 1, очищенный His-C-IL-5; дорожка 2, Qβ после дериватизации химическим перекрестно сшивающим агентом SMPH. Дорожка 3, реакционная смесь для связывания. Первое антитело для выявления His-C-IL5 представляло собой анти-His-антитело крысы, которое затем инкубировали с антикрысиным антителом, конъюгированным с HRP. Qβ выявляли окрашиванием с использованием кроличьей поликлональной антисыворотки против Qβ, затем конъюгированного с HRP антикроличьего антитела. Идентичные блоты красили, как указано.

Фиг.7. Четырехкратный ELISA. A. Схематичное представление ELISA с ловушкой. Различные компоненты анализа представляют собой 1, антитело козы против IgG кролика; 2, кроличью анти-Qβ поликлональную антисыворотку; 3, либо Qβ-His-C-IL5, Qβ, либо PBS; 4, моноклональное Ат против IL5, TRFK 4 или 5; 5, антитело против IgG мыши-HRP. B. Результаты четверного ELISA. В ELISA определяли способность нейтрализующих моноклональных антител взаимодействовать с His-C-IL5, ковалентно связанным с упорядоченной антигенной матрицей.

Фиг.8. ELISA сыворотки против IL-5. Планшеты для ELISA покрывали His-C-IL5 и инкубировали либо с сывороткой, собранной до иммунизации, либо с сывороткой, собранной на 21 день от мышей, вакцинированных Qβ-His-C-IL5 (4 мыши) или Qβ, смешанным с His-C-IL-5 (5 мышей). Исходное разведение сыворотки составляло 1:50, и осуществляли пятикратные разведения. Связывание специфичных для IL-5 антител регистрировали с использованием антител против IgG мыши, конъюгированных с HRP, и хромогенного субстрата.

Фиг.9. Индукция экспрессии рекомбинантного GST-EK-IL13-C1-His в BL21. Окраска 16% SDS-ПААГ Кумасси голубым. Нагрузка соответствует 0,1 OD₆₀₀ указанных бактериальных лизатов. Экспрессию IL-13-слитого белка индуцировали 0,75 мМ IPTG и образцы анализировали через 4 час в SDS-ПААГ. Примечание: имеет место значительная экспрессия IL-13-слитого белка в бактериях, которые были трансформированы соответствующей плазмидой (pMod-GST-EK-IL13-C1-His) и индуцированы IPTG (см. стрелку).

Фиг.10. Очистка GST-EK-IL13-Cl-His при денатурации. Окраска двух 16% SDS-ПААГ Кумасси голубым. Нагрузка соответствует 5 мкл указанной фракции. IL-13-слитый белок получали из телец включения, растворяли в денатурирующем буфере на основе гуанидин-HCl и наносили на Ni²⁺-агарозную колонку, уравновешенную таким же буфером. Связанные белки элюировали в две стадии при разных pH. На фигуре показан анализ осажденных ТХУ аликвот указанных фракций (№5-№30), элюированных вторым буфером при pH 4,5. Примечание: благодаря C-концевой His-метке IL-13-слитый белок эффективно связывался с Ni²⁺-агарозной колонкой и элюировался при понижении pH.

Фиг.11. Анализ растворимого IL-13-слитого белка после рефолдинга. GST-EK-IL13-C1-His-слитый белок подвергали рефолдингу, как описано в разделе 18D.