Терапевтические агенты, содержащие проапоптозные белки

Терапевтические агенты, содержащие проапоптозные белки

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Данное изобретение заявляет приоритет Предварительной заявки на патент США с регистрационным номером 60/306091, поданной 17 июля 2001 года; Предварительной заявки на патент США с регистрационным номером 60/332886, поданной 6 ноября 2001 года, и Предварительной заявки на патент США с регистрационным номером 60/360361, поданной 28 февраля 2002 года, все из которых включены здесь в качестве ссылки в их полном виде.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение относится к областям клеточной и молекулярной биологии и раковой биологии. Более конкретно, данное изобретение обеспечивает способы и композиции, относящиеся к терапевтическим агентам, содержащим проапоптозную часть молекулы и клеткоспецифическую нацеливающую часть молекулы.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В различных клинических обстоятельствах часто бывает желательной гибель отдельной клетки. Множество путей трансдукции (передачи) сигналов в клетке связаны с ее гибелью и выживанием, и доставка лимитирущего и/или решающего компонента этого пути может повлечь за собой ее разрушение. Классическим примером такого пути трансдукции сигнала является апоптоз, и многочисленные элементы апоптозных путей могли бы служить мишенью клетки в отношении смерти. Апоптоз, или программированная гибель клетки, является фундаментальным процессом, регулирующим нормальный гомеостаз ткани регуляцией баланса между клеточной пролиферацией и гибелью (Vaux et al., 1994; Jacobson et al., 1997).

Сериновая протеаза гранзим В (GrB) (Lobe et al., 1986; Schmid and Weissman, 1987; Trapani et al., 1988) интегрально участвует в апоптозной смерти клеток, индуцированной в клетках-мишенях после их подвергания действию лизосомоподобных цитоплазматических гранул (или цитолитических гранул), обнаруженных в цитотоксических Т-лимфоцитах (CTL) и природных клетках-киллерах (NK) (Henkart, 1985; Young and Cohn, 1986; Amyth and Trapani, 1995). Цитотоксические гранулы лимфоцитов содержат перфорин, образующий поры белок, и семейство сериновых протеаз, называемых гранзимами (таблица 1). Перфорин имеет некоторое структурное и функциональное сходство с белками комплемента С6, С7, С8 и С9, членами комплекса атаки мембраны комплемента (Shinkai et al., 1988). В опосредованном лимфоцитами цитолизе перфорин встраивается в мембраны клетки-мишени и, по-видимому, полимеризуется с образованием пор (Podack, 1992; Yagita et al., 1992), что опосредует доступ гранзима В к цитоплазме клетки-мишени. После вхождения внутрь клетки гранзим В индуцирует апоптоз прямой активацией каспаз и индукцией быстрой фрагментации ДНК (Shi et al., 1992).

ТАБЛИЦА 1ГРАНЗИМЫ (СЕРИНОВЫЕ ПРОТЕАЗЫ ЛИМФОЦИТОВ)
Название	Вид	Другие названия	Активность фермента
А	МышьКрысаЧеловек	Фактор Hanukah, MTSP, SE-1, CTLA-3RNKP-2, фрагментин 1Фактор Hanukah, HTSP, гранзим 1	Триптаза

В	МышьКрысаЧеловек	ССР-1, CTLA-1Фрагментин 2, RNKP-1HLP, гранзим 2, HSE26.1, CSPB	Asp-аза
С	МышьКрыса	ССР-2RNKP-4	Неизвестна
D	Мышь	ССР-5	Неизвестна
Е	Мышь	ССР-3, MCSP2	Неизвестна
F	Мышь	ССР-4, MCSP3	Неизвестна
G	Мышь	MCSP1	Неизвестна
Н	Человек	ССР-Х, CSP-C	Химаза
I	Крыса	GLP I и II	Неизвестна
J	Крыса	RNKP-5	Неизвестна
К	КрысаЧеловек	Триптаза 2, фрагментин 3Гранзим 3	ТриптазаТриптаза
М	КрысаЧеловек	RNK-Met-1Met-аза	Met-аза

Гранзимы являются структурно родственными, но имеют различающееся субстратное предпочтение. Посредством его уникальной способности расщеплять после остатков аспартата, гранзим В может расщеплять многие прокаспазы in vitro и является важным инструментом в анализе созревания каспазы-3 (Darmon et al., 1995; Quan et al., 1996; Martin et al., 1996), каспазы-7 (Chinnaiyan et al., 1996; Gu et al., 1996; Fernandes-Alnemri et al., 1995), каспазы-6 (Orth et al., 1996; Fernandes-Alnemri et al., 1995), каспазы-8 (Muzio et al., 1996), каспазы-9 (Duan et al., 1996) и каспазы-10a/b (Fernandes-Alnemri et al., 1996; Vincenz and Dixit, 1997). Кроме того, он является высокотоксичным в отношении клеток-мишеней (Shi et al., 1992). До сих пор предполагалось, что гранзим В убивает клетки прямым активируемым каспазой разрушением, дополненным при определенных обстоятельствах прямым повреждением находящихся далее по ходу процесса каспазных субстратов (Andrade et al., 1998). Получив доступ к цитозолю, гранзим В быстро перемещается в ядро (Jans et al., 1996; Trapani et al., 1996) и может расщеплять поли(АДФ-рибоза)-полимеразу и антиген ядерного матрикса, иногда с использованием сайтов расщепления, отличающихся от сайтов расщепления, предпочтительных для каспаз (Andrade et al., 1998). Хотя многие прокаспазы эффективно расщепляются in vitro, индуцируемая гранзимом В активация каспазы происходит иерархическим образом в интактных клетках, начинаясь на уровне каспаз-палачей, таких как каспаза-3, за которой следует каспаза-7 (Yang et al., 1998). Это отличается от FasL-опосредованного лизиса, который основан на мембранном сигнале, генерируемом через апикальные каспазы, такие как капсаза-8 (Muzio et al., 1996; Sarin et al., 1997). Кроме того, некоторые исследования показали, что гранзим В может также индуцировать гибель клеток посредством независимого от капсаз механизма, который включает в себя прямое повреждение неядерных структур, хотя ключевые субстраты в этом пути до сих пор еще не были выяснены (Sarin et al., 1997; Trapani et al., 1998; Heibein et al., 1999; Beresford et al., 1999).

Исследования Froelich et al. предполагают, что GrB интернализуется посредством опосредованного рецепторами эндоцитоза и что роль перфорина заключается в опосредовании высвобождения гранзима В из образующихся при эндоцитозе пузырьков. Фактически, перфорин может быть заменен другими разрушающими пузырьки факторами, такими как продуцируемые аденовирусом (Froelich et al., 1996; Pinkoski et al., 1998; Browne et al., 1999).

Гранзимы обычно являются высоко гомологичными, имеющими 38-67% гомологию относительно GrB (Haddad et al., 1991), и они содержат каталитическую триаду (His-57, Asp-102 и Ser-195) сериновых протеаз семейства трипсина. Другие признаки включают в себя зрелую N-концевую Ile-Ile-Gly-Gly-последовательность, три или четыре дисульфидных мостика и консервативный мотив (PHSRPYMA), который имеется также в катепсине G нейтрофилов и химазах мастоцитов. Углеводные части молекул гранзимов являются Asn-связанными (Griffiths and Izaaz, 1993). мРНК-транскрипты гранзимов транслируются в виде пре-про-протеаз. Пре- или лидерная последовательность отщепляется сигнальной пептидазой в эндоплазматической сети. После удаления пропептидов неактивные програнзимы (зимогены) становятся активными протеазами. Пропептидные последовательности гранзимов начинаются после лидерного пептида и заканчиваются перед N-концевым Ile, необходимым для укладки (фолдинга) этой протеазы в каталитическую конформацию (Kam et al., 2000).

Среди различных апоптозных факторов, идентифицированных до сих пор, наиболее хорошо определенными регуляторами этого пути гибели клеток являются члены семейства Bcl-2. Некоторые члены семейства Bcl-2, в том числе Bcl-2, Bcl-XL, Ced-9, Bcl-w и т.д., способствуют выживанию клеток, тогда как другие члены, в том числе Вах, Bcl-Xs, Bad, Bak, Bid, Bik и Bim, как было показано, делают возможным апоптоз (Adams and Cory, 1998). К настоящему времени был предложен ряд различных гипотез, касающихся возможных биологических функций членов семейства Bcl-2. Они включают в себя образование димеров (Oltvai et al., 1993), протеазную активацию (Chinnaiyan et al., 1996), деполяризацию митохондриальных мембран (6), генерирование промежуточных активных форм кислорода (Hockenbery et al., 1993), регуляцию поступления кальция в клетки (Lam et al., 1994; Huiling et al., 1997) и образование пор (Antonsson et al., 1997; Marzo et al., 1998).

Bax, стимулирующий гибель член массой 21 кДа семейства Bcl-2, был сначала идентифицирован как белок, который коиммунопреципитировался с Bcl-2 из различных клеточных линий (Oltvai et al., 1993). Сверхэкспрессия Bax ускоряет гибель клеток в ответ на большой диапазон цитотоксических воздействий. Определение аминокислотной последовательности белка Вах показало, что она является высокогомологичной аминокислотной последовательности Bcl-2. Ген Вах состоит из шести экзонов и продуцирует альтернативные транскрипты, преобладающая форма которых кодирует мРНК 1,0 т.п.н. и названа Вахα. Подобно Bcl-2 и нескольким другим членам семейства Bcl-2, белок Вах имеет высококонсервативные области, домены ВН1, ВН2 и ВН3, и анализ гидрофобности последовательностей этих белков показывает присутствие гидрофобного трансмембранного сегмента на их С-концевых сторонах (Oltvai et al., 1993).

Вах широко экспрессируется без какой-либо видимой тканеспецифичности. Однако, после индукции апоптоза Вах перемещается в митохондрии, приводя к дисфункции митохондрий и высвобождению цитохрома с, который затем активирует пути каспаз (Hsu and Youle, 1997; Wolter et al., 1997; Gross et al., 1998). Этот процесс перемещения является быстрым и происходит на ранней стадии апоптоза (Wolter et al., 1997). Селективная сверхэкспрессия Вах при раке яичника человека переносом (трансфекцией) аденовирусного гена приводила к значительному лизису опухолевых клеток in vivo (Tai et al., 1999). Сверхэкспрессия гена Вах бинарной аденовирусной системой в культивируемых клеточных линиях из злокачественной опухоли легкого человека приводит к активации каспазы, индукции апоптоза и подавлению роста клеток. Кроме того, внутриопухолевая инъекция аденовирусного вектора, экспрессирующего ген Вах, подавляла рост ксенотрансплантатов злокачественной опухоли легкого человека, установившегося в «голых» мышах (Kagawa et al., 2000; Kagawa et al., 2000).

WO 99/45128 и Aqeilan et al., (1999) описывают химерные белки, имеющие нацеливающую на определенные клетки специфичность и апоптозиндуцирующую активность, в частности, рекомбинантный химерный белок IL-2-Вах, который специфически нацелен на IL-2-экспрессирующие клетки и индуцирует клеткоспецифический апоптоз.

WO 99/49059 относится к химерному токсину, состоящему из гонадолиберина (рилизинг-фактора гонадотропина) (GnRH) и экзотоксина А Pseudomonas (РЕ), для обнаружения связанного с опухолью эпитопа, экспрессируемого аденокарциномой человека.

WO 97/46259 относится к нацеленным химерным токсинам, содержащим нацеливающие на клетки части молекул и убивающие клетки части молекул, нацеленных на опухолевые клетки. В конкретном примере этот химерный токсин содержит гомологи гонадолиберина (рилизинг-фактора гонадотропина) и экзотоксин А Pseudomonas.

WO 97/22364 описывает нацеленное лечение аллергических реакций, посредством которого химерный цитотоксин Fc_2'-3-PE₄₀ направляется на нацеленную элиминацию клеток, экспрессирующих рецептор FceRI.

Хотя некоторые композиции химерных белков были описаны, требуются другие способы и композиции для улучшенных способов терапии, включающих в себя лизис клеток.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение относится к способам и композициям, участвующим в доставке химерных полипептидов, содержащих факторы пути трансдукции сигнала, которые индуцируют гибель клетки-мишени. В предпочтительном варианте этот фактор является проапоптозным фактором.

Почти все клетки содержат механизмы, ответственные за опосредование смерти клеток (апоптоза). Таким образом, в некоторых вариантах данное изобретение относится к доставке определенных проапоптозных белков, которые являются центральными медиаторами этого эффекта, во внутреннее пространство клеток-мишеней, что будет приводить к смерти клеток посредством апоптозных механизмов. Индуцирующая апоптоз часть молекулы индуцирует программированную гибель клеток после вхождения в клетку-мишень этого химерного полипептида, который доставляется для связывания с клеткой-мишенью посредством клеткоспецифической нацеливающей части молекулы. В некоторых вариантах данного изобретения и в качестве преимущества над известными в данной области способами, проапоптозные полипептиды доставляются в виде белков, а не в виде молекул нуклеиновых кислот, подлежащих трансляции для продуцирования желаемых полипептидов. В качестве дополнительного преимущества, в химерных полипептидах данного изобретения используются последовательности человека во избежание любых нежелательных иммунных реакций на чужеродный полипептид.

В дополнительных вариантах гранзим А или гранзим В является медиатором для индукции апоптоза. В конкретных вариантах, части рекомбинантный лиганд (VEGF) и/или рекомбинантное антитело (scFvMEL) сливают в виде последовательностей нуклеиновых кислот с последовательностями, которые кодируют гранзим или член семейства Bcl-2. Авторы изобретения представляют здесь данные, демонстрирующие, что химерные полипептиды, такие как гранзим В-vegf121 и гранзим В-scFvMEL, являются цитотоксичными для клеток-мишеней. При условии, что специалисту с квалификацией в данной области известно, что имеются многочисленные подобные нацеливающие на клетку и проапоптозные примеры, которые могут быть использованы взаимозаменяемо с приведенными здесь конкретными примерами, это указывает на то, что конструкции, содержащие проапоптозные белки, имеют существенный терапевтический потенциал для лечения патологических состояний и представляют новый класс терапевтических агентов с новым механизмом действия.

В варианте, в котором проапоптозные белки используют в качестве убивающей части молекулы в химерных белках, используют рекомбинантное антитело (scFvMEL), которое связывается с антигеном клеточной поверхности gp240 клеток меланомы и эффективно интернализуется. Авторы данного изобретения слили гены, кодирующие scFvMEL, с генами, кодирующими Вах, укороченный Вах1-5 и Вах 345, соответственно (названные как scFvMEL-bax, scFvMEL-Bax1-5 и scFvMEL-Bax345, соответственно). Эти гены встраивали в векторы экспрессии белка и трансформировали в бактерии. Слитые белки очищали, испытывали против клеток-мишеней в культуре, и было показано, что они являются цитотоксичными в отношении клеток-мишеней. Это предполагает, что конструкции, содержащие проапоптозный белок Вах, имеют значительный терапевтический потенциал для лечения заболеваний и представляют новый класс терапевтических агентов с новым механизмом действия.

Одним из объектов данного изобретения является химерный полипептид, содержащий клеткоспецифическую нацеливающую часть молекулы и фактор пути трансдукции сигнала.

Другим объектом данного изобретения является химерный полипептид, содержащий клеткоспецифическую нацеливающую часть молекулы и индуцирующий апоптоз фактор, где указанный индуцирующий апоптоз фактор является гранзимом. В особом варианте гранзим является гранзимом В. В другом особом варианте аминокислотная последовательность указанного гранзима В выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO:11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15 и SEQ ID NO:16. В другом специфическом варианте аминокислотная последовательность указанного гранзима В является SEQ ID NO:60, дополнительно содержащая N-концевое удлинение SEQ ID NO:61, или SEQ ID NO:60, в которой отсутствуют первые двадцать аминокислот. В следующем специфическом варианте аминокислотная последовательность указанного гранзима В является по меньшей мере 100 смежными аминокислотами из SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 или SEQ ID NO:60. В следующем специфическом варианте аминокислотная последовательность указанного гранзима В является по меньшей мере 75 смежными аминокислотами из SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 или SEQ ID NO:60. В следующем специфическом варианте аминокислотная последовательность указанного гранзима В является по меньшей мере 40 смежными аминокислотами из SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 или SEQ ID NO:60. В дополнительном особом варианте указанный гранзим является гранзимом А. В следующем конкретном варианте аминокислотная последовательность указанного гранзима А выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24 и SEQ ID NO:25. В следующем специфическом варианте аминокислотная последовательность указанного гранзима А является по меньшей мере 100 смежными аминокислотами из SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24 или SEQ ID NO:25. В следующем специфическом варианте аминокислотная последовательность указанного гранзима А является по меньшей мере 75 смежными аминокислотами из SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24 или SEQ ID NO:25. В следующем специфическом варианте аминокислотная последовательность указанного гранзима А является по меньшей мере 40 смежными аминокислотами из SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24 или SEQ ID NO:25. В дополнительном специфическом варианте клеткоспецифической нацеливающей частью молекулы является цитокин, антитело, лиганд или гормон. В следующем специфическом варианте этот лиганд является VEGF. В следующем специфическом варианте VEGF является vegf121. В другом специфическом варианте антитело является одноцепочечным антителом. В следующем специфическом варианте одноцепочечное антитело является scFvMEL. В дополнительном специфическом варианте гранзим является гранзимом В, а указанная клеткоспецифическая нацеливающая часть молекулы является vegf121. В другом специфическом варианте гранзим является гранзимом В, а указанная клеткоспецифическая часть молекулы является scFvMEL. В дополнительном конкретном варианте этот полипептид дополнительно содержит линкер, такой как SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51 или SEQ ID NO:52. В специфическом варианте этот полипептид кодируется рекомбинантным полинуклеотидом.

Следующим объектом данного изобретения является экспрессирующая кассета, содержащая полинуклеотид, кодирующий химерный полипептид, содержащий клеткоспецифическую нацеливающую часть молекулы и индуцирующий апоптоз фактор, где указанный индуцирующий апоптоз фактор является гранзимом и где указанный полинуклеотид находится под контролем регуляторной последовательности, функциональной в клетке-хозяине. В конкретных вариантах этот гранзим является гранзимом А или гранзимом В. В специфическом варианте гранзим А кодируется полинуклеотидом SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27 или SEQ ID NO:28. В другом специфическом варианте гранзим В кодируется полинуклеотидом SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21 или SEQ ID NO:22. В дополнительном специфическом варианте эта кассета содержится в рекомбинантном вирусном векторе, таком как аденовирусный вектор, аденоассоциированный вектор или ретровирусный вектор.

Дополнительным объектом данного изобретения является клетка-хозяин, содержащая экспрессирующую кассету, содержащую полинуклеотид, кодирующий химерный полипептид, содержащий клеткоспецифическую нацеливающую часть молекулы и индуцирующий апоптоз фактор, где указанный индуцирующий апоптоз фактор является гранзимом. В конкретных вариантах эта клетка дополнительно определяется как прокариотическая клетка-хозяин или эукариотическая клетка-хозяин.

Другим объектом данного изобретения является способ применения клетки-хозяина, содержащей экспрессирующую кассету, содержащую полинуклеотид, кодирующий химерный полипептид, содержащий клеткоспецифическую нацеливающую часть молекулы и индуцирующий апоптоз фактор, где указанный индуцирующий апоптоз фактор является гранзимом, предусматривающий культивирование этой клетки-хозяина в условиях, подходящих для экспрессии химерного полипептида.

Следующим объектом данного изобретения является способ индукции апоптоза в клетке, предусматривающий введение в указанную клетку эффективного количества химерного полипептида, содержащего клеткоспецифическую нацеливающую часть молекулы и гранзим. В конкретных вариантах этот гранзим является гранзимом А или гранзимом В. В специфических вариантах эта клетка находится in vivo и/или в человеке. Другим объектом данного изобретения является способ индукции апоптоза в клетке, предусматривающий введение в указанную клетку эффективного количества химерного полипептида, содержащего клеткоспецифическую нацеливающую часть молекулы и гранзим, где указанная клеткоспецифическая нацеливающая часть молекулы является scFvMEL, а указанный гранзим является гранзимом В. Предполагается, что клеткоспецифическая нацеливающая часть молекулы действует посредством нацеливания на специфические клетки, например, на клетки, которые экспрессируют на своей поверхности пептид или полипептид, который способен специфически связывать эту нацеливающую часть молекулы. Соединение, которое обеспечивает специфическое нацеливание на клетку, может называться мишенью. Таким образом, в некоторых вариантах данного изобретения клетки могут иметь мишень, которую узнает клеткоспецифическая нацеливающая часть молекулы.

Другим объектом данного изобретения является способ индукции апоптоза в клетке, предусматривающий введение в указанную клетку эффективного количества химерного полипептида, содержащего клеткоспецифическую нацеливающую часть молекулы и гранзим, где указанная клеткоспецифическая нацеливающая часть молекулы является vegf121, а указанный гранзим является гранзимом В.

Дополнительным объектом данного изобретения является способ индукции апоптоза в клетке, предусматривающий введение в указанную клетку эффективного количества химерного полипептида, содержащего клеткоспецифическую нацеливающую часть молекулы и проапоптозный член семейства Bcl-2. В специфическом варианте проапоптозный член семейства Bcl-2 является Вах или его фрагмент. В специфических вариантах эта клетка находится in vivo и/или в человеке. В специфическом варианте фрагмент Вах лишен по меньшей мере части полипептида, кодируемой экзоном 6 в последовательности полинуклеотида Вах.

Другим объектом данного изобретения является способ индукции апоптоза в клетке, предусматривающий введение в указанную клетку эффективного количества химерного полипептида, содержащего клеткоспецифическую нацеливающую часть молекулы и проапоптозный член семейства Bcl-2, где указанная клеткоспецифическая нацеливающая часть молекулы является scFvMEL, а указанный проапоптозный член семейства Bcl-2 является Вах или фрагментом Вах. В специфическом варианте фрагмент Вах лишен по меньшей мере части экзона 6 в последовательности полинуклеотида Вах.

Дополнительным объектом данного изобретения является способ лечения заболевания в индивидууме, предусматривающий стадии введения указанному индивидууму терапевтически эффективного количества композиции, содержащей химерный полипептид, содержащий индуцирующую апоптоз часть молекулы и клеткоспецифическую нацеливающую часть молекулы; и фармацевтический носитель. В специфическом варианте фармацевтический носитель содержит липид. В другом специфическом варианте указанным заболеванием является злокачественная опухоль, диабет, артрит или воспалительное заболевание кишечника, атеросклероз или диабетическая ретинопатия. В дополнительном конкретном варианте это заболевание является злокачественной опухолью. В другом конкретном варианте индуцирующая апоптоз часть молекулы является гранзимом. В дополнительноом конкретном варианте этот гранзим является гранзимом В или его фрагментом. В следующем конкретном варианте индуцирующей апоптоз частью молекулы является проапоптозный член семейства Bcl-2. В другом конкретном варианте проапоптозный член семейства Bcl-2 является Вах или его фрагментом. В следующем конкретном варианте фрагмент Вах лишен по меньшей мере части полипептида, кодируемой экзоном 6 в последовательности полинуклеотида Вах. В другом конкретном варианте фрагмент Вах лишен по меньшей мере части полипептида, кодируемого экзонами, выбранными из группы, состоящей из экзонов 4, 5 и 6. В следующем конкретном варианте введение выполняют внутривенной инъекцией. В другом конкретном варианте введение выполняют ингаляцией. В следующем конкретном варианте введение осуществляют внутривенно, внутрикожно, внутриартериально, внутрибрюшинно, введением в очаг повреждения, интракраниально, внутрисуставно, введением в предстательную железу, внутриплеврально, внутритрахеально, интраназально, введением в стекловидное тело, внутривлагалищно, интраректально, внутриопухолевым введением, внутримышечно, внутрибрюшинно, подкожно, субконъюнктивально, внутрипузырно, через слизистую оболочку, интраперикардиально, интраумбиликально, внутриглазно, перорально, местным введением, локальным введением, посредством ингаляции (например, арозольной ингаляции), посредством инъекции, посредством инфузии, посредством непрерывной инфузии, посредством локализованной перфузии с непосредственным омыванием клеток-мишеней, через катетер, через лаваж, в виде крема или в виде липидной композиции. В конкретном варианте этот способ дополнительно предусматривает введение указанному индивидууму противовоспалительной композиции, проведение химиотерапии, хирургического вмешательства, облучения, гормональной терапии или генотерапии.

Предполагается, что аспекты данного изобретения, обсуждаемые в контексте одного варианта данного изобретения, могут использоваться в отношении любых других вариантов изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Следующие фигуры образуют часть данного описания и включены для дополнительной демонстрации определенных аспектов данного изобретения. Данное изобретение может быть лучше понято при ссылке на один или несколько из этих фигур в комбинации с подробным описанием конкретных представленных здесь вариантов.

Фиг.1 иллюстрирует кДНК пред-зрелого гранзима В человека из клеток Hut78. Электрофорез в 1% агарозном геле демонстрирует кДНК пред-зрелого гранзима В человека, синтезированного из клеток Hut78 при помощи ОТ-ПЦР. Дорожка 1 представляет молекулярный маркер низкомолекулярных ДНК; дорожка 2 представляет контрольную синтезированную кДНК (˜500 п.н.); дорожка 3 представляет контроль без ОТ; и дорожка 4 представляет кДНК пред-зрелого гранзима В (˜800 п.н.).

Фиг.2 показывает нуклеотидную последовательность, кодирующую пред-зрелый гранзим В человека (SEQ ID NO:54) и аминокислотную последовательность (SEQ ID NO:55).

Фиг.3 иллюстрирует конструирование слитых конструкций рЕТ32GrB-vegf121 и рЕТ32GrB-scFvMEL. Конструирование этих слитых конструкций основано на способе ПЦР. Фиг.3А показывает конструирование рЕТ32GrB-vegf121. Фиг.3В показывает конструирование рЕТ32GrB-scFvMEL. Полноразмерные гены лигировали в сайт XbaI/XhoI экспрессирующего вектора рЕТ-32а(+).

Фиг.4 демонстрирует предсказанную структуру рекомбинантных слитых белков гранзим В-vegf121 Фиг.(4А) и гранзим B-scFvMEL Фиг.(4В) в векторе рЕТ32а, экспрессируем в E. coli, и последовательности гранзим В-vegf121 (фиг.4С и 4D) (SEQ ID NO:56 для последовательности нуклеиновой кислоты и SEQ ID NO:57 для аминокислотной последовательности), гранзим В-scFvMEL (фиг.4Е и 4F) (SEQ ID NO:58 для последовательности нуклеиновой кислоты и SEQ ID NO:59 для аминокислотной последовательности). Вектор рЕТ32а(+) содержит промотор Т7 для высокопродуктивной экспрессии. Экспрессия этой нуклеиновой кислоты включает в себя последовательность, содержащую Trx.tag, за которой следуют Hic.tag, сайт расщепления тромбином и сайт расщепления энтерокиназой для конечного удаления метки (tag) очистки белка.

Фиг.5 показывает анализ электрофорезом в ДСН-ПААГ экспрессии этих слитых белков с окрашиванием Кумасси синим электрофореза в ДСН-ПААГ слитого белка гранзим В-vegf121 (фиг.5А) и слитого белка гранзим В-scFvMEL (фиг.5В) при восстанавливающих условиях. Панель А фиг.5А показывает окрашивание Кумасси синим электрофореза в ДСН-ПААГ слитого белка гранзим В-vegf121. Дорожка 1 показывает неиндуцированные лизаты общих клеток; дорожка 2 показывает индуцированные лизаты общих клеток; дорожка 3 показывает неиндуцированный растворимый материал; дорожка 4 показывает индуцированный растворимый материал; дорожка 5 показывает неиндуцированный нерастворимый материал; дорожка 6 показывает индуцированный нерастворимый материал; дорожка 7 показывает молекулярные маркеры белков. На панели В дорожка 1 показывает молекулярные маркеры белков; дорожка 2 показывает про-гранзим В-vegf121 (IMAC-элюат из Talon Resin); дорожка 3 показывает про-гранзим В-vegf121 (Imac-элюат из Nickel NTA), дорожка 4: Гранзим В-vegf121 (после разрезания rEK). На фиг.5В показано окрашивание Кумасси синим электрофореза в ДСН-ПААГ гранзим В-scFvMEL. На панели С дорожка 1 показывает молекулярные маркеры белков; дорожка 2 показывает неиндуцированные лизаты общих клеток; дорожка 3 показывает индуцированные лизаты общих клеток; дорожка 4 показывает неиндуцированный растворимый материал; дорожка 5 показывает индуцированный растворимый материал; дорожка 6 показывает неиндуцированный нерастворимый материал; дорожка 7 показывает индуцированный нерастворимый материал. На панели Д дорожка 1 показывает молекулярные маркеры белков; дорожка 2 показывает про-гранзим В-scFvMEL(IMAC-элюат из Nickel NTA); дорожка 3 показывает гранзим В-scFvMEL (после разрезания rEK).

Фиг.6 демонстрирует Вестерн-блот-анализ слитых белков гранзим В-vegf121 и гранзим В-scFvMEL.

Фиг.7 показывает активность связывания scFvMEL-части молекулы слитого белка гранзим В-scFvMEL. ELISA различных слитых белков scFvMEL выполняли на планшете, предварительно покрытом белком L.

Фиг.8 демонстрирует испытание цитотоксичности гранзим В-vegf121 против клеток log-фазы РАЕ-Flk-1 и РАЕ-Flt-1.

Фиг.9 демонстрирует испытание цитотоксичности гранзим В-scFvMEL на клетках А375-М.

Фиг.10 иллюстрирует ген Вах человека, его экзоны и домены ВН1, ВН2 и ВН3.

Фиг.11 демонстрирует клонирование кДНК Вах человека из клеток Namalwa при помощи ПЦР. Дорожка 1: маркеры низкомолекулярных ДНК, дорожки 2-6: Синтезированная контролем кДНК (˜500 п.н.), дорожки 7-8: кДНК Вах человека (˜580 п.н.) с использованием случайного праймера (дорожка 7) и с использованием олиго(dT)праймера (дорожка 8).

Фиг.12А и 12В иллюстрируют конструирование scFvMEL-bax-родственных конструкций.

Фиг.13 показывает анализ электрофорезом в ДСН-ПААГ и окрашиванием Кумасси синим экспрессии этих слитых белков.

Фиг.14 показывает экспрессию рЕН32-scFvMEL-bax и рЕТ32-Bax-scFvMEL, трансформированных в E. coli AD494(DE3)pLysS, и при IPTG-индукции.

Фиг.15 демонстрирует Вестерн-блоттинг-анализ экспрессии полноразмерных белков bax и Вах-scFvMEL. Дорожка 1: pBad/HisA (отрицательный контроль), дорожка 2: pBad/HisLacZ (положительный контроль экспрессии), дорожки 3-5: белок Bax (дорожка 3: экспрессия в среде RM+глюкоза+ампициллин, дорожка 4: экспрессия в RM+ампициллин, дорожка 5: экспрессия в среде LB+ампициллин), дорожки 6-8: белок Вах-scFvMEL (дорожка 6: экспрессия в среде RM+глюкоза+ампициллин, дорожка 7: экспрессия в RM+ампициллин, дорожка 8: экспрессия в среде LB+ампициллин).

Фиг.16А и 16В демонстрируют активность связывания scFvMEL-части слитых белков.

Фиг.17 показывает цитотоксичность слитых белков scFvMEL-bax345 и Bax345-scFvMEL на А375-М.

Фиг.18 показывает ELISA слитого белка гранзим В-Vegf121 на различных клеточных линиях (детектируемых с мышиным анти-vegf121-антителом и мышиным анти-гранзим В-антителом).

Фиг.19 демонстрирует цитотоксичность Гранзим В-VEGF121 на трансфицированных эндотелиальных клетках.

Фиг.20 показывает анализ цитотоксичности гранзим В-Vegf121 в сравнении с vegf121-rgel in vitro против клеток РАЕ/FLK-1.

Фиг.21 иллюстрирует активность каспазы на клетках РАЕ, обработанных слитым белком Гранзим В-Vegf121.

Фиг.22 демонстрирует высвобождение цитохрома с клеток РАЕ, обработанных GRB/VEGF121.

Фиг.23 показывает перемещение Вах клеток РАЕ после обработки GRB/VEGF121.

Фиг.24 иллюстрирует высвобождение цитохрома с в А375-М, обработанных GRB/scFvMEL, в сравнении с клетками SKBR3-HP.

Фиг.25 показывает, что GrB/VEGF121 индуцирует образование лесенки ДНК на клетках РАЕ/flk-1.

Фиг.26 показывает ELISA GrB/scFvMEL на положительных в отношении антигена gp240 клетках А375-М в сравнении с отрицательными в отношении антигена gp240 клетками Т-24 с детектированием с использованием мышиных mAb против GrB.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Другие цели, признаки и преимущества данного изобретения станут очевидными из следующего подробного описания. Однако, должно быть понятно, что это подробное описание и конкретные примеры, хотя они и показывают предпочтительные варианты данного изобретения, даются только в качестве иллюстрации, поскольку различные изменения и модификации в пределах сущности и объема данного изобретения будут очевидными специалистам с квалификацией в данной области из этого подробного описания.

В применении в описании здесь артикли "а" или "an" обозначают один или несколько. В применении здесь в формуле изобретения, при использовании вместе со словом "содержащие" слова "a" или "an" могут означать один или более, чем один. В применении здесь термин «другой» может означать по меньшей мере второй или более.

Термин "апоптоз" в данном контексте определяется как программированная гибель клеток; эндогенная программа смерти клетки приводит к смерти этой клетки.

Термин "цитокин" в данном контексте определяется как агент, произведенный клеткой, который влияет на поведение другой клетки. В конкретном варианте этот агент является полипептидом. Например, цитокины, произведенные лимфоцитами, часто называют лимфокинами или интерлейкинами (IL). Кроме того, цитокины действуют на специфические рецепторы цитокинов на клетках, на которые они воздействуют. В специфическом варианте, термин "цитокин" включает в себя факторы роста.

Термин "гранзим" в данном контексте определяется как фермент из гранул цитотоксических лимфоцитов, который, после вхождения в цитозоль клетки, индуцирует апоптоз и/или фрагментацию ядерной ДНК. В конкретном варианте этот гранзим является сериновой протеазой лимфоцитов. В некоторых вариантах гранзим является полноразмерным, тогда как в других вариантах гранзим является частичным.

Термин "фактор пути передачи сигнала" в данном контексте определяется как фермент, субстрат, кофактор или другой белок, который влияет на биологическую активность другого фермента, кофактора или белка. В специфическом варианте этот фактор ассоциирован с опосредованной рецепторами передачей сигнала из пространства снаружи от клеточной мембраны для модуляции реакции роста в клетке. В одном варианте реакция роста, которая модулируется, является положительной реакцией роста. В альтернативном варианте, реакция роста, которая модулируется, является отрицательной реакцией роста, такой как индукция апоптоза.

Данное изобретение относится к химерным белкам со свойствами нацеливающей на определенные клетки специфичности и деструкции клеток, такими как свойства из путей передачи сигнала, связанных прямо или опосредованно с индуцирующими апоптоз активностями. В некоторых вариантах разрушающие клетки части молекул являются индуцирующими апоптоз активностями. Химерные белки данного изобретения состоят из клеткоспецифической нацеливающей части молекулы и индуцирующей апоптоз части молекулы. Клеткоспецифическая нацеливающая часть молекулы обеспечивает клеткоспецифические связывающие свойства химерному белку, тогда как индуцирующая апоптоз часть молекулы индуцирует программированную гибель клеток после вхождения в клетку-мишень. В некоторых вариантах химерные белки данного изобретения доставляются в виде полипептидов и продуцируются рекомбинантной экспрессией слитого полинуклеотида между кодирующей последовательностью нацеливающей на клетку частью молекулы и кодирующей последовательностью индуцирующего апоптоз белка. Такие химерные белки, по-видимому, превосходят иммунотоксины, используемые в настоящее время в данной области, так как они имеют человеческое происхождение и, следовательно, имеют, как ожидается, уменьшенную иммуногенность в реципиенте-человеке. Кроме того, химерные белки убивают клетки-мишени индукцией апоптоза, который не вызывает высвобождения клеточных органелл во внеклеточную среду с образованием воспалительной реакции. Когда клетки гибнут по механизму апоптоза, они сморщиваются и конденсируются, но органеллы и плазматические мембраны сохраняют их целостность, и мертвые клетки бысто подвергаются фагоцитозу соседними клетками или макрофагами до утечки содержимого этих клеток, вызывая вследствие этого минимальную тканевую или системную реакцию.

Данное изобретение относится также к фармацевтическим композициям этих химерных белков, способам получения таких белков и способам применения их in vitro и in vivo, в частности, для элиминации специфических нежелательных клеток-мишеней и для лечения различных патологических состояний, а также для применения этих белков для диагностики заболеваний.

В данном изобретении описаны способы и композиции, касающиеся нацеленной деструкции клетки, использующие химерный полипептид. Химерный полипептид состоит по меньшей мере из двух частей молекулы: одной частью является эффективный компонент для лизиса данной клетки; второй частью молекулы является компонент доставки химерного полипептида для на