Целенаправленная химиотерапия опухолей половых органов

Целенаправленная химиотерапия опухолей половых органов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к новым соединениям на основе эстрогенов и антиэстрогенов, пригодным в качестве химиотерапевтических агентов против опухолей, к способам их получения и к их применению для лечения заболеваний, особенно рака.

Здоровые клетки, раковые клетки и клетки метастазов половых органов содержат рецепторы эстрогенов (= цитоплазматические белки), смотри "The nuclear recepnor ligand-binding domain: structures and function" in Curr. Opin. Cell Biol. 10, 384-391 (1998). OH группы половых гормонов обладают способностью связываться с рецепторами эстрогенов, поэтому природные и синтетические женские половые гормоны (эстрогены) и их антагонисты (антиэстрогены) обладают сродством к тканям половых органов (молочной железы, матки, яичников, предстательной железы).

Рецепторы эстрогенов особенно сильно накапливаются в раковых клетках опухолей половых органов, например в опухолях молочной железы и их метастазах (Е.V.Angerer. The estrogen receptor as a target for rational drug design, pages 5, 49 and 137, Springer-Verlag, Heidelberg, 1995). Ранее были предприняты попытки использовать рецепторы эстрогенов в качестве мишеней для активных агентов посредством связывания, например, природного женского полового гормона эстрадиола или синтетического гормона диэтилстилбестрола с активной группой, например, с группой, имеющей нефункциональный азот, в надежде, что молекула на основе эстрогена будет переносить в опухоль активную группу, которая затем сможет уничтожить опухоль (G.Leclercq. Breast Cancer - Experimental and Clinical Aspects, 287-293, Pergamon, Oxford, 1980; H.Hamacher. Potentielle Antineoplastika III, Arch. Pharm. 311, 184-195, Verlag Chemie, Weinheim, 1978). Однако все эти попытки не имели успеха.

В разработке активных агентов против опухолей половых органов человека, для того чтобы можно было достичь действительно значимых результатов испытаний, необходима животная модель, близкородственная опухолям человека. Известные "опухоли Хаггинса" (С.Huggins et al., Rapid induction of mammary carcinoma in the rat and the influence of hormones, J. Exper. Med. 109, 25 (1959)) можно легко генерировать и подавлять, например, при помощи эндокринных манипуляций и обычной химиотерапии (например Эндоксаном^® = моногидратом циклофосфамида). В противоположность этому, для индукции опухолей, генерированных бензидином, у самок крыс линии Wistar, требуется больше времени, и они являются (также как опухоли молочной железы человека) только на приблизительно 50% гормонозависимыми; на них (также как на опухоли молочной железы человека) невозможно эффективно воздействовать посредством химиотерапии и других методов лечения, известных в данной области техники. Следовательно, мы нашли требуемую подходящую животную модель на крысах линии Wistar с опухолями молочной железы, индуцированными бензидином.

Неожиданно обнаружено, что эстрогены и антиэстрогены, несущие диалкилтриазенильные группы, после применения на крысах с опухолями молочной железы вызывают их перерождение. Терапия, избирательно направленная на ткань опухоли молочной железы, не приводит к побочным эффектам, известным в данной области техники, таким как повреждение костного мозга и кишечного эпителия. Диалкилфенилтриазены известны как в общем случае неселективные цитостатики; смотри Proc. Soc. Exper. Biol. Med. 90, 484 (1955); но подобно алкилирующим агентам (эндоксан) они вмешиваются в пролиферацию всех клеток организма подряд.

Кроме того, 4-(3,3-диметил-1-триазенил)-3-метокси-эстра-1,3,5(10)-триен-17-он известен как промежуточное соединение при получении фтористого соединения (замена триазенила на фтор); смотри J. Org. Chem. 46 (12), 2520-2528 (1981).

Таким образом, объектом данного изобретения являются эстрогены и антиэстрогены, в которых каждая молекула является замещенной по ядру по меньшей мере одной диалкилтриазенильной группой, за исключением 4-(3,3-диметил-1-триазенил)-3-метоксиэстра-1,3,5(10)-триен-17-она.

В рамках данного изобретения термины "эстрогены" и "антиэстрогены" включают как природные, так и синтетические соединения с эстрогенной и антиэстрогенной активностью. В качестве соединений с эстрогенной и антиэстрогенной активностью соответственно, замещение которых диалкилтриазенильными группами приводит к получению соединений по данному изобретению, пригодны в сущности все соединения, у которых "показатель занятости рецептора", который получают при помощи 10 мг/л исследуемого вещества в разделе "Данные по конкурентному ингибированию в отношении 6,7-дитритий-эстрадиола на рецепторе эстрогенов", описанном ниже, составляет максимум 0,9, предпочтительно максимум 0,7, особенно предпочтительно максимум 0,3.

В рамках данного изобретения термин "замещенный по ядру" относится к одному или более ароматическим кольцам соединений на основе эстрогенов и антиэстрогенов.

Не будучи связанным с конкретной теорией, достижение по изобретению можно объяснить в общеупотребительных терминах следующим образом: очевидно триазенильные группы могут связываться с рецепторами эстрогенов аналогично OH-группам. Для доставки эффективных групп к мишени, то есть ткани опухоли, в качестве носителя используют эстрогенную и антиэстрогенную молекулярную группировку, придающую гормоноподобнуго специфичность соединениям по изобретению. В раковых клетках эффективные группы вызывают онколизис раковых клеток.

Соединениям по изобретению можно придать некоторые требуемые свойства путем введения определенных групп; например, степень водорастворимости соединений можно по желанию регулировать в широких пределах путем введения гидрофильных групп. Соли щелочных металлов и аммония соединений по изобретению с гидрофильными группами хорошо растворимы в воде.

Одним преимуществом соединений с гидрофильными группами по изобретению является то, что по сравнению с рецепторами эстрогенов они могут накапливаться в избытке в раковых клетках в количествах, требуемых для терапии, и то, что их избыток можно быстро вывести из организма. Таким образом, токсические побочные эффекты минимизированы.

Благодаря гормоноподобной специфичности соединений по изобретению требуются относительно небольшие их количества.

В качестве носителей согласно изобретению могут быть использованы производные эстрогенов и антиэстрогенов, таких как, например, группы стероидов, стильбенов, гексестролов, фенил-1,2-бис(2,6-дихлорфенил)-1,2-бис(этиленаминоэтанов), трифенилэтиленов, фенилбензофуранов, фенилбензотиофенов, которые замещены главным образом в положении 3 бензоильной группой, 4,5-бис-фенил-имидазолов, 2,3-диарилпиперазинов и 4,5-фенил-2-имидазолинов. Некоторые типы приведенных в качестве примеров носителей будут обсуждаться ниже.

Соединения по изобретению включают, например, стероидтриазены формулы

где

R¹ представляет собой водород, N=N-NR^7AR^7B, O(CR⁸R⁹)_nCO₂H, CO₂Н или SO₃H,

R² представляет собой OH, OCH₃, N=N-NR^7AR^7B или O(CR⁸R⁹)nCO₂H,

R³ представляет собой водород, N=N-NR^7AR^7B, O(CR⁸R⁹)_nCO₂H, CO₂Н или SO₃H,

R⁴ и R⁶ независимо друг от друга представляют собой водород, O(CR⁸R⁹)_nCO₂H, (CR⁸R⁹)_nCO₂H или С₆Н₄OCH₂CO₂Н и

R⁴, кроме того, представляет собой (CH₂)₁₀CON(С₁-С₄алкил)₂,

R⁵ представляет собой водород или OH,

R^7A и R^7B независимо друг от друга представляют собой алкил,

R⁸ и R⁹ независимо друг от друга представляют собой водород, метил или этил,

Х представляет собой СО, CHOH или С(OH)-С≡СН и

n представляет собой целое число от 1 до 10,

при условии, что только один из остатков R¹-R³ представляет собой N=N-NR^7AR^7B,

и их соли, сольваты и сольваты этих солей.

Стероидтриазены (I) могут быть получены, например, путем диазотирования аминопроизводных формулы

где один из остатков R¹-R³ представляет собой NH₂, а остальные R¹-R⁶ и Х имеют значения, приведенные в описании формулы (I), или их солей и путем взаимодействия полученных солей диазония формулы

где

R имеет формулу (II), в которой один из остатков R¹-R³ представляет собой (N₂)⁺, а другие переменные имеют значения, приведенные в описании формулы (II), и Y^- представляет собой анион кислоты, с диалкиламинами и при необходимости с высвобождением кислот из полученных солей.

При использовании, например, 2-амино-3-карбоксиметокси-эстрадиола в качестве исходного вещества взаимодействие может быть проиллюстрировано посредством следующей формульной схемы 1:

Аминостероиды, используемые в качестве исходных веществ, либо известны, либо могут быть получены аналогично известным способам получения.

Примеры аминостероидов (II) включают, например:

1-амино-3-оксиуксусный эстрадиол, 2-амино-3-оксиуксусный эстрадиол, 4-амино-3-оксиуксусный эстрадиол, 1-амино-3-оксиуксусный эстрон, 2-амино-3-оксиуксусный эстрон, 4-амино-3-оксиуксусный эстрон, 1-амино-3-метоксиэстрадиол, 2-амино-3-метоксиэстрадиол, 4-амино-3-метоксиэстрадиол, 1-амино-3-метоксиэстрон, 2-амино-3-метоксиэстрон, 4-амино-3-метоксиэстрон, 1-амино-3-оксиуксусный эстриол, 2-амино-3-оксиуксусный эстриол, 4-амино-3-оксиуксусный эстриол, 1-амино-3-оксиуксусный этинилэстрадиол, 2-амино-3-оксиуксусный этинилэстрадиол, 4-амино-3-оксиуксусный этинилэстрадиол, 2-амино-4-сульфоновый эстрадиол, 4-амино-2-сульфоновый эстрадиол, 2-амино-4-сульфоновый эстрон и 4-амино-2-сульфоновый эстрон.

Путем замещения OH-группы в эстроне триазенильной группой (смотри пример 11) получают эффективный противораковый химиотерапевтический агент, который проявляет очень хорошее действие в низкой дозировке в отношении карциномы молочной железы крысы. Следовательно, можно сделать вывод, что триазенильная группа неожиданно может замещать необходимую OH-группу в качестве адгезионной группы на рецепторе эстрогенов. Если для противоопухолевого действия необходимо максимально использовать связывающие свойства OH-группы (или ее эфиров) на рецепторе эстрогенов, триазенильную группу предпочтительно вводят согласно изобретению в положение 2 или 4.

Как уже упоминалось выше, для растворимости в воде может быть желательно вводить в соединения по изобретению гидрофильные группы. Предпочтительными в качестве гидрофильных групп являются сульфонатные и карбоксилатные группы, а также C₁-С₆остатки, несущие подобные группы. Даже если можно рассматривать несколько положений для дополнительного замещения, особенно легко замещения можно проводить по ароматическому кольцу - путем, например, сульфонирования ядра или этерификации фенольных гидроксильных групп.

Что касается сведений о положении замещения, руководящими могут служить сведения о том, что эстрон, эстрадиол или этинилэстрадиол обладают значительным сродством к рецептору эстрогенов, даже когда в положениях 2, 4, 7 и 11 находятся объемные заместители (Р.W.Jungblut et al., Hormon-Rezeptoren, Kolloquium der Gesellschaft für physiologische Chemie vom 05-08.04.1967 in Mosbach/Baden; M.Görlich, Arch. Geschwulstforschung 37/2, 161-170 (1971)).

Следовательно, эти положения также являются предпочтительными для замещения.

Например, группа карбоксиалкокси, например группа карбоксиметокси, может находиться в положении 3 в качестве солюбилизирующей группы [(пролекарство) в виде соли]. Если в одном из положений 2 или 4 находится триазенильная группа, тогда второе положение (4 или 2) может нести солюбилизирующую группу, например соль группы карбоксиалкокси или сульфоновой кислоты. Положения 7 и 11 могут быть использованы для дополнительных заместителей и могут нести, например, дополнительные солюбилизирующие группы (например, группы карбоксиалкокси); таким образом, если это необходимо, существует возможность достижения требуемых селективностей путем введения заместителей.

Соединения, в которых фенольная OH-группа этерифицирована, действуют как пролекарство, то есть можно ожидать, что адгезия на рецепторе эстрогенов поддерживается посредством группы карбоксиметокси в положении 3; смотри, например, местранол (Е.Mutschler, Arzneimittelwirkungen, Lehrbuch der Pharmakologie und Toxikologie, page 368, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft, Stuttgart, 1997). Как и при получении химиотерапевтических агентов, в данном случае важно только, чтобы активный агент связывался с рецептором эстрогенов, и неважно, представляет собой носитель эстроген или антиэстроген.

Эстрогенные стероиды являются примерами того, как активные агенты, высокоспецифичные и высокоэффективные в отношении карцином молочной железы, которые оптимальным образом связываются с рецептором эстрогенов, могут быть синтезированы из эстрогенов путем введения диалкилтриазенильной группы. Также следует предполагать, что такие активные агенты, благодаря их связыванию с рецептором эстрогенов, эффективны в отношении всех карцином половых органов (матки, яичников, предстательной железы), содержащих рецепторы эстрогенов.

Стильбены: производные от стильбенов противораковые химиотерапевтические агенты, диэтилстилбестрол и гексестрол

Также соединениями по изобретению являются, например, цис- и транс-стильбены и гексестролы формулы

где

R представляет собой водород, метил или этил,

R¹ представляет собой водород, хлор, метил, этил, СН₂CO₂Н, СН(СН₃)CO₂Н, OCH₂СО₂Н, OCH(СН₃)CO₂Н или SO₃Н,

R² представляет собой OH, OCH₃, OCH₂CO₂Н, OCH(СН₃)CO₂Н или N=N-NR^7AR^7B,

R³ представляет собой водород, хлор, предпочтительно в положении 6, или N=N-NR^7AR^7B,

R⁴ представляет собой водород, метил, этил, СН₂СО₂Н или СН(СН₃)CO₂Н и

R^7A и R^7B независимо друг от друга представляют собой алкил,

при условии, что либо R², либо R³ представляет собой N=N-NR^7AR^7B, и указанные пунктиром связи показывают, что соединения включают производные как этана, так и этилена и их соли, сольваты и сольваты этих солей.

Эти соединения VI могут быть получены, например, путем диазотирования аминопроизводных формулы

где

R³ представляет собой водород или NH₂ и

R⁴ представляет собой водород, метил, этил, CH₂CO₂H или СН(СН₃)CO₂Н,

при условии, что либо R², либо R³ представляет собой NH₂ и R, R¹, R², R^7А, R^7В и указанные пунктиром связи имеют значения, приведенные в описании формулы (VI),

или их солей и путем взаимодействия полученных солей диазония формулы

где

R⁵ имеет формулу (VII), в которой один из двух остатков R² и R³ представляет собой (N₂)⁺ соответственно, другие переменные имеют значения, приведенные в описании формулы (VII), и Y^- представляет собой анион кислоты,

с диалкиламинами и при необходимости путем высвобождения кислот из полученных солей.

При использовании, например, 3,3'-диамино-диэтилстилбестрола (Н.Hamacher, Potentielle Antineoplastika III, Arch. Pharm. 311, 184-195, Weinheim 1978) в качестве исходного вещества взаимодействие может быть проиллюстрировано посредством следующей формульной схемы 2:

При дополнительном взаимодействии 3,3'-ди-(диалкилтриазенил)-диэтилстилбестрола с 1 или 2 эквивалентами алкилирующего агента формулы

где

R⁶ представляет собой C₁-С₃алкил, СН₂СО₂СН₃ или СН(СН₃)СО₂СН₃ и

Y представляет собой отщепляемую группу алкилирующих агентов, могут быть получены соответствующие продукты алкилирования; смотри следующую формульную схему 3:

Если R⁶ в вышеуказанной схеме формул 3 представляет собой, например, СН₂СО₂СН₃, тогда может быть получена динатриевая соль из бис-эфира посредством основного гидролиза, например, при помощи NaOH (формульная схема 4):

Другие соединения по изобретению представляют собой, например, производные трифенилэтилена формулы

где

R представляет собой водород, хлор, хлорметил или этил,

R¹ представляет собой OCH₂CO₂Н или OCH(СН₃)CO₂Н,

R² и R⁴ независимо друг от друга представляют собой водород, SO₃Н или N=N-NR^7AR^7B,

R³ и R⁵ независимо друг от друга представляют собой водород, OH, OCH₃, OCH₂CO₂Н, OCH(СН₃)CO₂Н или N=N-NR^7AR^7B и

R^7A и R^7B независимо друг от друга представляют собой алкил, при условии, что только один из остатков R²-R⁵ представляет собой N=N-NR^7AR^7B,

и их соли, сольваты и сольваты этих солей.

Соединения XVI по изобретению могут быть получены, например, путем диазотирования аминопроизводных формулы

где

R² и R⁴ независимо друг от друга представляют собой водород, NH₂ или SO₃H,

R³ и R⁵ независимо друг от друга представляют собой водород, NH₂, OH, OCH₃, OCH₂CO₂Н или OCH(СН₃)CO₂Н и

R и R¹ имеют значения, приведенные в описании формулы (XVI), при условии, что только один из остатков R²-R⁵ представляет собой NH₂, или их солей

и путем взаимодействия полученных солей диазония формулы

где

R⁶ представляет собой формулу (XVIa), в которой один из остатков R²-R⁵ представляет собой (N₂)⁺, а другие переменные имеют значения, приведенные в описании формулы (XVIa), и Y^- представляет собой анион кислоты, с диалкиламинами и при необходимости путем высвобождения кислот из полученных солей.

При использовании, например, аминосоединения XVIII в качестве исходного вещества взаимодействие может быть проиллюстрировано посредством следующей формульной схемы 5:

Посредством основного гидролиза метилового эфира XIX, согласно схеме реакции 6, может быть получена натриевая соль XX:

Приведенным выше в качестве примера способом противораковые химиотерапевтические агенты могут быть получены из любых эстрофильных соединений путем введения триазенильной группы, например:

Стрелки указывают предпочтительные положения для триазенильных (Tr) и солюбилизирующих групп (sb).

Следовательно, еще одним объектом изобретения является способ получения эстрогенов и антиэстрогенов, при котором каждая молекула является замещенной по ядру по меньшей мере одной диалкилтриазенильной группой, вследствие чего по меньшей мере один диалкилтриазенильный заместитель вводят в одно или более чем одно ароматическое кольцо соединения с эстрогенной или антиэстрогенной активностью, за исключением получения 4-(3,3-диметил-1-триазенил)-3-метоксиэстра-1,3,5(10)-триен-17-она.

В рамках данного изобретения предпочтительными в качестве солей являются физиологически приемлемые соли.

Физиологически приемлемые соли, предпочтительно физиологически приемлемые соли соединений I, II, VI, VII, XVI и XVIa, включают соли обычных оснований, таких как, например, соли щелочных металлов (например, соли натрия и калия), соли щелочноземельных металлов (например, соли кальция и магния) и соли аммония, производные аммиака или органических аминов с числом атомов С от 1 до 16, таких как, например, этиламин, диэтиламин, триэтиламин, этилдиизопропиламин, моноэтаноламин, диэтаноламин, трис-гидроксиэтиламин, дициклогексиламин, диметиламиноэтанол, прокаин, дибензиламин, N-метилморфолин, дигидроабиетиламин, аргинин, лизин, этилендиамин и метилпиперидин.

В рамках изобретения такие формы соединений упоминаются как сольваты, образующие комплекс с молекулами растворителя посредством координации в твердой или жидкой фазе. Гидраты представляют собой частную сольватов, в которой имеет место координация с водой. Алкил как таковой и "алкил" или "алк" в диалкиламине и карбоксиалкокси представляют собой линейный или разветвленный алкильный остаток, в общем случае с 1-6, 1-4 или 1-3 атомами С, например метил, этил, н-пропил, изопропил, трет-бутил, н-пентил и н-гексил.

Диазотирование известно, например, из Organikum, 10. Ed., VEB Deutscher Verlag der Wissenschaften, Berlin 1971, 580-600.

Анионы кислот в рамках изобретения представляют собой главным образом анионы неорганических кислот, карбоновых кислот и сульфоновых кислот, например соли соляной кислоты, бромистоводородной кислоты, серной кислоты, фосфорной кислоты, метансульфоновой кислоты, этансульфоновой кислоты, толуолсульфоновой кислоты, бензолсульфоновой кислоты, нафталиндисульфоновой кислоты, уксусной кислоты, пропионовой кислоты, молочной кислоты, винной кислоты, яблочной кислоты, лимонной кислоты, фумаровой кислоты, малеиновой кислоты и бензойной кислоты.

Отщепляемые группы алкилирующих агентов в рамках изобретения включают, например, хлорид, бромид и сульфат.

Дополнительным объектом изобретения являются эстрогены и антиэстрогены, в которых каждая молекула является замещенной по ядру по меньшей мере одной диалкилтриазенильной группой, для лечения заболеваний.

Дополнительным объектом изобретения является применение эстрогенов и антиэстрогенов, в которых каждая молекула является замещенной по ядру по меньшей мере одной диалкилтриазенильной группой, против опухолей половых органов людей и животных.

Дополнительным объектом изобретения является способ борьбы с опухолями половых органов людей и животных посредством применения достаточного количества по меньшей мере одного соединения из группы эстрогенов и антиэстрогенов, в котором каждая молекула является замещенной по ядру по меньшей мере одной диалкилтриазенильной группой.

Дополнительным объектом изобретения является применение эстрогенов и антиэстрогенов, в которых каждая молекула является замещенной по ядру по меньшей мере одной диалкилтриазенильной группой, для изготовления фармацевтических препаратов против опухолей половых органов людей и животных.

Дополнительным объектом изобретения являются фармацевтические препараты, содержащие по меньшей мере одно соединение группы эстрогенов и антиэстрогенов, в котором каждая молекула является замещенной по ядру по меньшей мере одной диалкилтриазенильной группой, при необходимости вместе с одним или более фармакологически приемлемыми адъювантами или субстратами, а также их применение для вышеуказанных целей.

Соединения по изобретению могут быть эффективными при системном и/или местном применении. С этой целью их можно применять посредством подходящего пути введения, например посредством перорального, парентерального, пульмонального, назального, сублингвального, лингвального, трансбуккального, ректального, трансдермального, конъюнктивального, ушного пути введения или в качестве имплантата.

Для осуществления этих путей применения активный агент можно вводить в подходящих формах.

Подходящими для перорального применения являются известные формы применения, которые доставляют активный агент быстро и/или в модифицированной форме, такие как, например, пилюли (не покрытые оболочкой, а также покрытые оболочкой пилюли), например пилюли или покрытые оболочкой пилюли с оболочками, устойчивыми к желудочному соку, капсулы, покрытые сахаром пилюли, грануляты, гранулы, порошки, эмульсии, суспензии, растворы и аэрозоли.

Парентеральное применение можно осуществлять, исключая стадию всасывания (внутривенным, внутриартериальным, внутрисердечным, интраспинальным или интралюмбальным путем) или включая стадию всасывания (внутримышечным, подкожным, внутрикожным, чрескожным или интраперитонеальным путем). Подходящими для парентерального применения формами применения являются, например, инъекционные и инфузионные препараты в форме растворов, суспензий, эмульсий, лиофилизатов и стерильных порошков.

Подходящими для других путей применения являются, например, ингаляционные лекарственные препараты (например, порошковые ингаляционные средства, небулайзеры), назальные капли/растворы, спреи; таблетки или капсулы для применения посредством лингвального, сублингвального, трансбуккального пути введения, суппозитории, ушные и глазные препараты, вагинальные капсулы, водные суспензии (лосьоны, перемешиваемые смеси), липофильные суспензии, мази, кремы, молочко, пасты, дисперсионные порошки или имплантаты.

Активные агенты могут быть превращены в упомянутые формы применения известным способом. Это можно осуществить посредством применения инертных, нетоксичных, фармацевтически пригодных адъювантов. Они включают в себя, например, субстраты (например, микрокристаллическую целлюлозу), растворители (например, жидкие полиэтиленгликоли), эмульгаторы (например, додецилсульфат натрия), диспергирующие вещества (например, поливинилпирролидон), синтетические и природные биополимеры (например, альбумин), стабилизаторы (например, антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота), красители (например, минеральные пигменты, такие как оксиды железа) или ароматизаторы и/или отдушки.

В общем случае для введения в случае парентерального применения для достижения эффективных результатов рекомендуются количества от приблизительно 1 до 20 мг/кг, предпочтительно от приблизительно 2,5 до 10 мг/кг массы тела. В случае перорального применения количество составляет от приблизительно 1 до 70 мг/кг, предпочтительно от приблизительно 1 до 30 мг/кг массы тела.

Тем не менее при необходимости может быть нужным отклониться от указанных количеств, в зависимости от массы тела, пути применения, индивидуальной реакции на активный агент, вида препарата и момента времени или периода времени, в который происходит применение. Таким образом, в некоторых случаях может быть достаточным применить меньше вышеупомянутого минимального количества, тогда как в других случаях следует превысить упомянутое максимальное количество. В случае применения больших количеств может быть целесообразным разделить их на несколько отдельных доз в течение дня.

Генерация исследуемых опухолей

20 самок крыс линии Wistar обрабатывают бензидином. Первая доза бензидина составляет 150 мг/кг; затем дозы понижают до 100 мг/кг в неделю. Затем в течение 14 дней следуют дозы по 75 мг/кг. Это приводит к общей дозе от 1,225 г/кг.

В итоге генерируется 29 карцином молочной железы. Средняя ожидаемая продолжительность жизни обработанных бензидином крыс линии Wistar составляет 325 суток.

После генерации первой опухоли (около 0,5 г) применение бензидина прекращают. После этого карциномы молочной железы относительно быстро увеличиваются. Размер опухоли определяют тактильно; опытные экспериментаторы могут определить его с точностью до 0,1 г. Опухоли больше 0,5 г используют для исследований.

Данные по конкурентному ингибированию соединениями по изобретению в отношении 6,7-дитритий-эстрадиола на рецепторе эстрогенов

В данных исследованиях используют 6,7-дитритрий-эстрадиол с удельной активностью 0,5 Ки/ммоль.

Образцы тканей толщиной 0,7 мм и площадью 0,5 см² из ткани карциномы матки и молочной железы крысы готовят с помощью режущего инструмента для тканей. Карцинома для образцов ткани должна иметь минимальную массу 1,5 г.

Обработанные образцы ткани

Образцы ткани карциномы матки и молочной железы обрабатывают в обычном физиологическом солевом растворе с концентрациями 5, 10, 15, 20, 35 и 50 мг/л соединения по изобретению. Затем все образцы тканей промывают и снова инкубируют в течение 1 часа в физиологическом растворе, содержащем 10^-9 моль/л 6,7-дитритий-эстрадиола = физиологическая концентрация.

Контроль

Образцы ткани, такие как указано выше, но не обработанные, инкубируют в течение 1 часа в обычном физиологическом солевом растворе.

После инкубирования все образцы ткани промывают и помещают в 4%-ный формальдегид. Затем их сушат, взвешивают и сжигают. Золу растворяют в сцинтилляционной жидкости и в жидкостном сцинтилляционном счетчике определяют активность. Число световых вспышек на миллиграмм сухого вещества золы за определенный промежуток времени является мерой количества инкорпорированного 6,7-дитритрий-эстрадиола и, следовательно, косвенной мерой количества рецепторов эстрогенов, которые замещены соединением по изобретению. Отношение числа световых вспышек, полученного от крыс, обработанных согласно изобретению, к числу световых вспышек, полученному от необработанных крыс, в контексте данного изобретения упоминается как "показатель занятости рецепторов" (означает: занятых эстрадиолом). Отсюда следует, что чем меньше это отношение, тем сильнее соединение по изобретению занимает рецепторы эстрогенов; эстрадиол, используемый в данном исследовании, может занимать только те рецепторы, которые не заняты (соединением по изобретению).

Природа исследуемых тканей такова, что число рецепторов эстрогенов на образец ткани варьируется в некотором диапазоне. Так, например, число рецепторов эстрогенов в образцах соседних тканей опухоли молочной железы (из-за различной плотности ткани опухоли) может быть разным. Поэтому рекомендуется исследовать 3 образца одновременно и рассчитывать среднее значение.

Если количество соединения по изобретению, выбранное для исследования, относительно высокое, рецепторы, которые могут быть заняты соединениями по изобретению, уже заняты начальным количеством, и увеличение не приводит к значительному эффекту.

Качественные данные по цитотоксическому действию соединений по изобретению в отношении клеток опухоли молочной железы

С помощью этого тимидинового теста можно легко проверить рост опухоли: если тимидин больше не включается в клетку, то рост опухоли прекращается.

Необработанных крыс и крыс, обработанных соединениями по изобретению, кормят тимидином, меченным тритием.

Авторадиограмма показывает много меченых клеток в ткани опухоли необработанной контрольной группы. Клетки, меченные тритием, можно распознать по большому количеству черных точек на авторадиограмме (сильное осаждение серебра на фотопластинке). Эти точки являются признаком сильного роста клеток опухоли и связанного с этим включения нуклеозида тимидина.

В случае крыс, обработанных соединениями по изобретению, небольшие опухоли медленно исчезают, тогда как в случае больших опухолей имеет место некроз.

Карциномы молочных желез крыс, которые обрабатывали в течение 20 суток соединением по изобретению в количестве 20 мг/кг в сутки, не показывают, после кормления меченным тритием тимидином, на авторадиограмме никакого дополнительного включения тимидина, то есть рост клеток опухоли по меньшей мере прекращается.

Проценты, приведенные в следующих примерах, если не оговорено иное, представляют собой массовые проценты; доли представляют собой массовые доли. Соотношения растворителей, коэффициенты разбавления и приведенные концентрации растворов жидкость/жидкость в каждом случае относятся к объему.

Примеры

Примеры получения исходных веществ (обозначенных "А") и примеры получения

Чистоту всех получаемых веществ исследовали посредством тонкослойной хроматографии (диоксид кремния 60 F 254, Merck, Darmstadt). Записывали спектры ЯМР всех исходных веществ, полученных авторами изобретения, и всех соединений по изобретению; они соответствуют предполагаемым структурам.

I. Стероиды: Реакционная схема осуществляемых взаимодействий:

Нитрированные эстроны, эстрадиолы, используемые в качестве исходных веществ, и аминосоединения, получаемые здесь, либо известны, либо могут быть получены аналогично известным способам (смотри St. Kraychy, Am. Soc. 81, 1702 (1959)).

Пример А1: получение 2- и 4-нитроэстрона

К раствору 40 г эстрона в 1000 мл чистой уксусной кислоты при температуре от 35 до 40°С при медленном перемешивании по каплям добавляют 16,48 мл концентрированной азотной кислоты. Все перемешивают в течение 24 часов. 4-Нитроэстрон осаждается в виде светло-желтых кристаллов, его извлекают отсасыванием и перекристаллизовывают из этанола.

Выход: 9 г 4-нитроэстрона; точка плавления 270°С.

Фильтрат смешивают с 4000 мл воды, осажденный неочищенный продукт извлекают отсасыванием и сушат (выход: 45 г). Очистку проводят посредством колоночной хроматографии на оксиде алюминия (Fa.Woelm), АКТ. St. I acidic. Неочищенный продукт растворяют в 300 мл бензола при нагревании (максимум 15 г) и медленно наносят пипеткой на подготовленную колонку (высота 120 см, диаметр 4,5 см). Затем его элюируют бензолом с DC контролем. Раствор концентрируют и выделяют оставшийся 2-нитроэстрон.

Выход (с 3 колонок): 25 г 2-нитроэстрона; точка плавления 180°С.

Пример А2: 2-нитро-3-метоксиэстрон

К раствору 16 г 2-нитроэстрона из примера А1, 750 мл этанола и 750 мл 10%-ного водного раствора гидроксида калия при 35°С в течение 6 часов в атмосфере азота по каплям добавляют 480 мл диметилсульфата. Это гарантирует, что раствор останется основным; при необходимости по каплям добавляют 45%-ный водный раствор гидроксида калия. Перемешивают до тех пор, пока раствор остается светло-желтым и основным. Затем раствор охлаждают до приблизительно 5°С, осажденный продукт извлекают отсасыванием и промывают разбавленным водным раствором гидроксида калия и водой, сушат и перекристаллизовывают из смеси этанол/толуол (1:1).

Выход: 15,7 г; точка плавления 154°С,

Пример A3: 3-метокси-4-нитроэстрон

Соединение, указанное в заголовке, получают из соединения примера А1 согласно примеру А2.

Выход: 2,1 г; точка плавления 259°С.

Пример А4: 2-амино-3-метоксиэстрон

Раствор 5 г 2-нитро-3-метоксиэстрона из примера А2, 4 г тиосульфата натрия, 800 мл ацетона и 160 мл 0,5 н. гидроксида натрия нагревают с обратным холодильником в течение 35 минут, добавляют раствор 3,2 г тиосульфата натрия в 160 мл 0,5 н. гидроксида натрия и полученный раствор нагревают с обратным холодильником в течение 50 минут. Затем добавляют 400 мл воды, а ацетон удаляют при пониженном давлении. Полученную суспензию охлаждают и кристаллы извлекают отсасыванием, промывают водой, сушат и перекристаллизовывают из метанола.

Выход: 4,2 г; точка плавления 155°С.

Пример А5: 3-метокси-4-аминоэстрон

Соединение, указанное в заголовке, получают из соединения примера A3 согласно примеру А4.

Выход: 0,6 г; точка плавления 183°С.

Пример А6: 2-амино-3-метоксиэстрол

Смесь 1 г 2-амино-3-метоксиэстрона из примера А4, 200 мл метанола и 0,44 г боргидрида натрия перемешивают при 40-50°С с DC контролем до завершения реакции (14 часов). Затем добавляют 4 мл чистой уксусной кислоты и метанол удаляют при пониженном давлении. Остаток растворяют в разбавленной соляной кислоте при нагревании, указанное в заголовке соединение осаждают гидроксидом натрия, суспензию охлаждают и осажденный продукт извлекают отсасыванием и сушат.

Выход: 0,6 г; точка плавления 160°С.

Пример А7: 3-метокси-4-аминоэстрол

Соединение, указанное в заголовке, получают из соединения примера А5 согласно примеру А6.

Выход: 0,4 г; точка плавления 176°С.

Пример 8: 2-(1,1-диметилтриазенил)-3-метоксиэстрон

При температуре 0-4°С раствор 0,55 г нитрита натрия в 3 мл воды по каплям добавляют к раствору 2,3 г 2-амино-3-метоксиэстрона из примера А4, 160 мл воды и 1,2 мл концентрированной (37%) соляной кислоты. Затем полученный раствор соли диазония быстро переносят при 0-4°С в раствор 0,95 г карбоната натрия, 1 мл 40%-н