Штамм acremonium sp. г25-продуцент комплекса биологически активных соединений
Изобретение относится к фармакологии, микробиологии, биотехнологии, может быть использовано при получении медицинского препарата, обладающего высокой гиполипидемической и противоопухолевой активностью. Штамм Acremonium sp.Г25 выделен из почвенного образца Тебердинского заповедника. Депонирован в Коллекции культур микроорганизмов ГНЦА под номером 348А. Изобретение обеспечивает получение комплексного препарата, обладающего высокой гиполипидемической и противоопухолевой активностью при гомеопатических концентрациях. 2 табл.
Реферат
Изобретение относится к области фармакологии, микробиологии, биотехнологии, точнее к получению медицинского препарата с использованием микроорганизмов - продуцентов.
Предшествующий уровень техники.
Культуры мицелиальных грибов являются источником биологически активных соединений. В клинике широко используются препараты с гиполипидемической, иммуносупрессивной, иммуностимулирующей и другими активностями. Установлена тесная связь иммунных реакций организма с его липидтранспортной системой. Большое значение имеет применение для медицинских целей липидов грибов как эссенциальных, так и регулирующих гомеостаз макроорганизма.
Известно биологически активное соединение "ловастатин", получаемый из штамма P.cetrinum. (Endo A., Kuroda M., Tsujita Y. ML-236A, ML-236B and ML-236C, new inhibitors of cholesterogenesis produced by P.cetrinum. J.Antibiot / 1976, v.29, p.1346-1348), который проявляет гиполипидемическую активность. Однако его концентрация при использовании достаточно велика.
Сущность изобретения.
Целью изобретения является использование штамма Acremonium sp.Г25 для получения комплексного препарата, обладающего высокой гиполипидемической и противоопухолевой активностью при низких (гомеопатических) концентрациях.
Штамм Acremonium sp.Г25 выделен из почвенного образца Тебердинского заповедника. Депонирован в Коллекцию культур микроорганизмов ГНЦА под номером 348А.
Штамм Acremonium sp.Г25 через 2 недели роста при 24°С характеризуется следующими морфологическими свойствами.
Солодовый агар: колонии медленно растущие, белые, умеренно опушенные, ватообразные со слегка поднятым центром. Д=30-35 мм. Воздушный мицелий по центральной части колонии. По периферии воздушный мицелий отсутствует. Обратная сторона желтовато-кремовая. Образуется розоватый диффузный пигмент.
Среда Райстрика: колонии белые, слабоопушенные, ватообразные по центру колонии. Д=30-35 мм. Обратная сторона желтовато-кремовая.
Среда Чапека: колонии слабоопушенные беловатым воздушным мицелием, несколько приплюснутые. Наблюдаются центрические кольца. Д=20-25 мм. 0братная сторона также с центрическими кольцами, кремоватая.
Сусло-агар: колонии умеренно опушенные в центре, светло-кремовые. Д=25-30 мм. Обратная сторона колонии кремовая.
Овсяный агар: колонии белые, опушенные ватообразные Д=90 мм. Воздушный мицелий достигает высоты 10 мм. Центр колонии более плотный, слегка приподнят. Обратная сторона кремовая.
Гаузе 1: колонии слабоопушенные беловатым воздушным мицелием, несколько приплюснутые. Д=15-20 мм.
Рост и развитие культуры на агаризованных средах происходит по мицелиальному типу с образованием редких конидиеносцев с фиалидами, на концах которых находятся склеенные в капельках конидии. Конидии цилиндрические с закругленными концами = 3-5×1-2 μm. Хламидоспоры не наблюдаются.
Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения.
Комплексный препарат Г25 получается выращиванием штамма в глубинных условиях на посевной и ферментационной среде одного и того же состава, содержащей органический азот (может быть представлен гороховой или соевой мукой, БВК и т.д.), углеводы (меласса, солод, сахароза, глюкоза, крахмал картофельный и т.д.), минеральные соли (хлорид натрия, фосфорнокислый калий 1 и 2-х замещенный, аммоний сульфат) и воду, рН среды 6,5-7,2. Посевная стадия длительностью 48-72 часа, объем инокулята 5-15%. Процесс ферментации осуществляют в течение 10-14 суток при 24°С в условиях аэрации. Объем среды в колбах емкостью 750 мл составляет 100-200 мл.
По окончании ферментации отделяют мицелий от нативного раствора и экстрагируют препарат Г25 органическим растворителем (ацетон, спирт). Растворитель удаляют на роторном испарителе и целевой сырец реэкстрагируют из водной взвеси петролейным эфиром. Реэкстракт осушают безводным сульфатом натрия и концентрируют до окрашенного сиропообразного продукта. Комплексный препарат Г25 осаждают гексаном.
Пример: От одного литра культуральной жидкости отделяют мицелий центрифугированием или фильтрованием. Полученный влажный мицелий (80% влажности) экстрагируют 3-кратным объемом ацетона (по отношению к объему мицелия) в течение часа. Экстракт отделяют от мицелия фильтрованием и удаляют растворитель на роторном испарителе при 45°С. Целевой сырец реэкстрагируют из водной взвеси хлороформом (2 раза по 1/4 объема от объема водной взвеси). Экстракт расслаивают в делительной головке, нижний слой, содержащий пигменты, отбрасывают, а верхний водный слой реэкстрагируют бутанолом. Бутанольный слой отделяют и упаривают до сиропообразного продукта. Получают 0,4 г комплексного препарата Г25.
Биологическая активность комплексного препарата Г25.
Препарат проявляет высокую гиполипидемическую активность при использовании стандартной методики определения синтеза стеролов клетками культуры гепатоцитов Нер G2 по включению 3H-ацетата натрия в стеролы. Установлено, что ловастатин в дозе 200 мг/мл подавляет синтез стеролов на 50±6 (%). Комплексный препарат Г25 в разведении 1:10000 подавляет синтез стеринов на 23±4 (%), а в разведении 1:100000 - на 35±4%.
На модели гиперлипидемии кроликов in vivo под действием комплексного препарата Г25 в дозе 0,4 мг/кг показано максимальное снижение общего холестерина (ОХ) в крови кроликов на 40% триглицеридов (ТГ) на 19,3%, липопротеидов низкой плотности (ЛПНП) на 75% и увеличение уровня липопротеидов высокой плотности (ЛПВП) на 22%. В дозе 0,0004 мг/кг показано максимальное снижение OX в крови кроликов на 6,3%, ТГ на 18,8%, ЛПНП на 17,9% и увеличение уровня ЛПВП на 18,2%. При действии контрольного препарата ловастатина в дозе 4 мг/кг наблюдается снижение ОХ на 53%, ТГ на 46%, ЛПНП на 97% и повышение ЛПВП 18%. Сравнительные данные действия ловастатина и комплексного препарата Г25 приведены в таблице 1.
Таблица 1Максимальное влияние ловастатина и комплексного препарата Г25 на уровень ОХ, триглицеридов, ЛПНП и ЛПВП в сыворотке крови кроликов | |||||
Препарат | Конц. препарата (мг/кг) | Максимальное снижение уровня ОХ (%) | Максимальное снижение уровня ТГ (%) | Максимальное увеличение уровня ХС ЛПВП(%) | Максимальное снижение уровня ХС ЛПНП(%) |
ловастатин | 4 | 53,5 | 45,8 | 17,7 | 97,1 |
Г25 | 0,4 | 39,2 | 19,3 | 22,1 | 75,1 |
Г25 | 0,0004 | 6,3 | 18,8 | 18,2 | 17,9 |
Комплексный препарат Г25 подавляет фитогемаглютенин (ФГА) индуцированную пролиферацию лимфоцитов крови доноров в концентрации 0,01-0,1 мкг/мл на 99%, что проиллюстрировано примером в таблице 2.
Таблица 2Подавление ФГА-индуцированной пролиферации лимфоцитов доноров препаратом Г25 | ||||||||||
№ | Контроль (имп/мин) | Опыт (имп/мин) Жизнеспособность лимфоцитов | ||||||||
Спонт. | ФГА | ФГА + Г25 (мкг/мл) | Контроль | Опыт ФГА + Г25 | ||||||
Спонт. | ФГА | |||||||||
1 | 0,1 | 0,01 | 1,0 | 0,1 | 0,01 | |||||
1 | 1905 | 176804 | 470 | 1497 | 1575 | 3 | 14 | 21 | 0,7 | 22 |
2 | 516 | 94743 | 566 | 1023 | 799 | 0,5 | 0,9 | 14 | 14 | 15 |
1 | Процент подавления | 99,7 | 99,1 | 99,1 | ||||||
2 | Процент подавления | 99,4 | 98,9 | 91,1 |
Комплексный препарат Г25 индуцирует апоптоз трансформированных лимфоидных клеток линии Yurkat в концентрации 100 нг/мл на 42%, снижая в этой же концентрации некроз на 31% и увеличивая количество гипердиплоидных клеток на 26-32% в концентрации 0,1-10 нг/мл.
Таким образом, заявленный комплексный препарат Г25 проявляет гиполипидимическую активность, которая проявляется в снижении содержания в крови животных общего холестерина, триглицеридов, нормализации соотношения ЛПВП и ЛПНП, и противоопухолевую активность, индуцируя апоптоз трансформированных лимфоидных клеток линии Yurkat при низкой концентрации.
Штамм Acremonium sp.ГНЦА №348А - продуцент комплекса биологически активных соединений, проявляющих гиполипидемическую и противоопухолевую активность при низких концентрациях.