Способ продукции пуриновых нуклеозидов методом ферментации с использованием бактерий, принадлежащих к роду bacillus

Способ продукции пуриновых нуклеозидов методом ферментации с использованием бактерий, принадлежащих к роду bacillus

Реферат

Область техники

Настоящее изобретение относится к способу получения пуриновых нуклеозидов, таких как инозин, ксантозин и гуанозин, которые являются важными исходными реагентами для синтеза инозин-5'-фосфата, ксантозин-5'-фосфата и гуанин-5'-фосфата, и к новому микроорганизму, используемому для их продукции.

Предшествующий уровень техники

Традиционно пуриновые нуклеозиды (инозин, гуанозин, ксантозин) получают в промышленном масштабе методом ферментации с использованием штаммов, ауксотрофных по аденину или этих штаммов, которым в дальнейшем была придана устойчивость к различным соединениям, таким как пуриновые аналоги, сульфасоединения, аналоги метионина, антифолатные и полимиксиновые соединения и которые принадлежат либо к роду Bacillus (опубликованные патентные заявки Японии №38-23039 (1963), 54-17033 (1979), 55-2956 (1980), и 55-45199 (1980), выложенные патентные заявки Японии №56-162998 (1981), опубликованные патентные заявки Японии №57-14160 (1982) и 57-41915 (1982), выложенные патентные заявки Японии №59-42895 (1984), патентная заявка РФ №2002103333), либо к роду Brevibacterium (опубликованная патентная заявка Японии №51-5075 (1976) и 58-17592 (1972) и Agric. Biol. Chem., 42, 399 (1978)), либо к роду Escherichia (заявка РСТ WO 9903988) и подобные им.

Получение указанных мутантных штаммов обычно состоит из обработки микроорганизмов мутагенными дозами ионизирующего излучения (УФ-излучение, рентгеновское излучение, гамма-излучение) и отбора нужного штамма с использованием соответствующей среды для селекции.

При получении нуклеозидов среда для ферментации содержит высокие концентрации глюкозы, фосфата натрия и MgSO₄ (смотри ранее патентные заявки и далее - примеры), и поэтому имеет высокую осмолярность (высокое осмотическое давление). В процессе ферментации штамм-продуцент выделяет в среду значительное количество пуриновых нуклеозидов. Накопленные нуклеозиды способствуют росту осмотической силы (осмотического давления) в среде. Высокая осмолярность плохо влияет на всю физиологию клетки и может угнетать биосинтез нуклеозидов.

Известно, что в процессе роста клеток в условиях высокой осмолярности они накапливают совместимые электролиты (осмопротекторы), то есть органические осмолиты, которые полностью соответствуют физиологическим функциям клетки (Csonka. Microbiol. Rev., 53, 121-147, 1989; Kempf and Bremer. Arch. Microbiol., 170, 319-30, 1998). Вдобавок к своему значительному вкладу в осмотический баланс совместимые электролиты, по-видимому, предохраняют ферменты и клеточные структуры от разрушительного действия высокой ионной силы. Среди осмопротекторов циклическая аминокислота L-пролин играет очень важную роль в процессе приспособления бактерий к высокой осмолярности. Клетки накапливают огромные количества L-пролина за время синтеза de novo как результат роста в условиях высокой осмолярности (Csonka. Microbiol. Rev., 53, 121-147, 1989; Galinski and Trüper. FEMS Microbiol Rev., 29, 95-108, 1994; Kempf and Bremer. Arch. Microbiol., 170, 319-330, 1998). Более того, бактерии рода Bacillus, по-видимому, несут серию генов для биосинтеза пролина и некоторые из этих генов индуцируются высокими концентрациями солей (Belitsky et al., J. Bacteriol., 183, 4389-4392, 2001). Кроме того, процесс включения L-пролина в клетку запускается высокой осмолярностью. Накопление пролина в клетке позволяет ей размножаться вопреки осмотическим условиям, угнетающим рост (Galinski, E.A. & Trüper, H.G.FEMS Microbiol Rev., 29, 95-108, 1994; Yancey, P.H. In: Cellular and Molecular Physiology of Cell Volume Regulation. Strange, K. (ed.). Boca Raton, USA, CRC Press, pp.81-109, 1994). Kempf and Bremer. Arch. Microbiol., 170, 319-330, 1998.).

Однако в настоящее время отсутствуют какие-либо сообщения об использовании бактерий, принадлежащих к роду Bacillus и устойчивых к высокому осмотическому давлению, для олучения пуриновых нуклеозидов, таких как инозин, аденозин, ксантозин и гуанозин.

Описание изобретения

Целью настоящего изобретения является увеличение продуктивности пуриновых нуклеозидов штаммами-продуцентами пуриновых нуклеозидов и предоставление способа получения пуриновых нуклеозидов, например инозина или гуанозина, с использованием указанных штаммов.

Для достижения этой цели, авторы настоящего изобретения изучали бактерии-продуценты инозина и установили, что микроорганизмы, принадлежащие к роду Bacillus и несущие мутацию, которая придает бактериальной клетке устойчивость к высокому осмотическому давлению, продуцируют и накапливают значительно большее количество пуриновых нуклеозидов в среде. Ранее не было общепризнанным, что продуктивность пуриновых нуклеозидов может быть улучшена в результате наделения микроорганизмов-продуцентов пуриновых нуклеозидов такими свойствами.

Поэтому для завершения настоящего изобретения работа была продолжена на основании этого наблюдения.

Таким образом, настоящее изобретение предоставляет микроорганизм, принадлежащий к роду Bacillus и обладающий повышенной способностью к продукции пуринового нуклеозида.

В частности, настоящее изобретение предоставляет микроорганизм, чья способность продуцировать пуриновый нуклеозид улучшена за счет мутации, придающей клеткам устойчивость к высокому осмотическому давлению.

Далее настоящее изобретение предоставляет способ получения пуринового нуклеозида методом ферментации, включающей культивирование вышеупомянутого микроорганизма в питательной среде с целью продукции и накопления пуринового нуклеозида в среде, и сбор пуринового нуклеозида.

ОПИСАНИЕ НАИБОЛЕЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение подробно описывается ниже.

Бактерией согласно настоящему изобретению является бактерия-продуцент пуринового нуклеозида, принадлежащая к роду Bacillus и обладающая устойчивостью к высокому осмотическому давлению,

Термин «бактерия-продуцент пуринового нуклеозида» означает бактерию, которая обладает способностью к продукции и выделению в питательную среду значительного количества пуринового нуклеозида в процессе выращивания бактерии в среде. Обычно это означает способность к накоплению не менее чем 50 мг/л пуринового нуклеозида в среде, предпочтительно не менее, чем 0,5 г/л пуринового нуклеозида в условиях, описанных в Примерах (см. ниже).

Термин «пуриновый нуклеозид», используемый здесь, включает инозин, ксантозин, аденозин и гуанозин.

Термин «бактерия принадлежит к роду Bacillus» означает, что бактерия классифицируется как род Bacillus согласно классификации, известной специалисту в области микробиологии. Примерами микроорганизма, принадлежащего к роду Bacillus, использованного в настоящем изобретении, являются Bacillus subtilis (В. subtilis) и Bacillus amyloliquefaciens (В. amyloliquefaciens), но не ограничивается ими.

Примеры бактерий, принадлежащих к роду Bacillus, включают, но не ограничиваются ими, штамм Bacillus subtilis 168 Marburg (ATCC 6051), штамм Bacillus subtilis PY79 (Plasmid, 1984, 12, 1-9) и так далее, а примеры Bacillus amyloliquefaciens включают, но не ограничиваются ими, штамм Bacillus amyloliquefaciens Т (ATCC 23842), штамм Bacillus amyloliquefaciens N (ATCC 23845) и так далее.

Термин «бактерия, обладающая устойчивостью к ингибированию роста высоким осмотическим давлением», означает бактерию, полученную из родительского штамма и обладающую генетическими свойствами, модифицированными таким образом, что она может расти в питательной среде, имеющей высокое осмотическое давление. Высокое осмотическое давление может быть достигнуто с помощью осмотически активного вещества, например хлорида натрия.

Бактерия, принадлежащая к роду Bacillus, согласно настоящему изобретению может быть также получена путем модификации штамма таким образом, что подавление роста высоким осмотическим давлением снижается для того, чтобы придать способность к продукции пуринового нуклеозида или для того, чтобы улучшить продукцию пуринового нуклеозида.

Бактерия, которая обладает устойчивостью к подавлению роста высоким осмотическим давлением, проявляет лучшие ростовые качества по сравнению с родительским штаммом когда культивируется в среде, содержащей некую осмотически активную субстанцию, такую как NaCl, или маннитол, или сорбитол.

Например, бактерия, которая может образовывать колонии в течение 40 часов культивирования при 34°С в чашках с минимальной средой М9, содержащей 2.0 М NaCl, может считаться устойчивой к угнетению роста высоким осмотическим давлением.

Вдобавок к уже упомянутым свойствам, бактерия может обладать другими специфическими свойствами, такими как потребность в различных питательных добавках, устойчивость или чувствительность к химическим реагентам и зависимость от химических соединений, не выходя при этом за границы настоящего изобретения.

Мутантные микроорганизмы, используемые в осуществлении настоящего изобретения, могут быть получены с помощью воздействия обычных мутагенных факторов, таких как УФ-облучение, рентгеновское облучение, радиоактивное облучение и обработки химическими мутагенами с последующим отбором методом реплик. Предпочтительным мутагеном является N-нитро-N'-метил-N'-нитрозогуанидин (здесь и далее обозначается как НТГ).

Примеры способов выведения бактерии, принадлежащей к роду Bacillus и обладающей способностью к продукции пуринового нуклеозида, включают следующие способы. Например, способы, предусматривающие усиление активности фермента, включенного в биосинтез пуринового нуклеозида (патентная заявка США 20040166575). Выражение «усиление внутриклеточной активности» означает усиление активности до уровня, более высокого, чем уровень в немодифицированной бактерии рода Bacillus, такой как дикий штамм бактерии Bacillus. Примеры включают, но не ограничиваются только ими, увеличение количества молекул фермента на одну клетку, усиление специфической активности на одну молекулу фермента и так далее.

Примеры фермента, участвующего в биосинтезе пуринового нуклеозида, включают, например, фосфорибозилпирофосфат (ФРПФ) амидотрансферазу, фосфорибозилпирофосфат (ФРПФ) синтетазу, аденозиндеаминазу и так далее.

Кроме того, примеры включают также снятие регуляции фермента, участвующего в биосинтезе инозина, особенно, метод снятия ингибирования такого фермента по принципу обратной связи (WO 99/03988). Примеры способов снятия регуляции такого фермента, как отмечалось выше, участвующих в биосинтезе пуринового нуклеозида, включают, например, делецию пуринового репрессора (патент США №6284495). Примеры метода делеции пуринового репрессора включают метод разрушения гена, кодирующего пуриновый репрессор (purR, GenBank Accession №Z99104).

Кроме того, способность к продукции пуринового нуклеозида может также быть усилена путем блокирования реакции, ответвляющейся от пути биосинтеза инозина и приводящей к другому метаболическому продукту (WO 99/03988). Примеры реакции ответвления от пути биосинтеза пуринового нуклеотида, приводящей к другому метаболическому продукту, включают реакции, катализируемые, к примеру, сукцинил-аденозин монофосфат (АМФ) синтетазой, инозин-гуанозинкиназой, 6-фосфоглюконатдегидразой, фосфоглюкоизомеразой и так далее. Сукцинил-аденозин монофосфат (АМФ) синтетаза кодируется геном purA (GenBank Accession №Z99104).

Кроме того, способность к продукции пурина может быть также усилена путем снижения или удаления активности, вызывающей деградацию пуринового нуклеозида (WO 99/03998). Примеры такого метода снижения или удаления активности, вызывающей деградацию пуринового нуклеозида, включают метод разрушения гена, кодирующего фосфорилазу пуринового нуклеозида (ген deoD).

Таким образом, возможно подвергнуть любой известный штамм, принадлежащий к роду Bacillu и уже обладающий способностью к продукции пуринового нуклеозида, одной из вышеперечисленных процедур мутагенеза для получения мутантного штамма и затем протестировать мутантный штамм для того, чтобы определить, удовлетворяет ли он вышеперечисленным требованиям настоящего изобретения, касающегося устойчивости к подавлению роста высоким осмотическим давлением, и поэтому пригодным для использования в настоящем изобретении. Полученные штаммы отбираются в процессе выращивания в питательной среде и штаммы, обладающие способностью к продукции пуринового нуклеозида в большем количестве, чем его родительский штамм, отбираются и используются в этом изобретении.

Штаммы, удовлетворяющие требованиям настоящего изобретения, могут быть получены также с помощью техники генетической рекомбинации, которая хорошо известна специалисту в данной области техники.

Вышеупомянутые свойства устойчивости могут комбинироваться в одном штамме с помощью последовательной селекции или техники генетической рекомбинации.

(2) Конкретные примеры бактерий, продуцирующих пуриновые нуклеозиды.

В качестве примеров микроорганизмов, принадлежащих к роду Bacillus и использованных в настоящем изобретении, должны быть отмечены Bacillus subtilis (В. subtilis), Bacillus amyloliquefaciens и подобные им. Типичными примерами штаммов, практически использованных в изобретении, являются Bacillus subtilis 51-53H (VKPM В-8997), Bacillus amyloliquefaciens 23-68H (VKPM B-8996). Бактерия, которую предполагается использовать для продукции пуринового нуклеозида в соответствии с настоящим изобретением, имеет те же бактериологические свойства, что и родительский штамм за исключением устойчивости к высокому осмотическому давлению и способности продуцировать большее количество пуринового нуклеозида. Штаммы Bacillus subtilis 51-53H и Bacillus amyloliquefaciens 23-68H были депонированы во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) (РФ, 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд,1) 10 марта 2005 года с регистрационными номерами VKPM B-8997, VKPM B-8996, соответственно.

В качестве родительских штаммов, которые необходимо улучшить для получения бактерии, в настоящем изобретении могут быть использованы бактериальные штаммы-продуценты инозина, принадлежащие к роду Bacillus, такие как штамм Bacillus subtilis AJ 2707 (FERM P-12951) (патентная заявка Японии JP6113876), штамм Bacillus subtilis AJ3772 (FERM-P 2555) (патентная заявка Японии JP 62014794), Bacillus pumilus NA-1102 (FERM BP-289), Bacillus subtilis NA-6011 (FERM BP-291), Bacillus amyloliquefaciens ("Bacillus subtilise G1136A (ATCC №19222) (патент США 3575809), Bacillus subtilis NA-6012 (FERM BP-292) (патент США 4701413), В. pumilis Gottheil №3218 (ATCC №21005) (патент США 3616206), штамм В. amyloliquefaciens AS115-7 (VKPM B-6134) (патент РФ №2003678) или подобные им. Also the В. subtilis strain KMBS16 may be used. This strain is a derivative of the known B. subtilis 168 trpC2 strain having mutations introduced into purR gene coding for a purine represser (purR::spc), purA gene coding for succinyl-AMP synthase (purA::erm), and deoD gene coding for purine nucleoside phosphorylase (deoD::kan) (Russian Patent application №2002103333). Также может быть использован штамм В. Subtilis KMBS16. Этот штамм является производным от известного штамма В. subtilis 168 trpC2, содержащего мутации, введенные в ген purR, кодирующий пуриновый репрессор (purR::spc), в ген purA, кодирующий сукцинил-АМФ синтетазу (purA::erm), и в ген deoD, кодирующий фосфорилазу пуринового нуклеозида (deoD::kan) (патентная заявка РФ №2002103333).

(3) Метод придания бактериям рода Bacillus свойства снижать ингибирующее влияние высокого осмотического давления на их рост.

Далее будет дано объяснение снижению ингибирующего влияния высокого осмотического давления на рост бактерий рода Bacillus. Если в среде присутствует осмотически активное вещество, то рост бактерий рода Bacillus ингибируется. Это означает, что если бактерии рода Bacillus культивируются в среде, содержащей осмотически активное вещество, то бактерии не будут расти или их рост замедлится по сравнению с бактериями, которые культивируются в среде, не содержащей осмотически активное вещество. В особенности, когда бактерии культивируются в твердой среде определенный период времени, диаметр колоний, к примеру, становится меньше в среде, содержащей осмотически активное вещество, по сравнению с диаметром колоний, наблюдаемых в среде, не содержащей осмотически активное вещество. С другой стороны, бактерии рода Bacillus согласно настоящему изобретению модифицированы таким образом, что вышеупомянутое ингибирование роста высоким осмотическим давлением снижено.

У таких бактерий рода Bacillus, модифицированных таким образом, что ингибирование роста высоким осмотическим давлением снижено как описано выше, способность продуцировать пуриновые нуклеозиды улучшена по сравнению с немодифицированным штаммом. Поэтому свойство вещества создавать высокое осмотическое давление может быть применено для выращивания бактерий рода Bacillus, продуцирующих пуриновые нуклеозиды. То есть, бактерии рода Bacillus, обладающие улучшенной способностью продуцировать пуриновый нуклеозид, могут быть получены путем отбора штаммов, проявляющих удовлетворительные ростовые качества в среде, обладающей высоким осмотическим давлением, из популяции бактерий рода Bacillus и отбора из полученных штаммов штамма с высокой способностью к продукции пуринового нуклеозида.

Бактерия рода Bacillus в настоящем изобретении может быть получена как мутантный штамм, выведенный из бактерии рода Bacillus, выступающей в качестве родительского штамма. Мутагенная обработка для получения такого мутантного штамма не ограничена каким-либо образом и примеры поэтому включают, но не ограничиваются, обработкой УФ-облучением или обработкой мутагенным агентом, используемым для обычной мутагенной обработки, такими как N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин (НТГ) и азотистая кислота.

Мутантный штамм, в котором ингибирование роста высоким осмотическим давлением снижено, отбирается как штамм, проявляющий более успешные ростовые качества по сравнению с немодифицированным штаммом, например, родительским штаммом, когда они культивируются в среде, содержащей, к примеру, осмотически активное вещество. То есть, можно сказать, что у бактерии рода Bacillus в настоящем изобретении чувствительность к высокому осмотическому давлению снижена, или устойчивость к высокому осмотическому давлению улучшена по сравнению с родительским штаммом.

Примеры вышеупомянутой среды включают минимальными среды, но не ограничиваются ими. Примеры минимальных сред включают, в частности, минимальную среду М9 (Sambrook, J., Fritsch E.F. and Maniatis T. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd edn. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.).

В настоящем изобретении минимальная среда может содержать, если необходимо, питательные вещества, требующиеся для роста. Например, многие из инозин продуцирующих бактериальных штаммов являются ауксотрофными по аденину, и поэтому аденин добавляется в среду в концентрации, необходимой для роста. Однако, если количество аденина слишком велико, продуктивность бактерии-продуцента инозина может быть снижена, и поэтому количество аденина желательно ограничить. Более точно, концентрация около 0.1 г/л является предпочтительной.

Отбор целевого мутантного штамма или оценка подавления роста высоким осмотическим давлением для полученного мутантного штамма может проводиться как в жидкой, так и в твердой среде. В случае использования твердой среды, к примеру, мутантный штамм и родительский штамм выращиваются в жидкой среде до достижения ими логарифмической фазы роста или стационарной фазы роста, затем культуральный бульон разводится средой, содержащей раствор хлорида натрия или подобным раствором, полученная клеточная суспензия переносится на твердую среду, содержащую вещество, вызывающее высокое осмотическое давление, и мутантный штамм и родительский штамм культивируются в одинаковых условиях. Инкубация обычно проводится при температуре, близкой к оптимальной температуре роста, например, 34°С, от одного до трех дней. Затем, если колонии мутантного штамма, которые появились, больше по размеру, чем колонии родительского штамма, это может быть расценено как то, что рост мутантного штамма более успешный, чем рост родительского штамма и угнетение роста высоким осмотическим давлением у него снижено. В качестве веществ, вызывающих высокое осмотическое давление, могут быть использованы некоторые осмотически активные вещества, такие как хлорид натрия. Количества реагента может составлять, например, 2.0 М для NaCl.

Более того, при использовании жидкой среды клеточные суспензии мутантного штамма и родительского штамма культивируются и разводятся тем же способом, как описано ранее, и каждый переносится в жидкую среду, содержащую осмотически активное вещество и клетки культивируются при температуре, приближенной к оптимальной температуре роста, например, 34°С, от нескольких часов до одного дня, предпочтительно около 18 часов. Затем, если мутантный штамм проявляет более высокую оптическую плотность (OD) или мутность среды, по крайней мере, либо в логарифмической фазе роста, либо в стационарной фазе роста, по сравнению с родительским штаммом, это расценивается как то, что рост является успешным. Более точно, если клетки быстрее достигают логарифмической фазы роста или если максимальное значение OD является более высоким, то рост более успешен. Вышеупомянутая логарифмическая фаза роста означает период, в который количество клеток логарифмически увеличивается на кривой роста. Стационарная фаза означает период после окончания логарифмической фазы роста, когда деление и рост клеток останавливается и увеличение количества клеток больше не наблюдается (Dictionary of Biochemistry, 3rd Edition, Tokyo Kagaku Dojin).

При использовании жидкой среды выявить различие в угнетении роста высоким осмотическим давлением может быть более трудно, чем при использовании твердой среды. В настоящем изобретении даже, если различие в угнетении роста высоким осмотическим давлением не может быть выявлено с использованием жидкой среды, мутантным штаммом является штамм, проявляющий более успешный рост на твердой среде, чем родительский штамм.

Более того, степень подавления роста высоким осмотическим давлением может также быть оценена путем перенесения суспензии мутантного штамма на твердую среду, содержащую осмотически активное вещество и сравнения размера колоний, которые появляются после культивирования в тех же условиях, как описано ранее. Например, когда штамм KMBS16, содержащий три мутации в генах purR, purA и deoD, полученный из штамма Bacillus subtilis 168 Marburg, культивировался в условиях высокого осмотического давления в среде, относительная степень роста, рассчитанная согласно вышеупомянутому уравнению, не превышала 5% при сроке культивирования приблизительно 18 часов, тогда как мутантный штамм, полученный в разделе Примеры настоящего изобретения, проявлял относительную степень роста не менее 30% при времени культивирования приблизительно 18 часов и при том же содержании осмотически активного вещества.

(4) Метод получения пуринового нуклеозида путем ферментации микроорганизма, обладающего улучшенной способностью продуцировать пуриновый нуклеозид, описывается ниже.

Для продукции пуринового нуклеозида может быть использована питательная среда, содержащая источник углерода, азота, неорганических ионов и других органических компонентов по необходимости. В качестве источника углерода могут быть использованы сахариды, такие как глюкоза, лактоза, галактоза, фруктоза, арабиноза, мальтоза, ксилоза, трехалоза, рибоза и гидролизаты крахмала; могут быть использованы спирты, такие как глицерол, маннитол и сорбитол; органические кислоты, такие как глюконовая кислота, фумаровая кислота, лимонная кислота и янтарная кислота и подобные им. В качестве источника азота может быть использованы неорганические соли аммония, такие как сульфат аммония, хлорид аммония и фосфат аммония; может быть использован органический азот, такой как гидролизат бобов сои, газ аммиак, жидкий аммиак и подобные им. Желательно, чтобы витамины, такие как витамин В1, необходимые компоненты, например, нуклеиновые кислоты, такие как аденин и РНК, или дрожжевой экстракт и подобные им, содержались в необходимых количествах, в качестве следовых количествах неорганических питательных веществ. В отличие от этих малые количества фосфата кальция, сульфата магния, ионов железа, ионов магния и подобных им могут быть добавлены по необходимости.

Инкубирование предпочтительно проводить в аэробных условиях в течение 16-72 часов и температура культуры в процессе культивирования контролируется в пределах от 30 до 45°С, а рН в пределах от 5 до 8. Значения рН могут достигаться с использованием неорганических или органических кислот или щелочных субстанций, таких как газ аммиак.

Пуриновый нуклеозид может быть извлечен из жидкости для ферментации любым методом или комбинацией обычных методов, таких как методы выделения на ионнообменных смолах и методы преципитация.

ПРИМЕРЫ

В дальнейшем настоящее изобретение будет разъяснено более детально со ссылкой на следующие примеры, не ограничивающие рамки настоящего изобретения.

Пример 1. Отбор мутантов Bacillus subtilis штамма-продуцента инозина, устойчивого к хлориду натрия.

Клетки штамма В. subtilis KMBS16 обрабатывали НТГ в концентрации 200 мкг/мл в течение 15 минут. Затем клетки помещали на чашки с агаризованным (агар - 20 г/л) L-бульоном (Sambrook, J., Fritsch E.F. and Maniatis T. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd edn. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.), содержащим 1.8 M, 2 М, 2.2 М или 2.4 М NaCl. Инокулированные чашки инкубировали при 34°С в течение 5 дней. Из числа появившихся колоний-мутантов выбрали штамм Bacillus subtilis 51-53H (VKPM B-8997).

Устойчивость к хлориду натрия штамма Bacillus subtilis 51-53Н и родительского штамма оценивали следующим образом. В пробирки, содержащие 3 мл минимальной среды М9 с глюкозой и триптофаном в концентрации 50 мг/л, с различными ступенчатыми концентрациями хлорида натрия, вносили приблизительно 10⁷ клеток/мл тестируемого штамма, предварительно выращенного в течение 18 часов в L-бульоне со встряхиванием, и культивировали на роторной качалке при 37°С в течение 18 часов. Полученную культуральную жидкость разбавляли соответствующим образом водой и измеряли ее оптическую плотность при длине волны 540 нм для того, чтобы определить степени роста (SCOD₅₄₀). Степень роста (OD₅₄₀) того же штамма на среде М9 без NaCl принимали за 100, относительная степень роста на той же среде, содержащей NaCl рассчитывалась по формуле (SCOD₅₄₀)/(OD₅₄₀)×100. Результаты приведены в Таблице 1.

Как видно из Таблицы 1, штамм В. subtilis 51-53H более устойчив к высоким концентрациям хлорида натрия: в процессе роста культура этого штамма достигала более высокой оптической плотности при увеличивающихся концентрациях хлорида натрия.

Таблица 1.
Хлорид натрия, М	Относительный рост, %
KMBS16	51-53Н
0	100	100
0.8	97	100
1.2	85	87
1.6	4.2	33
1.8	4	7
2.0	4	6

Пример 2. Влияние мутации, которая придает устойчивость к высокой осмотической силе, на продукцию инозина.

Каждый из штаммов, штамм В. subtilis 51-53Н и родительский штамм В. subtilis KMBS 16, выращивался при 34°С в течение 20 часов при аэрацией в течение 18 часов в L-бульоне. Затем 0.3 мл полученной культуры перенесили в 3 мл питательной среды для ферментации, описанной в Примере 2, в пробирки 20×200 мм и инкубировали при 34°С 72 часа на роторной качалке.

После выращивания количество инозина, накопленное в среде, определяли методом ВЭЖХ. Образец культуральной жидкости (500 мкл) отцентрифугировали при 15,000 об/мин в течение 5 минут, супернатант разбавляли водой в 100 раз и анализировали с помощью ВЭЖХ.

Условия для анализа с помощью ВЭЖХ:

Колонка: Luna С 18(2) 250×3 мм, 5u (Phenomenex, USA). Буфер: 2% (v/v) C₂H₅OH; 0.8% (v/v) триэтиламин, 0.55 % (v/v) уксусная кислота (ледяная), рН 4.5. Температура: 30°С. Скорость потока: 0.3 мл/мин. Объем пробы: 5 мкл. УФ-детектор: UV 250 нм. Время удерживания (мин):

Ксантозин	13.7
Инозин	9.6
Гипоксантин	5.2
Гуанозин	11.4
Аденозин	28.2

Полученные результаты представлены в Таблице 2.

Таблица 2.
Штамм В. subtilis	OD540	Инозин, г/л
KMBS16	13.1	1.8±0.1
51-53Н	12.6	2.7±0.2

Как видно из Таблицы 2, штамм В. subtilis 51-53Н продуцировал больше инозина, чем родительский штамм.

Пример 3. Селекция и проверка мутантного штамма Bacillusamyloliquefaciens - продуцента инозина и гуанозина, устойчивого к NaCl.

Клетки штамма Bacillus amyloliquefaciens AJ1991 обработывали НТГ в концентрации 200 мкг/мл и помещали на чашки с агаризованным L-бульоном, содержащие 2 М, 2.2 М или 2.4 М NaCl. Инокулированные чашки инкубировали при 34°С в течение 5 дней. Среди появившихся колоний выбрали спонтанный штамм Bacillus amyloliquefaciens 23-68H (VKPM B-8996).

Каждый из штаммов, штамм В. amyloliquefaciens 23-68H и родительский штамм В. amyloliquefaciens AJ1991, выращивали при 34°С в течение 18 часов в L-бульоне. Затем 0.3 мл полученной культуры переносили в 3 мл питательной среды для ферментации в пробирки 20×200 мм и инкубировали при 34°С в течение 72 часов на роторной качалке.

Состав питательной среды для ферментации: (г/л)

Глюкоза	80.0
KH2PO4	1.0
MgSO4	0.4
FeSO4×7H2O	0.01
NH4Cl	0.01
MgSO4×5H2O	15.0
Аденин	0.3
Общий азот(в виде Mameno)	0.8
СаСО3	25.0

После выращивания количество инозина и гуанозина, накопленного в среде, определяли с помощью ВЭЖХ, как описано ранее. Эти результаты представлены в Таблице 3.

Таблица 3.
Штамм В. amyloliquefaciens	OD540	Инозин, г/л	Гуанозин, г/л
AJ 1991	9.0	1.87±0.09	1.6±0.03
23-68Н	10.0	2.77±0.24	1.93±0.14

Как видно из Таблицы 3, штамм В. amyloliquefaciens 23-68Н, устойчивый к высокой осмотической силе, накапливал больше инозина и гуанозина, чем родительский штамм.

1. Бактерия - продуцент пуринового нуклеозида, принадлежащая к роду Bacillus, обладающая устойчивостью к высокому осмотическому давлению.

2. Бактерия по п.1, отличающаяся тем, что такая бактерия является производной от родительского штамма, принадлежащего к роду Bacillus и проявляет лучшие ростовые качества по сравнению с родительским штаммом при культивировании в среде, содержащей осмотически активное вещество.

3. Бактерия по п.2, отличающаяся тем, что осмотически активным веществом является хлорид натрия.

4. Бактерия по п.2, отличающаяся тем, что содержание хлорида натрия в среде составляет 2.0 М.

5. Бактерия по п.1, отличающаяся тем, что бактерия принадлежит к виду Bacillus subtilis.

6. Бактерия по п.1, отличающаяся тем, что бактерия принадлежит к виду Bacillus amyloliquefaciens.

7. Бактерия по п.1, отличающаяся тем, что пуриновый нуклеозид выбран из группы, состоящей из инозина, ксантозина, аденозина и гуанозина.

8. Способ получения пуринового нуклеозида, включающий стадии выращивания бактерии по любому из пп.1-7 в питательной среде с целью продукции и выделения пуринового нуклеозида в среду и сбора пуринового нуклеозида из среды.

9. Способ по п.8, отличающийся тем, что пуриновый нуклеозид выбирают из группы, состоящей из инозина, ксантозина, аденозина и гуанозина.