Комбинации регулирующих рост факторов и гормонов для лечения неоплазии

Комбинации регулирующих рост факторов и гормонов для лечения неоплазии

Реферат

Описание

Область изобретения

Данное изобретение относится главным образом к области иммунологии, эндокринологии и онкологии и, в частности, к фармацевтическим композициям, содержащим комбинацию регулирующих рост факторов (EGF, TGF, VEGF) и половых гормонов, и/или половых гормонов, вовлеченных в каскадные реакции высвобождения половых гормонов или репродукцию, которые вызывают комбинированный аутоиммунный ответ с целью лечения неоплазии.

Предшествующий уровень техники

Гонадотропный рилизинг-гормон (GnRH), также известный как рилизинг-гормон лютеинизирующего гормона (LHRH), является пептидным гормоном гипоталамуса, ответственным за высвобождение лютеинизирующего гормона (LH) и фолликулостимулирующего гормона (FSH) передней доли гипофиза.

Наряду с GnRH, вырабатываемым гипоталамической системой, имеются доказательства продукции GnRH другими участками головного мозга (Jennes L., Conn P.M. "Gonadotropin-releasing hormone and its receptors in the rat brain". Front Neuroendocrinol. 1994, vol. 15, pp. 51-77), а также в зернистых клетках яичника крысы (Peng C., Fan N.C., Ligier M., Vaananen J., Leung P.C. "Expression and regulation of gonadotropin-releasing hormone (GnRH) and GnRH receptor messenger ribonucleic acids in human granulosa-luteal cells". Endocrinology 1994, vol. 135, pp. 1740-1746), в клетках яичка (Di Matteo L., Vallarino M., Pierantoni R. "Localization of GnRH molecular forms in the brain, pituitary and testis of the frog, Rana esculenta". J. Exp. Zool. 1996, vol. 247, pp. 33-40), в плаценте человека (Gohar J., Mazor M., Lieberman J.R. "GnRH in pregnancy" Arch. Gynecol. Obstet.1996, vol. 259, pp. 1-6), в иммунной системе (Jacobson J.D., Crofford L.J., Sun L., Wilder R.L. "Cyclical expression of GnRH and GnRH receptor mRNA in lymphoid organs". Neuroendocrinology1998, vol. 67, pp. 117-125) и гипофизе (Bauer T.W., Moriarty C.M., Childs G.V. "Studies of immunoreactive gonadotropin releasing hormone (GnRH) in the rat anterior pituitary". J. Histochem. Cytochem, 1981, vol. 29, pp. 1171-1178).

Гонадэктомия является хорошо известной терапевтической процедурой, необходимой для лечения опухолей, зависящих от гонадных стероидов. Аналоги GnRH могут проявлять противоопухолевую активность не только посредством химической кастрации, но также путем прямого воздействия на опухолевые клетки (Couillard S., Labrie C., Belanger A., Candas B., Pouliot F., Labrie F. "Effect of dehydroepiandrosterone and anti-androgen EM-800 on growth of human ZR-75-1 breast cancer xenografts". J. Nat. Cancer Inst. 1998, May 20, pp. 772-778; Kolle S. Et al. "Expression of growth hormone receptor in human prostatic carcinoma and hyperplasia". Int. J. Oncol. 1999, vol. 14, No. 5, pp. 911-916).

Также сообщалось, что антагонист GnRH (MZ-4-71) может подавлять рост линий РС-3, DU-145 и Dunning AT-1 андроген-независимых раковых клеток простаты (A Jungwirth et al. "Inhibition of in vivo proliferation of androgen-independent prostate cancers by an antagonist of growth hormone-releasing hormone". British Journal of Cancer1997, vol. 75, No. 11, pp. 1585-1592).

Линия клеток Dunning R3327-G была широко использована для различных исследований, связанных в основном с лечением опухолей простаты, в качестве хорошо установленного в настоящее время метода. Рецептор EGF был обнаружен в чувствительных к андрогенам моделях опухолей простаты Dunning R3327 (Damber J.E., Bergh B., Gafvels M. "Epidermal growth factor receptor content in rat prostatic adenocarcinoma: effects of endocrine treatment". Urol. Res. 1995, vol. 23, No. 2, pp. 119-25). Было выдвинуто предположение, что в сублинии клеток Dunning R3327-G экспрессия рецептора EGF находится под координированным контролем андрогенов ("Coordinate loss of growth factors following castration of rats carrying the Dunning R3327 G prostatic tumor" Clin. Physiol. Biochem., 1992, vol. 9, No. 2, pp. 47-50).

Эпидермальный фактор роста (EGF) представляет собой полипептид, состоящий из 53 аминокислот, с приблизительным молекулярным весом 6045 Да, который стимулирует пролиферацию эпителиальных и мезенхимных клеток in vitro и in vivo (Cohen S., Carpenter G., "Human Epidermal Growth Factor: Isolation and Chemical and biological properties" PNAS USA, 1975, vol. 72, pp. 1317). Действие EGF осуществляется через специфические рецепторы на мембране клеток. Вначале EGF был выделен и очищен из нижнечелюстных желез мыши (Cohen S. J. Biol. Chem. 1962, vol. 237, No. 1, pp. 555). Позже подобная молекула была выделена из человеческой мочи (Cohen S. "Human Epidermal Growth Factor: Isolation and Chemical and Biological Properties", PNAS USA 1975, vol. 72, pp. 1317).

Биорегуляторное действие EGF осуществляется через мембранный рецептор (EGF-R), гликопротеин с молекулярным весом приблизительно в 170 КДа, ген которого был клонирован и секвенирован. Внутриклеточный домен рецептора ассоциирован со специфической активностью белка тирозинкиназы, со структурной гомологией с онкогеном v-erb-B, что свидетельствует об определенной связи рецептора с процессами злокачественной трансформации (Helding C.H. Cell, 1984, vol. 37, pp. 9-20). Присутствие EGF-R в опухолевых клетках подтверждает прогноз относительно рака молочной железы человека. Приблизительно в 40% опухолей молочной железы обнаруживаются специфические участки с высоким сродством к связыванию с EGF (Rios M.A., et al. "Receptors for Epidermal Growth Factor and Estrogen Predictors of Relapse in Patients with Mammary Carcinoma" Anticancer Research1998, vol. 8, pp. 173-176). Также существует обратная корреляция присутствия рецепторов эстрогенов, указывающая на EGF-R как маркер дифференцировки или указатель потенциальной способности злокачественных клеток к пролиферации (Perez R., Pascual M.R., Macias A., Lage A. Breast Cancer Research and Treatment1984, vol. 4, pp. 189-193).

Предварительные исследования, выполненные на модели асцитной опухоли Эрлиха у мышей линии Balb/c (Lombardero J., et al., Neoplasma 1987, vol. 33, pp.4), свидетельствовали в пользу in vivoингибиторной способности EGF, что позволило рассматривать данную молекулу как преобразователь биологического ответа.

Была разработана вакцинная композиция, содержащая аутогенный EGF, связанный с белком-носителем, которая тормозит EGF-зависимый опухолевый рост с иммунным эффектом, без побочных эффектов (US 5894018: Vaccine composition comprising autologous epidermal growth factor or fragment or derivative thereof having anti-tumor activity and use thereof in the therapy of malignant diseases).

В предыдущих исследованиях было показано, что в опухоли Dunning экспрессируются высокие уровни мРНК фактора роста сосудистого эндотелия (VEGF) и его рецепторов по сравнению с вентральной простатой ("Expression of vascular endothelial growth factor and its receptors in the ventral prostate and Dunning R3327 PAP adenocarcinoma before and after castration", Prostate 1998, vol. 36, No. 2, pp. 71-79). Исследования, проводимые на моделях животных, показали, что лишение андрогенов может привести к сосудистой регрессии и что VEGF может регулироваться андрогенами. При раке простаты человека конститутивная продукция VEGF эпителием железы подавлялась в результате терапии, направленной на удаление андрогенов. Потеря VEGF привела к избирательному апоптозу эндотелиальных клеток в сосудах, лишенных периэндотелиальных клеток (Laura E. et al.: "Selective ablation of immature blood vessels in established human tumors follows vascular endothelial growth factor withdrawal" J. Clin. Invest. 1999, vol. 103, No. 2, pp. 159-165).

VEGF является специфическим ангиогенным и васкулогенным митогеном эндотелиальных клеток и играет роль в патогенной васкуляризации, которая связана с рядом клинических патологий, включая рак и ревматоидный артрит. VEGF является гликозилированным, дисульфид-связанным гомодимером и экспрессируется в виде различных изоформ (VEGF 121, VEGF 165, VEGF 189 и VEGF 206), состоящих из 121-206 остатков у человека (Yves A. Muller, et al. "The crystal structure of vascular endothelial growth factor (VEGF) refined to 1,93 A resolution: Multiple copy flexibility and receptor binding" Structure, 1997, vol. 5, No. 10, pp. 1325-1338).

В общих чертах опухолевые клетки обнаруживают в значительной степени уменьшенную зависимость от экзогенных сигналов роста и оказываются способными производить многие из их собственных сигналов роста. Эта сигнальная независимость, приобретенная таким образом, нарушает критически важное гомеостатическое поведение, которое в норме обеспечивает соответствующее поведение нескольких типов клеток в ткани.

Для достижения сигнальной автономии роста клетки создали механизмы, с помощью которых внеклеточные сигналы роста передаются через клетку переносчиками этих сигналов и преобразуются в действие (Douglas H. and Robert A.W. "The Hallmarks of Cancer (Review)" Cell 2000, vol. 100, pp. 57-70). В то время как большинство факторов роста вырабатывается одним типом клеток для стимуляции пролиферации других клеток (процесс гетеротипической передачи сигнала), большое число раковых клеток приобретает способность к синтезу факторов роста, на которые они отвечают путем создания положительной обратной связи (аутокринная стимуляция).

Рецепторы определенных факторов роста, цитоплазматические домены которых проявляют тирозинкиназную активность, экспрессируются в повышенном количестве во многих типах раковых клеток, и в результате в этих клетках развивается повышенный ответ на нормальные концентрации факторов роста. Повышенная экспрессия рецепторов факторов роста может вызывать также независимую от лиганда передачу сигнала. Независимая от лиганда передача сигнала может быть достигнута также в результате структурных изменений рецептора (рецептор EGF может утратить часть своего цитоплазматического домена и передавать сигнал конститутивно).

Каскад SOS-Ras-Raf-MAPK играет ключевую роль в передаче сигнала, обусловленного действием факторов роста. В 25% опухолей человека обнаружено нарушение регуляции экспрессии Ras-белка, хотя пути передачи сигнала роста изменены во всех опухолях человека (почти половина кишечных карцином человека несет мутантные ras-онкогены, а остальные, как полагают, являются дефектными в других компонентах пути передачи сигнала).

Нормальные клетки, подобные фибробластам и эндотелиальным клеткам, могут играть ключевую роль в пролиферации опухолевых клеток. В нормальной ткани клетки побуждают к росту сигналы, передающиеся соседними клетками (паракринный способ), или системные сигналы (эндокринный способ). Поэтому чтобы объяснить пролиферацию опухолевых клеток, гетеротрофную передачу сигналов между несколькими типами клеток внутри опухоли следует рассматривать такой же важной, как и вышеупомянутые механизмы автономной передачи сигнала. В этом смысле кислород и другие питательные ингредиенты, поставляемые сосудистой сетью, являются существенными для реализации указанных функций, а также для выживания опухолевых клеток.

Способность индуцировать продолжительный ангиогенез, по-видимому, приобретается на отдельной стадии (или стадиях) в процессе развития опухоли через «ангиогенное переключение» из состояния покоя сосудов. Образование новых сосудов необходимо для клональной экспансии, связанной с образованием макроскопических опухолей.

Митогенный эффект факторов роста в клеточных линиях может быть сдержан аналогами GnRH, что свидетельствует об участии GnRH в митогенном пути преобразования сигнала. Эта гипотеза была подтверждена посредством ингибирования активности тирозинкиназы, индуцированного факторами роста в опухолевых клетках из яичника и эндометрия человека, агонистами GnRH, которое отчасти является следствием активации GnRH-индуцированной фосфотирозинфосфатазы.

Лечение аналогами GnRH было связано со значительным уменьшением рецепторов факторов роста (EGF, инсулиноподобный фактор роста 1 (IGF-1)) на мембранах опухолевых клеток и резким увеличением уровней мРНК для EGF-R в опухолях. Кроме того, исследователи сообщали об антипролиферативной активности и изменении экспрессии рецепторов эстрогенов и андрогенов в некоторых опухолевых линиях.

Успехи, достигнутые в области исследований злокачественных опухолей в течение четверти столетия, способствовали накоплению данных, которые бесспорно свидетельствовали в пользу туморогенеза как динамического процесса злокачественного роста, складывающегося из множества фаз. Обширный каталог генотипов злокачественных клеток является примером существенных изменений в клеточной физиологии. Указанные изменения совместно способствуют стимуляции злокачественного роста тканей в различных типах опухолей. Следовательно, важной нерешенной проблемой терапии злокачественной опухоли является достижение регуляции активного или пассивного иммунного ответа.

Сущность изобретения

Данное изобретение способствует решению описанной ранее проблемы с помощью новой фармацевтической комбинации, которая включает в себя регулирующие рост факторы (EGF, TGF, VEGF) и половые гормоны и/или гормоны, вовлеченные в каскадные реакции высвобождения половых гормонов или вовлеченные в репродукцию (GnRH, LH, FSH). Указанная комбинация является пригодной для лечения неоплазии и в зависимости от обстоятельств активные ингредиенты комбинации могут быть использованы одновременно, раздельно или последовательно.

В ходе предварительных клинических испытаний предоставлялась возможность генерации комбинированного иммунного ответа к вышеуказанным факторам роста и гормонам, который приводил к лучшим результатам, чем те результаты, которые наблюдали при достижении независимого иммунного ответа к таким факторам роста и гормонам. Полученные результаты свидетельствуют в пользу того, что такой подход представляет собой более эффективный путь лечения больных с неоплазиями различного происхождения, поскольку в этом случае имеется активизированный противоопухолевый ответ, который выражается в снижении опухолевой массы и увеличении времени жизни больного.

Точнее данное изобретение относится к фармацевтическим комбинациям для лечения неоплазии, для одновременного, раздельного или последовательного введения, содержащим соединение А и соединение В; где А и В выбраны из группы молекул, состоящей из

А: а.1. GnRH или его аналогов, или антител против GnRH, или рецептора GnRH (GnRH-R), или его мутантных вариантов, или производных пептидов, или антител против GnRH, связанных или не связанных с белком-носителем, усиливающим иммунный ответ.

а.2. Природных или рекомбинантных гонадотропинов или их аналогов, или мутантных вариантов, связанных или не связанных с белком-носителем, усиливающим иммунный ответ, антител к гонадотропину, их Fab-, scFV-фрагментов, гуманизированных или негуманизированных.

а.3. Рецепторов гонадотропина или их мутантных вариантов, или производных пептидов, связанных или не связанных с белком-носителем, усиливающим иммунный ответ.

а.4. Антител к рецептору гонадотропина, их Fab-, scFV-фрагментов, гуманизированных или негуманизированных.

В. b.1. Природного или рекомбинантного EGF или его мутантных вариантов, или производных пептидов или EGF-имитирующих пептидов, или аналогов EGF, связанных или не связанных с белком-носителем, усиливающим иммунный ответ.

b.2. Антител к EGF, их Fab-, scFV-фрагментов, гуманизированных или негуманизированных.

b.3. Рецептора EGF (EGF-R) или его мутантных вариантов, или производных пептидов, связанных или не связанных с белком-носителем, усиливающим иммунный ответ.

b.4. Антител к рецептору EGF, их Fab-, scFV-фрагментов, гуманизированных или негуманизированных.

b.5. Природного или рекомбинантного VEGF или его мутантных вариантов, или производных пептидов, или VEGF-имитирующих пептидов, или аналогов VEGF, связанных или не связанных с белком-носителем, усиливающим иммунный ответ.

b.6. Антител к VEGF, их Fab-, scFV-фрагментов, гуманизированных или негуманизированных.

b.7. Рецепторов VEGF или их мутантных вариантов, или производных пептидов от рецепторов VEGF, связанных или не связанных с белком-носителем, усиливающим иммунный ответ.

b.8. Антител к рецептору VEGF, их Fab-, scFV-фрагментов, гуманизированных или негуманизированных.

b.9. Природного или рекомбинантного TGF или его мутантных вариантов, или производных пептидов, или TGF-имитирующих пептидов, или аналогов TGF, связанных или не связанных с белком-носителем, усиливающим иммунный ответ.

b.10. Антител к TGF, их Fab-, scFV-фрагментов, гуманизированных или негуманизированных.

b.11. Рецептора TGF (TGF-R) или его мутантных вариантов или производных пептидов.

В предпочтительной композиции, фармацевтические комбинации, которые включают в себя молекулы из групп А или В, связаны с белком-носителем, усиливающим иммунный ответ, посредством конъюгации или образования химерных белков. Точнее в группе молекул А, пептидный аналог GnRH с последовательностью pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Pro-Leu-Arg-Pro-Gly.

Другим осуществлением изобретения является выбор белка-носителя, усиливающего иммунный ответ, которым может быть один из белков наружной мембраны Neisseria meningitidis Р1 или Р64 или эпитоп Т-клеток-хелперов столбнячного анатоксина (ТТ).

Сходным образом данное изобретение относится к фармацевтической комбинации, где конъюгированным или химерным белком является один из следующих вариантов:

(b) GnRH, связанный с белком-носителем и с EGF.

(с) GnRH, связанный с белком-носителем и с VEGF.

(d) GnRH, связанный с белком-носителем и с TGF.

(e) GnRH, связанный с белком-носителем, с EGF и TGF.

(f) GnRH, связанный с белком-носителем, с VEGF и EGF.

Настоящим изобретением предусматривается способ выработки комбинированного иммунного ответа, который включает в себя лечение терапевтическими комбинациями, определяемыми в изобретении, которые могут быть использованы одновременно, раздельно или последовательно.

Настоящее изобретение описано далее более подробно на примере следующих процедур.

Получение иммуногенного препарата, который содержит мутантный GnRH, связанный с эпитопом Т-клеток-хелперов (D3-1) столбнячного анатоксина, как одного из компонентов комбинированных препаратов

Для того чтобы вызвать образование антител против GnRH, пептидный аналог GnRH, конъюгированный с белком-носителем (иммунокастрационная вакцина млекопитающего, ЕРО 959079), использовали для иммунизации. Пептидный аналог GnRH(pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Pro-Leu-Arg-Pro-Gly) и белок-носитель (эпитоп Т-клеток-хелперов столбнячного анатоксина) были химически синтезированы с использованием в качестве разделителей двух остатков глицина с помощью твердофазного метода и стратегии Boc/Bzl, используя «4-метилбензгидриламин» (МВН А-0,75 ммоль/г, ВАСНЕМ, Швейцария).

Гуморальный ответ против GnRH может быть получен посредством активной иммунизации природным GnRH или любым из его аналогов, связанных с белком-носителем. Кроме того, аналоги GnRH, его агонисты или антагонисты могут быть использованы как таковые в комбинированных препаратах для достижения синергического эффекта, выражающегося в снижении опухолевой массы, поскольку они прерывают или нарушают передачу сигнала посредством G-белка в клетках, несущих рецепторы к указанным компонентам. Антитела к GnRH также могут быть использованы в качестве комбинированных компонентов для получения пассивного иммунного ответа. Гонадотропины гипофиза лютеинизирующий гормон (LH) и фолликулостимулирующий гормон (FSH) также могут оказывать некоторое синергическое действие на определенные виды опухолей, если их комбинируют с факторами роста для получения аутоиммунного ответа.

Получение иммуногенного препарата, содержащего рекомбинантный человеческий эпидермальный фактор роста (hrEGF), связанный с белком-носителем, в качестве одного компонента комбинированных препаратов

Раствор рекомбинантного человеческого эпидермального фактора роста (hrEGF) (National Medicament Register Office, Cuba, HEBERMIN, No. 1266) в буфере PBS/MgCl₂ 10 мМ смешивали с раствором белка-носителя (рекомбинантный белок Р64, наружной мембраныNeisseria meningitides) в таком же растворителе и в отношении 1:5 моль hrEGF на моль белка. Затем 0,05% глутаральдегида добавляли до конечной концентрации от 0,05 до 0,1%. Смесь инкубировали в течение 1-3 часов при комнатной температуре и диализовали в буфере PBS/MgCl₂ 10 мМ по меньшей мере с тремя сменами диализного раствора (вакцинная композиция, содержащая аутогенный эпидермальный фактор роста или его фрагмент или его производное, проявляющая противоопухолевую активность и используемая в терапии злокачественных заболеваний, патент США № 5894018).

Гуморальный ответ к EGF может быть достигнут посредством иммунизации EGF или пептидом его рецептора, связанным с белком-носителем, усиливающим иммунный ответ, пассивно или непосредственным введением антител к EGF или антител к рецепторам EGF.

Последовательность EGF приблизительно на 30% гомологична последовательности трансформирующего фактора роста, TGF. Они конкурируют за одни и те же участки связывания мембранных рецепторов. Кроме того, рецепторные комплексы TGF/EGF альфа в различных типах опухолей человека были обнаружены в больших количествах. Очевидно, что гуморальный ответ на TGF важен в онкогенезе и в равной степени важен в синергическом эффекте, который описан для EGF.

Получение иммуногенного препарата, содержащего человеческий фактор роста сосудистого эндотелия (hVEGF), связанный с белком-носителем, в качестве одного из компонентов комбинированных препаратов

Гуморальный ответ на VEGF достигался путем иммунизации с помощью пептида VEGF, конъюгированного с белком-носителем (гемоцианин моллюска, KLH)(hVEGF-KLH). Конъюгация изоформы HVEGF₁₂₁ с KLN была достигнута с помощью растворимого карбодиимида.

Гуморальный ответ на VEGF также был достигнут посредством иммунизации пептидами VEGF или его рецептором, связанным с белком-носителем, усиливающим иммунный ответ, пассивно или путем прямого введения антител против рецепторов VEGF.

Получение комбинированного иммуногенного препарата GnRH и hrEGF

Комбинированный иммуногенный препарат был получен путем смешивания 750 мкг D3-1 и 250 мкг hrEGF-P64 в конечном объеме 0,5 мл.

Получение комбинированного иммуногенного препарата GnRH и hVEGF

Комбинированный иммуногенный препарат был получен путем смешивания 750 мкг D3-1 и 100 мкг hVEGF-KLH в конечном объеме 0,5 мл.

Краткое описание рисунков

На чертеже представлена оценка времени жизни копенгагенских крыс, которым перевили линейные опухолевые клетки Dunning R 3327-G, подвергнутые различным видам обработки.

Подробное описание отдельных аспектов/примеров

Настоящее изобретение иллюстрируется следующими примерами:

1. Перевивание линии опухолевых клеток R3327-G копенгагенским крысам

Линию опухолевых клеток Dunning R3327-G перевивали 9-12-недельным копенгагенским крысам (с приблизительным весом тела каждой составляющим 100 г), которых подвергали различным видам обработки, используя на животное 2×10⁶ клеток в среде для имплантации (RPMI 1640, бессывороточная, 0,5 мл), на латеральной части туловища между тазом и ребрами. Стопроцентная эффективность прикрепления была достигнута у животных через 90 дней.

2. Определение продолжительности жизни как критерия противоопухолевой активности у крыс, которым перевили линию опухолевых клеток Dunning 3327-G, подвергаемых различным видам обработки

Для эксперимента было образовано восемь групп по десять животных в каждой группе, из копенгагенских крыс, которым перевивали опухоли, как было описано ранее.

Экспериментальные группы:

1. Контрольные животные (иммунизированные буфером PBS в масляном адъюванте).

2. Хирургически кастрированные животные.

3. Животные, обработанные DES (диэтилстильбестрол).

4. Животные, иммунизированные пептидом D3-1 (GnRHm1-TT).

5. Животные, иммунизированные hrEGF-P64.

6. Животные, иммунизированные HVEGF-KLH.

7. Животные, иммунизированные комбинированным препаратом D3-1+hrEGF-P64.

8. Животные, иммунизированные комбинированным препаратом D3-1+hVEGF-KLH.

Используемая для обработки схема иммунизации включала 7 доз (3 дозы до перевивания опухоли и 4 дозы после перевивания), вводимых раз в две недели: 750 мкг D3-1, 250 мкг hrEGF-P64, 100 мкг hrEGF-KLH и комбинации D3-1+hrEGF-P64 и D3-1+hVEGF-KLH в объеме 0,5 мл в масляном адъюванте (полный адъювант Фрейнда был использован при первой иммунизации, и неполный адъювант Фрейнда был использован при дальнейшей стимуляции), подкожно, на 4 участках на любой стороне от позвоночника. Такую же дозу антигена, как доза, используемая для независимой обработки, применяли в комбинированных обработках.

Обработку DES делали время от времени, три раза в неделю при скорости 1 мл/кг/день, в течение продолжительности эксперимента, и начинали сразу же как только клетки были инокулированы.

Иммунизацию начинали за 30-45 дней до процедуры перевивки опухоли и продолжали до тех пор, пока 7 иммунизаций не было завершено; гуморальный ответ оценивали методом ELISA и выраженный в виде титра антител был выше величины разброса для ответов, вызванных каждым из антигенов, до инокуляции клеток.

Оценку эффектов обработки проводили один раз в неделю в течение всего периода эксперимента (13 месяцев). Эффект оценивали в виде продолжительности жизни в каждой экспериментальной группе. Данные показаны на чертеже.

3. Оценка уменьшения опухоли как критерия противоопухолевой активности у крыс, которым перевивали линейные опухолевые клетки Dunning R3327-G, при различных видах обработки

Для эксперимента было образовано восемь групп по десять животных в каждой группе, из копенгагенских крыс, которым перевивали опухоли, как было описано ранее.

Экспериментальные группы:

1. Контрольные животные (иммунизированные буфером PBS в масляном адъюванте).

2. Хирургически кастрированные животные.

3. Животные, обработанные DES (диэтилстильбестрол).

4. Животные, иммунизированные пептидом D3-1 (GnRHm1-TT).

5. Животные, иммунизированные hrEGF-P64.

6. Животные, иммунизированные HVEGF-KLH.

7. Животные, иммунизированные комбинированным препаратом D3-1+hrEGF-P64.

8. Животные, иммунизированные комбинированным препаратом D3-1+hVEGF-KLH.

Подобно предыдущей процедуре используемая для обработки схема иммунизации включала 7 доз (3 дозы до имплантации опухоли и 4 дозы после имплантации), вводимые раз в две недели: 750 мкг D3-1, 250 мкг hrEGF-P64, 100 мкг hVEGF-KLH и их комбинации в 0,5 мл, в масляном адъюванте (полный адъювант Фрейнда был использован при первой иммунизации, и неполный адъювант Фрейнда был использован при дальнейшей стимуляции), подкожно, на 4 участках на любой стороне от позвоночника.

Обработку DES делали время от времени, три раза в неделю при скорости 1 мг/кг/день, пока длился эксперимент, и начинали сразу же как только клетки были инокулированы.

Оценку экспериментальных результатов проводили после умерщвления (через три месяца после имплантации линии опухолевых клеток). Для того чтобы оценить влияние каждого вида обработки, опухоль сушили и взвешивали на технических весах. Эффект обработки (Е_{обработка}) рассчитывали согласно уравнению, которое представляет собой единицу, минус отношение среднего веса опухоли у обработанных животных (Р_{обработка}) к среднему весу опухоли у контрольных животных (Р_контр.):

Е_{обработка}=1-(Р_{обработка}/Р_контр) (1)

Ожидаемый эффект (Е_{теоретический}) для препаратов, составленных из двойных комбинаций, может быть рассчитан в случае, если каждый из эффектов не является взаимоисключающим (Caridad W., Guerra Bustillo, Ernesto Menendez Acuna, Rolando Barrera Morena, Esteban Egana Morales. "Esradistica", Editorial Pueblo y Educacion, 1989), согласно уравнению:

Е_{теоретический}=Е_Т1+Е_Т2-(Е_Т1·Е_Т2), (2)

где Е_Т1 представляет собой эффект обработки 1, а Е_Т2 означает эффект обработки 2.

Как показано в таблице 1, экспериментальный эффект, достигнутый под действием комбинаций (комбинированных препаратов), был выше, чем ожидаемый теоретический эффект, что свидетельствует о синергическом эффекте указанных комбинаций, проявляющемся в уменьшении размера опухоли.

Таблица 1Влияние различных видов обработок на копенгагенских крыс, которым перевивали опухолевые клетки линии Dunning R3327-G, оцениваемое после умерщвления (через три месяца после имплантации линейных опухолевых клеток)
Обработка	Вес опухоли (г) (среднее для десяти животных)	Эффект обработки	Теоретический эффект
Кастрированные животные	9,20	0,707	-
Контрольные животные (плацебо)	31,41	0,000	-
DES	12,66	0,597	-
D3-1	19,31	0,385	-
hrEGF-P64	25,43	0,190	-
hVEGF-KLH	21,72	0,309	-
D3-1+hEGFr-P64	12,14	0,613	0,502
D3-1+hVEGF-KLH	10,87	0,654	0,575

1. Фармацевтическая композиция для лечения неоплазии, содержащая GnRH или его пептидный аналог, необязательно связанный с белком-носителем, усиливающим иммунный ответ и регулирующий рост фактор, выбранный из EGF и VEGF, необязательно связанный с белком-носителем, усиливающим иммунный ответ.

2. Фармацевтическая композиция по п.1, где указанные GnRH, EGF и/или VEGF связаны с белком-носителем, усиливающим иммунный ответ, посредством конъюгации или образования химерных белков.

3. Фармацевтическая композиция по п.1 или 2, которая содержит пептидный аналог GnRH, имеющий последовательность pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Pro-Leu-Arg-Pro-Gly, связанную с белком-носителем, усиливающим иммунный ответ.

4. Фармацевтическая композиция по п.1 или 2, где указанный белок-носитель, усиливающий иммунный ответ, выбран из белков наружной мембраны Neisseria meningitides P1 и Р64.

5. Фармацевтическая композиция по п.1 или 2, где указанным белком-носителем, усиливающим иммунный ответ, является эпитоп Т-клеток-хелперов столбнячного анатоксина (ТТ).

6. Применение GnRH, необязательно связанного с белком-носителем, усиливающим иммунный ответ, для получения фармацевтической композиции для лечения неоплазии, в сочетании с регулирующим рост фактором, выбранным из EGF и VEGF, необязательно связанным с белком-носителем, усиливающим иммунный ответ.

7. Применение регулирующего рост фактора, выбранного из EGF и VEGF, необязательно связанного с белком-носителем, усиливающим иммунный ответ, для получения фармацевтической композиции для лечения неоплазии, в сочетании с GnRH, необязательно связанным с белком-носителем, усиливающим иммунный ответ.