Гены corynebacterium glutamicum, кодирующие белки, участвующие в метаболизме углерода и продуцировании энергии

Гены corynebacterium glutamicum, кодирующие белки, участвующие в метаболизме углерода и продуцировании энергии

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Родственные заявки

Данная заявка заявляет приоритет предварительной заявки на патент США с порядковым номером 60/141031, поданной 25 июня 1999 года, предварительной заявки на патент США с порядковым номером 60/143208, поданной 9 июля 1999 года, и предварительной заявки на патент США с порядковым номером 60/151572, поданной 31 августа 1999 года. Данная заявка заявляет также приоритет предыдущей заявки на патент Германии № 19931412.8, поданной 8 июля 1999 года, заявки на патент Германии № 19931413.6, поданной 8 июля 1999 года, заявки на патент Германии № 19931419.5, поданной 8 июля 1999 года, заявки на патент Германии № 19931420.9, поданной 8 июля 1999 года, заявки на патент Германии № 19931424.1, поданной 8 июля 1999 года, заявки на патент Германии № 19931428.4, поданной 8 июля 1999 года, заявки на патент Германии № 19931431.4, поданной 8 июля 1999 года, заявки на патент Германии № 19931433.0, поданной 8 июля 1999 года, заявки на патент Германии № 19931434.9, поданной 8 июля 1999 года, заявки на патент Германии № 19931510.8, поданной 8 июля 1999 года, заявки на патент Германии № 19931562.0, поданной 8 июля 1999 года, заявки на патент Германии № 19931634.1, поданной 8 июля 1999 года, заявки на патент Германии № 19932180.9, поданной 9 июля 1999 года, заявки на патент Германии № 19932227.9, поданной 9 июля 1999 года, заявки на патент Германии № 19932230.9, поданной 9 июля 1999 года, заявки на патент Германии № 19932924.9, поданной 14 июля 1999 года, заявки на патент Германии № 19932973.7, поданной 14 июля 1999 года, заявки на патент Германии № 19933005.0, поданной 14 июля 1999 года, заявки на патент Германии № 19940765.7, поданной 27 августа 1999 года, заявки на патент Германии № 19942076.9, поданной 3 сентября 1999 года, заявки на патент Германии № 19942079.3, поданной 3 сентября 1999 года, заявки на патент Германии № 19942086.6, поданной 3 сентября 1999 года, заявки на патент Германии № 19942087.4, поданной 3 сентября 1999 года, заявки на патент Германии № 19942088.2, поданной 3 сентября 1999 года, заявки на патент Германии № 19942095.5, поданной 3 сентября 1999 года, заявки на патент Германии № 19942123.4, поданной 3 сентября 1999 года и заявки на патент Германии № 19942125.0, поданной 3 сентября 1999 года. Полные содержания всех вышеуказанных заявок включены здесь в виде ссылки.

Предпосылки изобретения

Некоторые продукты и побочные продукты природно встречающихся метаболических процессов в клетках имеют применение в широком списке отраслей промышленности, в том числе в кормовой, пищевой, косметической и фармацевтической отраслях промышленности. Эти молекулы, совокупно называемые "химическими продуктами тонкого органического синтеза", включают органические кислоты, как входящие в состав белков (протеиногенные), так и не входящие в состав белков (не-протеиногенные) аминокислоты, нуклеотиды и нуклеозиды, липиды и жирные кислоты, диолы, углеводы, ароматические соединения, витамины и кофакторы и ферменты. Их получение наиболее удобно выполнять посредством крупномасштабной культуры бактерий, разработанной для продуцирования и секреции больших количеств одной или более желаемых молекул. Одним особенно применимым организмом для этой цели является Corynebacterium glutamicum, грамположительная, не патогенная бактерия. Посредством отбора штаммов был получен ряд мутантных штаммов, которые продуцируют ряд желаемых соединений. Однако отбор штаммов, улучшенных в отношении продуцирования конкретной молекулы, является трудоемким процессом, отнимающим много времени.

Сущность изобретения

Данное изобретение представляет новые бактериальные молекулы нуклеиновых кислот, которые имеют множество применений. Эти применения включают идентификацию микроорганизмов, которые могут быть использованы для получения химических продуктов тонкого органического синтеза, модуляции образования химических продуктов тонкого органического синтеза в С. glutamicum или родственных бактериях, типирования или идентификации С. glutamicum или родственных бактерий, в качестве ссылочных точек для картирования генома С. glutamicum и в качестве маркеров для трансформации. Эти новые молекулы нуклеиновых кислот кодируют белки, называемые здесь белками сахарного метаболизма и окислительного фосфорилирования (SMP).

С. glutamicum является грамположительной, аэробной бактерией, которую обычно используют в промышленности для крупномасштабного получения множества химических продуктов тонкого органического синтеза, а также для расщепления углеводородов (например, в разливах нефти) и для окисления терпеноидов. Таким образом, молекулы нуклеиновых кислот SMP данного изобретения могут быть использованы для идентификации микроорганизмов, которые могут быть использованы для получения химических продуктов тонкого органического синтеза, например, посредством ферментационных процессов. Модуляция экспрессии нуклеиновых кислот SMP данного изобретения или модификация последовательности молекул нуклеиновых кислот SMP данного изобретения может использоваться для модуляции образования одного или нескольких химических продуктов тонкого органического синтеза из микроорганизма (например, для улучшения выхода или получения одного или более химических продуктов тонкого органического синтеза из видов Corynebacterium или Brevibacterium).

Нуклеиновые кислоты SMP данного изобретения могут быть также использованы для идентификации организма как являющегося Corynebacterium glutamicum или близкородственной бактерией или для идентификации присутствия С. glutamicum или родственной бактерии в смешанной популяции микроорганизмов. Данное изобретение представляет последовательности нуклеиновых кислот ряда генов С. glutamicum; зондированием экстрагированной геномной ДНК культуры уникальной или смешанной популяции микроорганизмов при строгих условиях зондом, охватывающим участок гена С. glutamicum, который является уникальным в отношении этого организма, можно определить, присутствует ли данный организм. Хотя сама бактерия Corynebacterium glutamicum является непатогенной, она является родственной видам, патогенным в человеке, таким как Corynebacterium diphtheriae (возбудитель дифтерии); выявление таких организмов имеет важное клиническое значение.

Молекулы нуклеиновых кислот SMP данного изобретения могут также служить в качестве ссылочных точек для картирования генома С. glutamicum или геномов родственных организмов. Подобным образом эти молекулы, или их варианты или части, могут служить в качестве маркеров для генетически сконструированных видов Corynebacterium или Brevibacterium.

Белки SMP, кодируемые новыми молекулами нуклеиновых кислот данного изобретения, способны, например, выполнять функцию, участвующую в метаболизме углеродных соединений, таких как сахара, или в генерировании энергетических (энергоемких) молекул посредством таких процессов, как окислительное фосфорилирование в Corynebacterium glutamicum. При условии доступности клонирующих векторов для применения в Corynebacterium glutamicum, таких как векторы, описанные в Sinskey et al., U.S. Patent No. 4 649 110, и способов для генетической манипуляции С. glutamicum и родственных видов Brevibacterium (например, lactofermentum) (Yoshihama et al., J. Bacteriol. 162: 591-597 (1985); Katsumata et al., J. Bacteriol. 159: 306-311 (1984) и Santamaria et al., J. Gen. Microbiol. 130: 2237-2246 (1984)) молекулы нуклеиновых кислот данного изобретения могут быть использованы в генетической инженерии этого организма, чтобы сделать его лучшим или более эффективным продуцентом одного или большего количества химических продуктов тонкого органического синтеза. Эти улучшенные продуцирование или эффективность продуцирования химического продукта тонкого органического синтеза могут быть обусловлены прямым влиянием манипулирования геном данного изобретения или могут быть обусловлены опосредованным влиянием такого манипулирования.

Существует ряд механизмов, при помощи которых изменение белка SMP данного изобретения может непосредственно влиять на выход, продуцирование и/или эффективность продуцирования химического продукта тонкого органического синтеза из штамма С. glutamicum, включающего такой измененный белок. Расщепление высокоэнергетических углеродных молекул, таких как сахара, и превращение соединений, таких как НАДН и ФАДН₂, в соединения, содержащие высокоэнергетические фосфатные связи, через окислительное фосфорилирование приводит к образованию ряда соединений, которые сами могут быть желательными химическими продуктами тонкого органического синтеза, таких как пируват, АТФ, НАДН и ряд промежуточных сахарных соединений. Далее, эти энергетические (энергоемкие) молекулы (такие как АТФ) и восстанавливающие эквиваленты (такие как НАДН или НАДФН), продуцируемые этими метаболическими путями, используются в клетке для проведения реакций, которые в ином случае были бы энергетически неблагоприятными. Такие неблагоприятные реакции включают многие биосинтетические пути для химических продуктов тонкого органического синтеза. Посредством улучшения способности клеток использовать конкретный сахар (например, манипулированием генами, кодирующими ферменты, участвующие в расщеплении и превращении этого сахара в энергию для клетки) можно увеличить количество доступной энергии для того, чтобы сделать возможным протекание неблагоприятных, но желаемых метаболических реакций (например, биосинтеза желаемого химического продукта тонкого органического синтеза).

Мутагенез одного или более генов SMP данного изобретения может также приводить к образованию белков SMP, имеющих измененные активности, которые непосредственно влияют на продуцирование одного или большего количества химических продуктов тонкого органического синтеза из С. glutamicum. Например, увеличением эффективности использования одного или большего количества сахаров (так что превращение этого сахара в полезные энергетические молекулы улучшается) или увеличением эффективности превращения восстанавливающих эквивалентов в полезные энергетические молекулы (например, посредством улучшения эффективности окислительного фосфорилирования или активности АТФ-синтазы) можно увеличить количество высокоэнергетических соединений, доступных для клетки, для проведения обычно неблагоприятных метаболических процессов. Эти процессы включают образование клеточных стенок, транскрипцию, трансляцию и биосинтез соединений, необходимых для роста и деления клеток (например, нуклеотидов, аминокислот, витаминов, липидов и т.д.) (Lengeler et al. (1999) Biology of Prokaryotes, Thieme Verlag: Stuttgart, p. 88-109; 913-918; 875-899). Посредством улучшения роста и размножения этих сконструированных клеток можно как повысить жизнеспособность этих клеток в крупномасштабной культуре, так и улучшить скорость их деления, так что относительно большее число клеток могут выживать в культуре ферментера. Выход, продуктивность или эффективность продуцирования могут быть увеличены по меньшей мере вследствие присутствия большего числа жизнеспособных клеток, каждая из которых продуцирует желаемый химический продукт тонкого органического синтеза. Также многие продукты расщепления, продуцируемые во время метаболизма сахаров, могут использоваться клеткой в качестве предшественников или промежуточных продуктов в продуцировании других желательных продуктов, таких как химические продукты тонкого органического синтеза. Таким образом, посредством увеличения способности клетки метаболизировать сахара должно также увеличиваться число продуктов расщепления, доступных для клетки для других процессов.

Данное изобретение представляет новые молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют белки, называемые здесь белками SMP, которые способны, например, выполнять функцию, участвующую в метаболизме углеродных соединений, таких как сахара, и генерировании энергетических молекул при помощи таких процессов, как окислительное фосфорилирование, в Corynebacterium glutamicum. Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие белок SMP, называют здесь молекулами нуклеиновых кислот SMP. В предпочтительном варианте белок SMP участвует в превращении углеродных молекул и продуктов их расщепления в энергию, которая используется клеткой для метаболических процессов. Примеры таких белков включают белки, кодируемые генами, представленными в таблице 1.

Таким образом, один аспект данного изобретения относится к выделенным молекулам нуклеиновых кислот (например, кДНК, ДНК или РНК), содержащим нуклеотидную последовательность, кодирующую белок SMP или его биологически активные части, а также фрагментам нуклеиновых кислот, пригодным в качестве праймеров или гибридизационных зондов для обнаружения или амплификации SMP-кодирующей нуклеиновой кислоты (например, ДНК или мРНК). В особенно предпочтительных вариантах выделенная молекула нуклеиновой кислоты содержит одну из нуклеотидных последовательностей, представленных в виде имеющих нечетные номера SEQ ID NO в Списке последовательностей (например, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7...), или кодирующий участок или его комплемент одной из этих нуклеотидных последовательностей. В других особенно предпочтительных вариантах выделенная молекула нуклеиновой кислоты данного изобретения содержит нуклеотидную последовательность, которая гибридизуется с нуклеотидной последовательностью или является по меньшей мере на приблизительно 50%, предпочтительно по меньшей мере на приблизительно 60%, более предпочтительно по меньшей мере на приблизительно 70%, 80% или 90% и даже более предпочтительно по меньшей мере на приблизительно 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более гомологичной нуклеотидной последовательности, представленной в виде имеющих нечетные номера SEQ ID NO в Списке последовательностей (например, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7...), или ее части. В других предпочтительных вариантах выделенная молекула нуклеиновой кислоты кодирует одну из аминокислотных последовательностей, представленных в виде имеющих четные номера SEQ ID NO в Списке последовательностей (например, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8...). Предпочтительные белки SMP данного изобретения также предпочтительно имеют по меньшей мере одну из описанных здесь активностей SMP.

В другом варианте выделенная молекула нуклеиновой кислоты кодирует белок или его часть, причем этот белок или его часть включает аминокислотную последовательность, которая является достаточно гомологичной аминокислотной последовательности данного изобретения (например, последовательности, имеющей четный номер SEQ ID NO: в Списке последовательностей), например, достаточно гомологичной аминокислотной последовательности данного изобретения, так что этот белок или его часть сохраняет активность SMP. Предпочтительно белок или его часть, кодируемые этой молекулой нуклеиновой кислоты, сохраняет способность выполнять функцию, участвующую в метаболизме углеродных соединений, таких как сахара, или генерировании энергетических молекул (например, АТФ) при помощи таких процессов, как окислительное фосфорилирование, в Corynebacterium glutamicum. В одном варианте белок, кодируемый указанной молекулой нуклеиновой кислоты, является по меньшей мере на приблизительно 50%, предпочтительно по меньшей мере на приблизительно 60% и более предпочтительно по меньшей мере на приблизительно 70%, 80% или 90% и наиболее предпочтительно по меньшей мере на приблизительно 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более гомологичным аминокислотной последовательности данного изобретения (например, полной аминокислотной последовательности, выбранной из аминокислотных последовательностей, имеющих четные номера SEQ ID NO: в Списке последовательностей). В другом предпочтительном варианте этот белок является полноразмерным белком С. glutamicum, который является по существу гомологичным полной аминокислотной последовательности данного изобретения, кодируемой открытой рамкой считывания, показанной в соответствующих имеющих нечетные номера SEQ ID NO в Списке последовательностей (например, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7...).

В другом предпочтительном варианте выделенная молекула нуклеиновой кислоты происходит из С. glutamicum и кодирует белок (например, слитый белок SMP), который включает биологически активный домен, который по меньшей мере на приблизительно 50% или более гомологичен одной из аминокислотных последовательностей данного изобретения (например, одной последовательности из имеющих четные номера SEQ ID NO: в Списке последовательностей) и способен выполнять функцию, участвующую в метаболизме углеродных соединений, таких как сахара, и генерировании энергетических молекул (например, АТФ) при помощи таких процессов, как окислительное фосфорилирование, в Corynebacterium glutamicum, или имеет одну или более активностей, представленных в таблице 1, и также включает гетерологичные последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие гетерологичные полипептид или регуляторные участки.

В другом варианте выделенная молекула нуклеиновой кислоты имеет длину по меньшей мере 15 нуклеотидов и гибридизуется при строгих условиях с молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность данного изобретения (например, последовательность, имеющую нечетный номер SEQ ID NO: в Списке последовательностей). Предпочтительно выделенная молекула нуклеиновой кислоты соответствует природно встречающейся молекуле нуклеиновой кислоты. Более предпочтительно выделенная нуклеиновая кислота кодирует природно встречающийся белок SMP С. glutamicum или его биологически активную часть.

Другой аспект данного изобретения относится к векторам, например рекомбинантным экспрессирующим векторам, содержащим молекулы нуклеиновых кислот данного изобретения, и клеткам-хозяевам, в которые были введены такие векторы. В одном варианте такую клетку-хозяина используют для получения белка SMP культивированием клетки-хозяина в подходящей среде. Затем белок SMP может быть выделен из этой среды или из клетки-хозяина.

Еще один аспект данного изобретения относится к генетически измененному микроорганизму, в котором ген SMP был введен или изменен. В одном варианте геном микроорганизма был изменен введением молекулы нуклеиновой кислоты данного изобретения, кодирующей последовательность SMP дикого типа или мутированную последовательность SMP, в качестве трансгена. В другом варианте эндогенный ген SMP в геноме микроорганизма был изменен, например функционально нарушен, гомологичной рекомбинацией с измененным геном SMP. В другом варианте эндогенный или введенный ген SMP в микроорганизме был изменен одной или несколькими точковыми мутациями, делециями или инверсиями, но все еще кодирует функциональный ген белка SMP. Еще в одном варианте один или несколько регуляторных участков (например, промотор, репрессор или индуктор) гена SMP в микроорганизме был изменен (например, делецией, укорочением, инверсией или точковой мутацией), так что экспрессия гена SMP является модулированной. В предпочтительном варианте этот микроорганизм принадлежит к роду Corynebacterium или Brevibacterium, причем особенно предпочтительным является Corynebacterium glutamicum. В предпочтительном варианте этот микроорганизм используют также для получения желаемого соединения, такого как аминокислота, причем особенно предпочтительным является лизин.

В другом аспекте данное изобретение представляет способ идентификации присутствия или активности Corynebacterium diphtheriae в субъекте. Этот способ включает в себя обнаружение одной или более последовательностей нуклеиновых кислот или аминокислотных последовательностей данного изобретения (например, последовательностей, представленных в Списке последовательностей в виде SEQ ID NO:1-782) в субъекте, детектированием тем самым присутствия или активности Corynebacterium diphtheriae в субъекте.

Еще один аспект данного изобретения относится к выделенным белку SMP или его части, например его биологически активной части. В предпочтительном варианте выделенные белок SMP или его часть может выполнять функцию, участвующую в метаболизме углеродных соединений, таких как сахара, или в генерировании энергетических молекул (например, АТФ) при помощи таких процессов, как окислительное фосфорилирование, в Corynebacterium glutamicum. В другом предпочтительном варианте выделенные белок SMP или его часть является достаточно гомологичным аминокислотной последовательности данного изобретения (например, последовательности, имеющей четный номер SEQ ID NO: в Списке последовательностей), так что этот белок или его часть сохраняет способность выполнять функцию, участвующую в метаболизме углеродных соединений, таких как сахара, или в генерировании энергетических молекул (например, АТФ) при помощи таких процессов, как окислительное фосфорилирование, в Corynebacterium glutamicum.

Данное изобретение представляет также получение выделенного белка SMP. В предпочтительных вариантах белок SMP содержит аминокислотную последовательность данного изобретения (например, последовательность, имеющую четный номер SEQ ID NO: Списка последовательностей). В другом предпочтительном варианте данное изобретение относится к выделенному полноразмерному белку, который является по существу гомологичным полной аминокислотной последовательности данного изобретения (например, последовательности, имеющей четный номер SEQ ID NO: Списка последовательностей) (кодируемому открытой рамкой считывания, приведенной в соответствующих последовательностях, имеющих нечетные номера SEQ ID NO: Списка последовательностей). Еще в одном варианте этот белок является по меньшей мере на приблизительно 50%, предпочтительно по меньшей мере на приблизительно 60% и более предпочтительно по меньшей мере на приблизительно 70%, 80% или 90% и наиболее предпочтительно по меньшей мере на приблизительно 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более гомологичным полной аминокислотной последовательности данного изобретения (например, последовательности, имеющей четный номер SEQ ID NO: Списка последовательностей). В других вариантах выделенный белок SMP содержит аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на приблизительно 50% или более гомологичной одной из аминокислотных последовательностей данного изобретения (например, последовательности имеющей четный номер SEQ ID NO: Списка последовательностей), и способен выполнять функцию, участвующую в метаболизме углеродных соединений, таких как сахара, или в генерировании энергетических молекул (например, АТФ) при помощи таких процессов, как окислительное фосфорилирование, в Corynebacterium glutamicum, или имеет одну или несколько активностей, приведенных в таблице 1.

Альтернативно, выделенный белок SMP может содержать аминокислотную последовательность, которая кодируется нуклеотидной последовательностью, которая гибридизуется, например гибридизуется при строгих условиях, с нуклеотидной последовательностью или является по меньшей мере на приблизительно 50%, предпочтительно по меньшей мере на приблизительно 60%, более предпочтительно по меньшей мере на приблизительно 70%, 80% или 90% и даже более предпочтительно по меньшей мере на приблизительно 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более гомологичной нуклеотидной последовательности одной из имеющих четные номера SEQ ID NO:, представленных в Списке последовательностей. Также предпочтительно, чтобы предпочтительные формы белков SMP имели также одну или несколько из биологических активностей SMP, описанных здесь.

Полипептид SMP или его биологически активная часть могут быть функционально связаны с полипептидом не-SMP с образованием слитого белка. В предпочтительных вариантах этот слитый белок имеет активность, которая отличается от активности одного белка SMP. В других предпочтительных вариантах этот слитый белок выполняет функцию, участвующую в метаболизме углеродных соединений, таких как сахара, или в генерировании энергетических молекул (например, АТФ) при помощи таких процессов, как окислительное фосфорилирование, в Corynebacterium glutamicum. В особенно предпочтительных вариантах интеграция этого слитого белка в клетку-хозяина модулирует продуцирование желаемого соединения из клетки.

В другом аспекте данное изобретение представляет способы для скрининга молекул, которые модулируют активность белка SMP, либо посредством взаимодействия с самим белком или субстратом или партнером связывания белка SMP, либо посредством модуляции транскрипции или трансляции молекулы нуклеиновой кислоты SMP данного изобретения.

Другой аспект данного изобретения относится к способу получения химического продукта тонкого органического синтеза. Этот способ предусматривает культивирование клетки, содержащей вектор, направляющий экспрессию молекулы нуклеиновой кислоты SMP данного изобретения таким образом, что образуется химический продукт тонкого орагического синтеза. В предпочтительном варианте этот способ дополнительно включает стадию получения клетки, содержащей такой вектор, в которой клетку трансфицируют вектором, направляющим экспрессию нуклеиновой кислоты SMP. В другом предпочтительном варианте этот способ дополнительно включает стадию извлечения химических продуктов тонкого органического синтеза из культуры. В особенно предпочтительном варианте эта клетка является клеткой из рода Corynebacterium или Brevibacterium или выбрана из штаммов, приведенных в таблице 3.

Другой аспект данного изобретения относится к способам модуляции продуцирования молекулы из микроорганизма. Такие способы включают контактирование клетки с агентом, который модулирует активность белка SMP или экспрессию нуклеиновой кислоты SMP, так что связанная с клеткой активность является измененной относительно той же самой активности в отсутствие этого агента. В предпочтительном варианте клетку модулируют в отношении одного или нескольких путей метаболизма углерода С. glutamicum или в отношении продуцирования энергии через такие процессы, как окислительное фосфорилирование, так что выходы или скорость продуцирования желаемого химического продукта тонкого органического синтеза этим микроорганизмом улучшаются. Агент, который модулирует активность белка SMP, может быть агентом, стимулирующим активность белка SMP или экспрессию нуклеиновой кислоты SMP. Примеры агентов, стимулирующих активность белка SMP или экспрессию нуклеиновой кислоты SMP, включают небольшие молекулы, активные белки SMP и нуклеиновые кислоты, кодирующие белки SMP, которые были введены в клетку. Примеры агентов, ингибирующих активность SMP или экспрессию, включают небольшие молекулы и антисмысловые молекулы нуклеиновых кислот SMP.

Другой аспект данного изобретения относится к способам модуляции выходов желаемого соединения из клетки, включающим введение гена SMP дикого типа или мутантного SMP в клетку, либо сохраняемого на отдельной плазмиде, либо интегрируемого в геном клетки-хозяина. При интегрировании в геном такая интеграция может быть случайной или она может происходить посредством гомологичной рекомбинации, так что нативный ген заменяется вводимой копией, обусловливая модуляцию продуцирования желаемого соединения из этой клетки. В предпочтительном варианте указанные выходы увеличиваются. В другом предпочтительном варианте указанный химический продукт является химическим продуктом тонкого органического синтеза. В особенно конкретном предпочтительном варианте указанный химический продукт тонкого органического синтеза является аминокислотой. В особенно предпочтительном варианте указанная аминокислота является L-лизином.

Подробное описание изобретения

Данное изобретение представляет молекулы нуклеиновой кислоты и белка SMP, которые участвуют в метаболизме углеродных соединений, таких как сахара, и в генерировании энергетических молекул при помощи таких процессов, как окислительное фосфорилирование, в Corynebacterium glutamicum. Молекулы данного изобретения могут быть использованы в модуляции получения химических продуктов тонкого органического синтеза из микроорганизмов, таких как С. glutamicum, непосредственно (например, когда сверхэкспрессия или оптимизация белка гликолитического пути оказывает прямое действие на выход, продуктивность и/или эффективность продуцирования, например, пирувата из модифицированного С. glutamicum) или могут иметь опосредованное действие, которое тем не менее приводит к увеличению выхода, продуцирования и/или эффективности продуцирования желаемого соединения (например, когда модуляция белков, участвующих в окислительном фосфорилировании, приводит к изменениям в количестве энергии, доступной для проведения необходимых метаболических процессов и других клеточных функций, таких как биосинтез нуклеиновых кислот и белка и транскрипция/трансляция). Аспекты данного изобретения дополнительно объясняются ниже.

I. Химические продукты тонкого органического синтеза

Термин «химический продукт тонкого органического синтеза» является признанным в данной области и включает в себя молекулы, продуцируемые организмом, которые имеют применения в различных отраслях промышленности, таких как, но не только, фармацевтическая, сельскохозяйственная и косметическая отрасли промышленности. Такие соединения включают органические кислоты, такие как винная кислота, итаконовая кислота и диаминопимелиновая кислота, как протеиногенные, так и не-протеиногенные аминокислоты, пуриновые и пиримидиновые основания, нуклеозиды и нуклеотиды (описанные, например, в Kuninaka, A. (1996) Nucleotides and related compounds, p. 561-612, in Biotechnology vol. 6, Rehm et al., eds. VCH: Weinheim, и содержащихся в них ссылках), липиды, как насыщенные, так и ненасыщенные жирные кислоты (например, арахидоновую кислоту), диолы (например, пропандиол и бутандиол), углеводы (например, гиалуроновую кислоту и трегалозу), ароматические соединения (например, ароматические амины, ванилин и индиго), витамины и кофакторы (описанные в Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. A27, "Vitamins", p. 443-613 (1996) VCH: Weinheim и ссылках в них; и Ong, A.S., Niki, E. and Packer, L. (1995) "Nutrition, Lipids, Health, and Disease" Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia, and Society for Free Radical Research-Asia, held Sept. 1-3, 1994 at Penang, Malaysia, AOCS Press, (1995)), ферменты, поликетиды (Cane et al., (1998) Science 282: 63-68) и все другие химические продукты, описанные в Gutcho (1983) Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation, ISBN: 0818805086 и имеющихся в этой работе ссылках. Метаболизм и применения некоторых из этих химических продуктов тонкого органического синтеза объясняются дополнительно ниже.

А. Метаболизм и применения аминокислот

Аминокислоты составляют основные структурные единицы всех белков и как таковые являются незаменимыми для нормального клеточного функционирования во всех организмах. Термин «аминокислота» является признанным в данной области. Протеиногенные аминокислоты, которыми являются 20 видов, служат в качестве структурных единиц для белков, в которых они связаны пептидными связями, тогда как не-протеиногенные аминокислоты (сотни которых известны) обычно не обнаруживаются в белках (см. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. A2, p. 57-97 VCH: Weinheim (1985)). Аминокислоты могут быть в D- или L-оптической конфигурации, хотя L-аминокислоты являются обычно единственным типом, обнаруживаемым в природно встречающихся белках. Биосинтетические пути и пути разложения каждой из 20 протеиногенных аминокислот были хорошо охарактеризованы как в прокариотических, так и в эукариотических клетках (см., например, Stryer, L. Biochemistry, 3^rd edition, pages 578-590 (1988)). «Незаменимые» аминокислоты (гистидин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, треонин, триптофан и валин), названные так, поскольку они обычно являются необходимыми в питании вследствие сложности их биосинтеза, легко превращаются посредством простых биосинтетических путей в остальные 11 «не-незаменимых» аминокислот (аланин, аргинин, аспарагин, аспартат, цистеин, глутамат, глутамин, глицин, пролин, серин и тирозин). Высшие животные действительно сохраняют способность синтезировать некоторые из этих аминокислот, но незаменимые аминокислоты должны предоставляться из пищевого рациона, для того чтобы имел место нормальный синтез белков.

Помимо их функции в биосинтезе белков, эти аминокислоты сами по себе представляют интерес, и было обнаружено, что многие из них имеют различные применения в кормовой, пищевой, химической, косметической, сельскохозяйственной и фармацевтической отраслях промышленности. Лизин является важной аминокислотой в питании не только человека, но также моногастрических животных (животных с однокамерным желудком), таких как домашняя птица и свинья. Глутамат наиболее часто используется в качестве вкусовой добавки (мононатрий-глутамат, MSG) и широко применяется в пищевой промышленности, так же как и аспартат, фенилаланин, глицин и цистеин. Глицин, L-метионин и триптофан используются в фармацевтической промышленности. Глутамин, валин, лейцин, изолейцин, гистидин, аргинин, пролин, серин и аланин применяют как в фармацевтической, так и в косметической промышленности. Треонин, триптофан и D/L-метионин являются общепринятыми пищевыми добавками (Leuchtenberger, W. (1996) Amino acids - technical production and use, p. 466-502 in Rehm et al., (eds.) Biotechnology vol. 6, chapter 14a, VCH: Weinheim). Кроме того, было обнаружено, что эти аминокислоты применимы в качестве предшественников для синтеза синтетических аминокислот и белков, таких как N-ацетилцистеин, S-карбоксиметил-L-цистеин, (S)-5-гидрокситриптофан и другие, описанные в Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. A2, p. 57-97 VCH: Weinheim, 1985.

Биосинтез этих природных аминокислот в организмах, способных их продуцировать, таких как бактерии, был подробно охарактеризован (в отношении обзора бактериального биосинтеза аминокислот и его регуляции см., например, Umbarger, H.E. (1978) Ann. Rev. Biochem. 47: 533-606). Глутамат синтезируется восстановительным аминированием α-кетоглутарата, промежуточного продукта цикла лимонной кислоты. Глутамин, пролин и аргинин, каждый, образуются затем из глутамата. Биосинтез серина является трехстадийным процессом, начинающимся с 3-фосфоглицерата (промежуточного продукта в гликолизе) и приводящим к этой аминокислоте после стадий окисления, переаминирования и гидролиза. Как цистеин, так и глицин образуются из серина; первый посредством конденсации гомоцистеина с серином, а последний переносом β-углеродного атома боковой цепи к тетрагидрофолату, в реакции, катализируемой серин-трансгидроксиметилазой. Фенилаланин и тирозин синтезируются из предшественников гликолитического и пентозофосфатного пути эритрозо-4-фосфата и фосфоенолпирувата в 9-стадийном биосинтетическом пути, который отличается только на конечных двух стадиях после синтеза префената. Триптофан также образуется из этих двух исходных молекул, но его синтез является 11-стадийным путем. Тирозин может быть также синтезирован из фенилаланина, в реакции, катализируемой фенилаланингидроксилазой. Аланин, валин и лейцин - все являются биосинтетическими продуктами пирувата, конечного продукта гликолиза. Аспартат образуется из оксалоацетата, промежуточного продукта цикла лимонной кислоты. Аспарагин, метионин, треонин и лизин, каждый, образуются преобразованием аспартата. Изолейцин образуется из треонина. Сложный 9-стадийный путь приводит к образованию гистидина из 5-фосфорибозил-1-пирофосфата, активированного сахара.

Аминокислоты в превышающем потребности белкового синтеза клетки количестве не могут запасаться и вместо этого разрушаются с образованием промежуточных продуктов для основных метаболических путей клетки (в отношении обзора см. Stryer, L. Biochemistry 3^rd ed. Ch. 21 "Amino Acid Degradation and the Urea Cycle", p. 495-516 (1998)). Хотя клетка способна превращать нежелательные аминокислоты в полезные метаболические промежуточные продукты, получение аминокислот является дорогостоящим в отношении энергии, молекул предшественников и ферментов, необходимых для их синтеза. Таким образом, неудивительно, что биосинтез аминокислот регулируется ингибированием по типу обратной связи, в котором присутствие конкретной аминокислоты служит для замедления или полной остановки ее собственного образования (в отношении обзора механизмов по типу обратной связи в путях биосинтеза аминокислот см. Stryer, L. Biochemistry 3^rd ed. Ch. 24: "Biosynthesis of Amino Acids and Heme", p. 575-600 (1988)). Таким образом, выход любой конкретной аминокислоты лимитирован количеством этой аминокислоты, присутствующим в клетке.

В. Метаболизм и применения витаминов, кофакторов и нутрацевтических веществ (пищевых добавок)

Витамины, кофакторы и нутрацевтические вещества (пищевые добавки) составляют другую группу молекул, которые высшие животные не синтезируют вследствие утраты способности их синтеза и которые, следовательно, должны приниматься животными с пищей, хотя они легко синтезируются другими организмами, такими как бактерии. Эти молекулы либо сами являются биологич