Антигенные матрицы для лечения заболевания костей

Антигенные матрицы для лечения заболевания костей

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПРЕДПОСЫЛКА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Область изобретения

Данное изобретение относится к областям молекулярной биологии, вирусологии, иммунологии и медицины. Изобретение относится к композиции, содержащей упорядоченную и повторяющуюся матрицу антигенов или антигенных детерминант и, в частности, матрицу белка RANKL, фрагмента RANKL или пептида RANKL. Более конкретно, изобретение относится к композиции, содержащей вирусоподобную частицу и по меньшей мере один связанный с ней белок RANKL, фрагмент RANKL или пептид RANKL. Изобретение также относится к способу получения конъюгатов и, соответственно, упорядоченных и повторяющихся матриц. Композиции согласно изобретению применимы для получения вакцин для лечения заболеваний кости и в качестве фармацевтической вакцины для профилактики или лечения заболеваний кости и для эффективной индукции иммунных ответов, в частности гуморальных ответов. Кроме того, композиции согласно изобретению особенно применимы для эффективной индукции специфичных для аутоантигенов иммунных ответов в указанном контексте.

Связанная область

Живая кость постоянно обновляется в результате сбалансированных и согласованных процессов ремоделирования. В основном два типа клеток вносят вклад в указанное ремоделирование: остеобласты необходимы для образования кости, тогда как остеокласты стимулируют распад костного матрикса и солюбилизацию гидроксиапатита. У молодых людей с растущими костями скорость образования кости превышает скорость резорбции кости, тогда как у более старших людей скорость резорбции может превышать образование и приводить к чистой потере минеральной плотности кости и/или костной массы. В последнем случае прочность костей ослабевает, и это приводит к повышенному риску переломов, а также медленному и неполному восстановлению сломанных костей. Известно, что множество состояний у человека связано с дисбалансом в ремоделировании костей.

В последнее время описаны три белка, которые являются ключевыми белками, вовлеченными в образование остеокластов из гематопоэтических клеток-предшественников и в регуляцию ремоделирования кости. RANKL (лиганд активатора рецептора NFkB), который также называют TNFSF11 (представитель 11 суперсемейства фактора некроза опухоли), TRANCE (TNF-родственный индуцируемый при активации цитокин), ODF (фактор дифференцировки остеокластов) или OPGL (лиганд остеопротегерина), является трансмембранным белком из 245 аминокислот, который образует гомотримеры. Часть внеклеточной области RANKL может быть удалена TACE-подобной протеазой. Кроме того, описаны варианты сплайсинга, в которых отсутствует трансмембранная область. Удаляемая часть RANKL содержит домен, который в высокой степени гомологичен TNF-α (Lum, L., et al., J. Biol. Chem. 274: 13613-13618 (2000)).

Способы получения белка RANKL и фрагментов RANKL описаны в WO 9846751, US 5843678, WO 98259958, US 6242586, WO 9828426, US 6242213, WO 9929865, JP 2000102390 и WO 0015807.

RANKL взаимодействует с трансмембранной молекулой на остеокластах, называемой RANK (активатор рецептора NFkB). Это взаимодействие приводит к активации предшественника остеокласта и заканчивается образованием активных резорбирующих кость остеокластов. In vivo растворимый рецептор-ловушка, называемый остеопротегерином, вовлечен в регуляцию остеокластогенеза благодаря его способности связываться с RANKL и ингибировать взаимодействие RANKL с его рецептором RANK. Указанное ингибирование приводит к подавлению остеокластогенеза и, таким образом, обеспечивает способ, позволяющий остановить чрезмерную резорбцию кости. Взаимодействие RANKL с его рецептором RANK можно подавить рекомбинантным остеопротегерином и растворимым слитым белком RANK-Fc. В соответствии с данными наблюдениями, у RANKL- и RANK-дефицитных мышей развивается остеопетроз, тогда как у сверхэкспрессирующих RANKL трансгенных мышей, а также у мышей с дефицитом остеопротегерина развивается остеопороз (Kong YY., et al., Nature 397: 315-322 (1999), Kim, N., et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 97: 10905-10910 (2000), Dougall, B., et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 97: 1566-1571 (1999), Bucay, N., et al., Genes Dev. 12: 1260-1268 (1998)).

Важное значение системы RANKL-RANK-остеопротегерин, кроме того, подтверждено в животной модели остеопороза на грызунах, индуцированного дефицитом эстрогенов. Рекомбинантный остеопротегерин полностью отменял индуцированную овариэктомией потерю костной ткани (Simonet, W.S., et al. Cell 89: 309-319 (1997).

В модели индуцированного адъювантом артрита инъекцией остеопротегерина можно было предотвратить потерю кости и деструкцию хряща, но не воспаление (опухание лапы). Помимо экспрессии на клетках стромы, RANKL также экспрессируется на T-клетках, и RANK обнаружен на антигенпрезентирующих клетках. Предполагается, что во время артритической реакции активированные T-клетки с повышенной экспрессией RANKL опосредуют усиление остеокластогенеза и последующую потерю кости. Взаимодействие RANKL с RANK также увеличивает долговечность и адъювантные свойства дендритных клеток (Kong Y.Y., et al., Nature 402: 304-309 (1999)).

Разрушение альвеолярной кости и последующая утрата зубов наблюдается при периодонтальных инфекциях. In vivo ингибирование функции остеопротегерином уменьшает деструкцию альвеолярной кости и уменьшает количество периодонтальных остеокластов после заражения микробами (Teng, Y.T.A., et al., J. Clin. Invest. 106: R59-R67 (2000).

Опухоли костей и некоторые опухолевые метастазы характеризуются повышенной резорбцией кости вследствие повышенного остеокластогенеза (Hofbauer, L.C. and Heufelder A.E., J. Clin. Endocrin. Met. 85: 2355-2363 (2000). Показано, что остеопротегерин ингибирует индуцированный раком простаты остеокластогенез и предотвращает рост опухоли простаты в костях мышей (Zhang Y., et al., J. Clin. Invest. 107:1219-1220 (2001). Он также уменьшает боль на поздних стадиях рака кости у мышей (Luger N.M., et al., Cancer Res. 61: 4038-4047 (2001)). Множественная миелома является злокачественным B-клеточным заболеванием, характеризуемым накоплением плазматических клеток в костном мозге и развитием остеолитического заболевания кости. В мышиных моделях множественной миеломы инъекция остеопротегерина или слитого белка RANK-Fc предотвращала развитие литических повреждений кости и препятствовала прогрессированию миеломы (Pearse RN., et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 98: 11581-11586 (2001).

Центральным в этиологии асептического ослабления имплантатов простаты является перипростатический остеолизис на границе кость-имплантат, который вызван воспалением, индуцированным частицами износа. Фибробластоподобные синовиоциты, трансфицированные остеопротегерином, были способны предотвращать индуцированный частицами износа остеокластогенез в мышиной модели (Gouter J.J., et al., J. Orthop. Res. 202:169-173 (2002)).

С высокой клинической частотой наблюдается кальцификация сосудов в популяции пациентов с остеопорозом. Участие системы RANKL-RANK-остеопротегерин показано посредством обнаружения того, что у мышей с дефицитом остеопротегерина наблюдалась кальцификация артерий, которая могла быть обратима с помощью рекомбинантного остеопротегерина (Min, H., et al., J. Exp. Med. 192: 463-474 (2000)).

Все указанные данные указывают на ключевое значение системы RANKL-RANK-остеопротегерин в регуляции резорбции кости при различных патологических состояниях. До настоящего времени ингибирование потери кости главным образом показано при инъекции рекомбинантного остеопротегерина или слитого белка RANK-Fc. Теоретически иммунизация животного RANKL должна обеспечивать продукцию RANKL-специфичных антител, которые посредством связывания с сайтом связывания RANK или стерического ингибирования должны препятствовать остеокластогенезу.

Однако до настоящего времени ничего не сообщалось о вакцинации белком или пептидом RANKL. Более того, не получено свидетельств того, что вакцины могут быть эффективными для защиты от заболеваний кости, так как, в частности, обычно трудно индуцировать гуморальные ответы на собственные молекулы в результате обычной вакцинации.

Одним из способов повышения эффективности вакцинации является увеличение степени повторяемости применяемого антигена. В отличие от изолированных белков вирусы индуцируют немедленные и эффективные иммунные ответы в отсутствие каких-либо адъювантов, как с помощью T-клеток, так и без нее (Bachmann and Zinkernagel, Ann. Rev. Immunol. 15: 235-270 (1991)). Хотя вирусы часто состоят из небольшого количества белков, они способны запускать намного более сильные иммунные ответы, чем их изолированные компоненты. В случае ответов B-клеток известно, что одним из ключевых факторов для иммуногенности вирусов является повторяемость и порядок поверхностных эпитопов. У многих вирусов обнаружена квазикристаллическая поверхность, на которой экспонирована регулярная матрица эпитопов, которая эффективно перекрестно связывает специфичные для эпитопов иммуноглобулины на B-клетках (Bachmann and Zinkernagel, Immunol. Today 17: 553-558 (1996)). Указанное перекрестное связывание поверхностных иммуноглобулинов на B-клетках является мощным сигналом активации, который непосредственно индуцирует прохождение клеточного цикла и продукцию IgM-антител. Кроме того, такие стимулированные B-клетки способны активировать хелперные T-клетки, которые, в свою очередь, индуцируют переключение с продукции IgM- на продукцию IgG-антител в B-клетках и образование долгоживущих B-клеток памяти - цель любой вакцинации (Bachmann and Zinkernagel, Ann. Rev. Immunol. 15:235-270 (1997)). Вирусная структура связана даже с образованием анти-антител, происходящим при аутоиммунном заболевании и являющимся частью естественного ответа на патогены (см. Fehr, T., et al., J Exp. Med. 185: 1785-1792 (1997)). Таким образом, антитела, презентированные на высокоорганизованной вирусной поверхности, способны индуцировать мощные ответы в виде анти-антител.

Однако, как указано, обычно иммунная система не может продуцировать антитела против структур собственного организма. В случае растворимых антигенов, присутствующих в низкой концентрации, это является следствием толерантности на уровне Th-клеток. При таких условиях связывание аутоантигена с носителем, который может обеспечивать T-помощь, может нарушить толерантность. Для растворимых белков, присутствующих в высоких концентрациях, или мембранных белков в низкой концентрации толерантными могут быть B- и Th-клетки. Однако B-клеточная толерантность может быть обратимой (анергия) и может быть нарушена введением антигена в высокоорганизованной форме, связанного с чужеродным носителем (Bachmann and Zinkernagel, Ann. Rev. Immunol. 15: 235-270 (1997)).

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторы обнаружили, что белки RANKL, фрагменты RANKL или пептиды RANKL, которые связаны с центральной частицей, имеющей структуру с присущей ей повторяющейся организацией и, таким образом, в частности с вирусоподобными частицами (VLP) и субъединицами VLP, соответственно, приводящими к образованию высокоупорядоченных и повторяющихся конъюгатов, представляют собой эффективные иммуногены для индукции антител, специфичных в отношении RANKL. Антитела способны, соответственно, блокировать и нейтрализовать взаимодействие RANKL с его рецептором RANK. Таким образом, данное изобретение относится к терапевтическому способу лечения заболеваний кости, который основан на упорядоченной и повторяющейся матрице RANKL-центральная частица, и, в частности, к VLP-RANKL-конъюгату и -матрице, соответственно. Указанное терапевтическое средство способно индуцировать высокие титры анти-RANKL-антител у вакцинированного животного.

Таким образом, данное изобретение относится к композиции, содержащей (a) центральную частицу по меньшей мере с одним первым сайтом связывания; и (b) по меньшей мере один антиген или антигенную детерминанту по меньшей мере с одним вторым сайтом связывания, где указанный антиген или антигенная детерминанта является белком RANKL, фрагментом RANKL или пептидом RANKL и где указанный второй сайт связывания выбран из группы, состоящей из (i) сайта связывания неприродного происхождения с указанным антигеном или антигенной детерминантой; и (ii) сайта связывания природного происхождения с указанным антигеном или антигенной детерминантой, где указанный второй сайт связывания способен к ассоциации с указанным первым сайтом связывания; и где указанный антиген или антигенная детерминанта и указанная центральная частица взаимодействуют посредством указанной ассоциации, образуя упорядоченную и повторяющуюся антигенную матрицу. Предпочтительными вариантами центральных частиц, подходящих для применения в данном изобретении, являются вирус, вирусоподобная частица, бактериофаг, бактериальная фимбрия или жгутик или любая другая центральная частица, имеющая присущую ей повторяющуюся структуру, способную образовывать упорядоченную и повторяющуюся антигенную матрицу согласно данному изобретению.

Более конкретно, изобретение относится к композиции, содержащей упорядоченную и повторяющуюся матрицу антигенов или антигенных детерминант, и, таким образом, в частности конъюгаты белок RANKL-, фрагмент RANKL- или пептид RANKL-VLP. Более конкретно, изобретение относится к композиции, содержащей вирусоподобную частицу и по меньшей мере один связанный с ней белок RANKL, фрагмент RANKL или пептид RANKL. Изобретение также относится к способу получения конъюгатов и упорядоченных и повторяющихся матриц, соответственно. Композиции согласно изобретению применимы для получения вакцин для лечения заболеваний кости и в качестве фармацевтических вакцин для профилактики или лечения заболеваний кости и для эффективной индукции иммунных ответов, в частности гуморальных ответов. Кроме того, композиции согласно изобретению особенно применимы для эффективной индукции специфичных для аутоантигенов иммунных ответов в указанном контексте.

В данном изобретении белок RANKL, фрагмент RANKL или пептид RANKL обычно связан с центральной частицей и, соответственно, с VLP ориентированным образом, образуя упорядоченную и повторяющуюся матрицу антигенов белка RANKL, фрагмента RANKL или пептида RANKL. Кроме того, высокоповторяющаяся и организованная структура центральных частиц и, соответственно, VLP опосредует экспонирование белка RANKL, фрагмента RANKL или пептида RANKL высокоупорядоченным и повторяющимся образом, приводя к образованию высокоорганизованной и повторяющейся антигенной матрицы. Кроме того, связывание белка RANKL, фрагмента RANKL или пептида RANKL с центральной частицей и, соответственно, с VLP обеспечивает эпитопы хелперных T-клеток, так как центральная частица и VLP являются чужеродными по отношению к хозяину, иммунизируемому матрицей центральная частица-белок RANKL, -фрагмент RANKL или -пептид RANKL и, соответственно, VLP-белок RANKL, -фрагмент RANKL или -пептид RANKL. Указанные матрицы отличаются от конъюгатов предшествующего уровня техники своей высокоорганизованной структурой, размерами и повторяемостью антигена на поверхности матрицы.

В одном аспекте изобретения белок RANKL, фрагмент RANKL или пептид RANKL экспрессируют в подходящем хозяине экспрессии, совестимом с правильной укладкой белка RANKL или фрагмента RANKL, или синтезируют, тогда как центральную частицу и, соответственно, VLP, экспрессируют и очищают из экспрессирующего хозяина, подходящего для укладки и сборки центральной частицы и, соответственно, VLP. Белок RANKL, фрагмент RANKL или пептид RANKL также можно синтезировать химическим способом. Затем собирают матрицу белка RANKL, фрагмента RANKL или пептида RANKL посредством связывания белка RANKL, фрагмента RANKL или пептида RANKL с центральной частицей и, соответственно, с VLP.

В другом аспекте данное изобретение относится к композиции, содержащей (a) вирусоподобную частицу и (b) по меньшей мере один антиген или антигенную детерминанту, где указанный антиген или указанная антигенная детерминанта является белком RANKL, фрагментом RANKL или пептидом RANKL и где указанный по меньшей мере один антиген или антигенная детерминанта связаны с вирусоподобной частицей.

В следующем аспекте данное изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей (a) композицию по п.1 или п.22 и (b) приемлемый фармацевтический носитель.

В еще одном аспекте данное изобретение относится к композиции вакцины, содержащей композицию, включающую в себя (a) центральную частицу по меньшей мере с одним первым сайтом связывания; и (b) по меньшей мере один антиген или антигенную детерминанту по меньшей мере с одним вторым сайтом связывания, где указанный антиген или антигенная детерминанта является белком RANKL, фрагментом RANKL или пептидом RANKL и где указанный второй сайт связывания выбран из группы, состоящей из (i) сайта связывания неприродного происхождения с указанным антигеном или антигенной детерминантой; и (ii) сайта связывания природного происхождения с указанным антигеном или антигенной детерминантой, где указанный второй сайт связывания способен к ассоциации с указанным первым сайтом связывания; и где указанный антиген или антигенная детерминанта и указанная центральная частица взаимодействуют посредством указанной ассоциации, образуя упорядоченную и повторяющуюся антигенную матрицу.

В следующем аспекте данное изобретение относится к композиции вакцины, содержащей композицию, где указанная композиция содержит (a) вирусоподобную частицу; и (b) по меньшей мере один антиген или антигенную детерминанту, где указанный антиген или указанная антигенная детерминанта является белком RANKL, фрагментом RANKL или пептидом RANKL; и где указанный по меньшей мере один антиген или антигенная детерминанта связаны с указанной вирусоподобной частицей.

Еще в одном аспекте данное изобретение относится к способу получения композиции по п.1, включающему в себя (a) получение вирусоподобной частицы; и (b) получение по меньшей мере одного антигена или антигенной детерминанты, где указанный антиген или указанная антигенная детерминанта является белком RANKL, фрагментом RANKL или пептидом RANKL; (c) объединение указанной вирусоподобной частицы и указанного по меньшей мере одного антигена или антигенной детерминанты, так чтобы указанный по меньшей мере один антиген или антигенная детерминанта были связаны с указанной вирусоподобной частицей.

Еще в одном аспекте данное изобретение относится к способу получения композиции по п.22, включающему в себя (a) получение центральной частицы по меньшей мере с одним первым сайтом связывания; (b) получение по меньшей мере одного антигена или антигенной детерминанты по меньшей мере с одним вторым сайтом связывания, где указанный антиген или антигенная детерминанта является белком RANKL, фрагментом RANKL или пептидом RANKL и где указанный второй сайт связывания выбран из группы, состоящей из (i) сайта связывания неприродного происхождения с указанным антигеном или антигенной детерминантой; и (ii) сайта связывания природного происхождения с указанным антигеном или антигенной детерминантой; и где указанный второй сайт связывания способен к ассоциации с указанным первым сайтом связывания; и (c) объединение указанной центральной частицы и указанного по меньшей мере одного антигена или антигенной детерминанты, где указанный антиген или антигенная детерминанта и указанная центральная частица взаимодействуют путем указанной ассоциации, образуя упорядоченную и повторяющуюся антигенную матрицу.

В другом аспекте данное изобретение относится к способу иммунизации, включающему в себя введение композиции по п.1 или п.22 животному или человеку.

В следующем аспекте данное изобретение относится к применению композиции по п.1 или п.22 для производства лекарственного средства для лечения заболеваний кости.

Еще в одном аспекте данное изобретение относится к применению композиции по п.1 или п.22 для приготовления лекарственного средства для терапевтического или профилактического лечения заболеваний кости, предпочтительно энцефалопатий млекопитающих. Кроме того, еще в одном аспекте данное изобретение относится к применению композиции по п.1 или п.22 либо отдельно, либо в комбинации с другими агентами, для производства композиции, вакцины, лекарственного средства или медицинского препарата для терапии или профилактики заболеваний кости, в частности энцефалопатий млекопитающих, и/или для стимуляции иммунной системы млекопитающего.

Таким образом, изобретение, в частности, относится к композициям вакцин, которые подходят для профилактики и/или ослабления заболеваний кости или связанных с ними состояний. Изобретение, кроме того, относится к способам иммунизации и вакцинации, соответственно, для профилактики и/или ослабления заболеваний кости и связанных с ними состояний у животных, в частности у коров, овец и крупного рогатого скота, а также у человека. Композиции согласно изобретению можно использовать профилактически или терапевтически.

В конкретных вариантах изобретение относится к способам профилактики и/или ослабления заболеваний кости или связанных с ними состояний, которые вызваны или обострены продуктами «собственных» генов, т.е. в используемом в данном описании смысле «аутоантигенами». В родственных вариантах изобретение относится к способам индуцирования иммунологических ответов у животных и человека, соответственно, которые приводят к продукции антител, которые предотвращают и/или ослабляют заболевания кости или связанные с ними состояния, которые вызваны или обострены продуктами «собственных» генов.

Как будет понятно специалисту в данной области, когда композиции согласно изобретению вводят животному или человеку, они могут быть в композиции, которая содержит соли, буферные вещества, адъюванты или другие вещества, которые требуются для повышения эффективности композиции. Примеры веществ, подходящих для применения при получении фармацевтических композиций, приведены во многих источниках, включая Remington's Pharmaceutical Sciences (Osol, A, ed., Mack Publishing Co. (1990)).

Говорят, что композиции согласно изобретению являются «фармакологически приемлемыми», если может быть допустимо их введение человеку-реципиенту. Кроме того, композиции согласно изобретению будут вводиться в «терапевтически эффективном количестве» (т.е. в количестве, которое дает требуемый физиологический эффект).

Композиции согласно изобретению можно вводить различными способами, известными в данной области, но обычно они будут вводиться путем инъекции, инфузии, ингаляции, перорального введения или другими подходящими физическими способами. Альтернативно композиции можно вводить внутримышечно, внутривенно или подкожно. К компонентам композиций для введения относятся стерильные водные растворы (например, физиологический раствор соли) или неводные растворы и суспензии. Примерами неводных растворителей являются пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, такие как оливковое масло, и инъекционные органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Можно использовать носители или окклюзионные повязки, чтобы увеличить проницаемость кожи и усилить абсорбцию антигена.

Другие варианты данного изобретения будут очевидны для специалиста в свете того, что известно в данной области, следующих чертежей и описания изобретения и формулы изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фиг.1 показана экспрессия и очистка C-RANKL. Очистку C-RANKL анализировали в SDS-геле в восстанавливающих условиях. Гель красили Кумасси бриллиантовым голубым. Молекулярные массы маркерных белков приведены на левом поле. Дорожка 1: маркер низкой молекулярной массы. Дорожка 2 и 3: надосадок клеточных лизатов клеток BL21/DE3, трансформированных пустым вектором pGEX6p1 и pGEX-RANKL, соответственно, после шестнадцати часов индукции с помощью IPTG 0,4 мМ. Дорожка 4: очищенный белок GST-PS-C-RANKL после колонки FF, улавливающей GST. Дорожка 5: Фракция, не связанная с колонкой FF, улавливающей GST. Дорожка 6: очищенный белок GST-PS-C-RANKL после расщепления протеазой PreScission. Дорожка 7: несвязанная фракция с колонки FF, улавливающей GST, на которую наносили продукт расщепления GST-RANKL, которая содержит очищенный C-RANKL. Дорожка 8: связанная фракция с колонки FF, улавливающей GST, на которую наносили продукт расщепления GST-PS-C-RANKL и элюировали с помощью GSH.

На фиг.2 показана экспрессия и очистка RANKL-C.

На фиг.2A показана очистка GST-EK-RANKL-C. Образцы белков анализировали в SDS-ПААГ в восстанавливающих условиях. Гель красили Кумасси бриллиантовым голубым. Молекулярные массы маркерных белков приведены на левом поле. Дорожка 1: предварительно окрашенный белковый маркер для широкого диапазона (New England Biolabs). Дорожка 2: осветленный клеточный лизат клеток BL21/DE3, трансформированных плазмидой pMod-GST-EK-mRANKL-C1 после индукции в течение ночи с использованием 0,1 мМ IPTG. Дорожка 3: поток, проходящий через колонку FF, улавливающую GST, нагруженную осветленным лизатом с дорожки 2. Дорожка 4: первая промывка колонки FF, улавливающей GST. Дорожка 5: вторая промывка колонки FF, улавливающей GST. Дорожка 6: третья промывка колонки FF, улавливающей GST. Дорожки 7-15: элюированные фракции 1-9 с колонки FF, улавливающей GST, содержащие очищенный слитый белок GST-EK-RANKL-C и небольшое количество белка GST-EK.

На фиг.2B показано расщепление GST-EK-RANKL-C энтерокиназой Max^TM.

Расщепление GST-EK-RANKL-C анализировали в SDS-ПААГ в восстанавливающих условиях. Гель красили Кумасси бриллиантовым голубым. Молекулярные массы маркерных белков приведены на левом поле. Дорожка 1: предварительно окрашенный белковый маркер для широкого диапазона (New England Biolabs). Дорожка 2: Очищенный слитый белок GST-EK-RANKL-C. Дорожка 3: продукты расщепления после 16 час инкубации при 4°C с энтерокиназой Max^TM.

На фиг.2C показана очистка RANKL-C.

Очистку RANKL-C после удаления GST-EK методом аффинной хроматографии на глутатион-сефарозе анализировали в SDS-ПААГ в восстанавливающих условиях. Гель красили Кумасси бриллиантовым голубым. Молекулярные массы маркерных белков приведены на левом поле. Дорожка 1: предварительно окрашенный белковый маркер для широкого диапазона (New England Biolabs). Дорожка 2 и 3: продукты расщепления GST-EK и RANKL-C после 16 час инкубации GST-EK-RANKL-C при 4°C с энтерокиназой Max^TM. Дорожка 4 и 5: различные количества несвязанной фракции с колонки FF, улавливающей GST, которая содержит белок RANKL-C высокой чистоты.

На фиг.3 показано связывание C-RANKL с капсидным белком Qβ.

На фиг.3A показан SDS-ПААГ-анализ продуктов связывания: белки анализировали в 16% SDS-гелях в восстанавливающих условиях. Гель красили Кумасси бриллиантовым голубым. Молекулярные массы маркерных белков приведены на левом поле. Идентичность полос белка показана на правом поле. Дорожка 1: предварительно окрашенный белковый маркер для широкого диапазона (New England Biolabs). Дорожка 2: дериватизованный капсидный белок Qβ. Дорожка 3: очищенный белок C-RANKL. Дорожка 4: реакция связывания C-RANKL/Qβ.

Фиг.3B и фиг.3C: Вестерн-блот-анализ продуктов связывания. Белки разгоняли в 16% SDS-гелях в восстанавливающих условиях, подвергали блоттингу на нитроцеллюлозные мембраны и регистрировали с помощью анти-Qβ-антисыворотки (фиг.3B) или анти-RANKL-антитела (фиг.3C). Молекулярные массы маркерных белков приведены на левом поле. Идентичность белковых полос указана на правом поле. Дорожка 1: предварительно окрашенный белковый маркер для широкого диапазона (New England Biolabs). Дорожка 2: дериватизованный капсидный белок Qβ. Дорожка 3: очищенный белок C-RANKL. Дорожка 4: реакция связывания C-RANKL/Qβ.

На фиг.4 показан ELISA для RANKL-специфичного IgG у мышей, иммунизированных C-RANKL, связанным с Qβ.

Самок мышей Balb/c вакцинировали подкожно 25 мкг C-RANKL, связанного с Qβ, в PBS в 0 день, 16 день и 64 день с добавлением или без добавления квасцов. Сыворотку, полученную в 0, 16, 23, 64 и 78 дни, анализировали в отношении антител, специфичных для RANKL. Титры ELISA выражали в виде среднего для тех разведений сывороток, которые давали половину максимальной OD₄₂₀ в анализе ELISA.

На фиг.5 показана нейтрализующая активность антител, индуцированных у мышей, иммунизированных C-RANKL, связанным с Qβ.

На фиг.5A показан анализ связывания C-RANKL и его родственного лиганда RANK. Планшеты для ELISA покрывали 10 мкг/мл C-RANKL и инкубировали с серийными разведениями слитого белка RANK-Fc или неродственного слитого с Fc белка. Регистрацию связанного RANK осуществляли с помощью конъюгированных с HRP анти-Fc-антител.

На фиг.5B показано ингибирование связывания C-RANKL/RANK-Fc антителами сыворотки мышей, вакцинированных C-RANKL, связанным с Qβ. Планшеты для Elisa покрывали 10 мкг/мл C-RANKL и подвергали совместной инкубации с серийными разведениями сывороток мышей, полученных на 78 день, и 1 нМ слитого белка RANK-Fc. Связывание слитого белка с C-RANKL регистрировали с использованием конъюгированного с пероксидазой хрена анти-Fc-антитела.

На фиг.6A-C изображена очистка белков AP205 для применения в VLP, которую анализировали с помощью SDS-ПААГ и Вестерн-блоттинга.

На фиг.7A-B изображены электронные микрофотографии сравнения фаговых частиц AP205 с вирусоподобными частицами AP205, спонтанно собираемыми из рекомбинантного белка, экспрессированного в E. coli и очищенного.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Если не оговорено особо, все технические и научные термины, используемые в данном описании, имеют такие же значения, которые обычно подразумеваются специалистами в области, к которой относится данное изобретение. Хотя на практике или при проверке данного изобретения можно использовать любые способы и вещества, сходные или эквивалентные способам и веществам, описанным в данной заявке, предпочтительные способы и вещества описаны ниже.

1. Определения:

Аминокислотный линкер: «аминокислотный линкер» или называемый также в данном описании «линкер» в используемом смысле либо связывает антиген или антигенную детерминанту со вторым сайтом связывания, либо - более предпочтительно - уже содержит или включает в себя второй сайт связывания, обычно - но не обязательно - в виде аминокислотного остатка, предпочтительно в виде остатка цистеина. Однако термин «аминокислотный линкер» в используемом в данном описании смысле не предназначен для обозначения того, что такой аминокислотный линкер состоит исключительно из аминокислотных остатков, хотя аминокислотный линкер, состоящий из аминокислотных остатков, является предпочтительным вариантом согласно данному изобретению. Остатки аминокислот аминокислотного линкера предпочтительно состоят из аминокислот природного происхождения или неприродных аминокислот, известных в данной области, всех L или всех D или их смесей. Однако аминокислотный линкер, содержащий молекулу с сульфгидрильной группой или остаток цистеина, также входит в данное изобретение. Такая молекула предпочтительно содержит остаток C1-C6-алкила, циклоалкила (C5,C6), арила или гетероарила. Однако? кроме аминокислотного линкера, в объем данного изобретения также следует включить линкер, предпочтительно содержащий остаток C1-C6-алкила, циклоалкила (C5,C6), арила или гетероарила и не имеющий никакой аминокислоты (аминокислот). Связь между антигеном или антигенной детерминантой или необязательно вторым сайтом связывания и аминокислотным линкером предпочтительно осуществляется с помощью по меньшей мере одной ковалентной связи, более предпочтительно с помощью по меньшей мере одной пептидной связи.

Животные: В используемом в данном описании смысле подразумевается, что термин «животное» включает в себя, например, человека, овец, лосей, оленей, оленей-мулов, норок, млекопитающих, обезьян, лошадей, крупный рогатый скот, свиней, коз, собак, кошек, крыс, мышей, птиц, кур, рептилий, рыб, насекомых и паукообразных.

Антитело: В используемом в данном описании смысле термин «антитело» относится к молекулам, которые способны связывать эпитоп или антигенную детерминанту. Подразумевается, что термин включает в себя целые антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, включая одноцепочечные антитела. Наиболее предпочтительно антитела являются антигенсвязывающими фрагментами антител человека и включают в себя, не ограничиваясь указанным, Fab, Fab' и F(ab')2, Fd, одноцепочечные Fv (scFv), одноцепочечные антитела, связанные дисульфидными связями Fv (sdFv) и фрагменты, содержащие либо V_L-, либо V_H-домен. Источником антител может быть любое животное, включая птиц и млекопитающих. Предпочтительно антитела получены от человека, мыши, кролика, козы, морской свинки, верблюда, лошади или цыпленка. В используемом в данном описании смысле «человеческие» антитела включают в себя антитела, имеющие аминокислотную последовательность иммуноглобулина человека, и включают антитела, выделенные из библиотек иммуноглобулинов человека или из животных, трансгенных по одному или нескольким иммуноглобулинам человека и которые не экспрессируют эндогенных иммуноглобулинов, как описано, например, в патенте США № 5939598 Kucherlapati et al.

Антиген: В используемом в данном описании смысле «антиген» относится к молекуле, способной подвергаться связыванию антителом или рецептором T-клеток (TCR), если она презентирована молекулами MHC. Термин «антиген» в используемом в данном описании смысле также охватывает T-клеточные эпитопы. Кроме того, антиген может узнаваться иммунной системой и/или способен индуцировать гуморальный иммунный ответ и/или клеточный иммунный ответ, приводящий к активации B- и/или T-лимфоцитов. Однако это может требовать, по меньшей мере в некоторых случаях, чтобы антиген содержал или был связан с Th-клеточным эпитопом и был введен в адъюванте. Антиген может иметь один или несколько эпитопов (B- и T-эпитопов). Подразумевается, что указанная выше специфичная реакция указывает на то, что антиген будет предпочтительно реагировать, обычно высокоизбирательным образом, с соответствующим ему антителом или TCR и не будет реагировать со множеством других антител или TCR, которые могут быть вызваны другими антигенами. В используемом в данном описании смысле антигены также могут представлять собой смеси нескольких отдельных антигенов.

Антигенная детерминанта: В используемом в данном описании смысле подразумевается, что термин «антигенная детерминанта» относится к такой части антигена, которая специфично распознается либо B-, либо T-лимфоцитами. B-лимфоциты, отвечающие на антигенные детерминанты, продуцируют антитела, тогда как T-лимфоциты отвечают на антигенные детерминанты пролиферацией и установлением эффекторных функций, необходимых для опосредования клеточного и/или гуморального иммунитета.

Ассоциация: В используемом в данном описании смысле термин «ассоциация» в применении к первому и второму сайтам связывания относится к связыванию первого и второго сайтов связывания, которое предпочтительно осуществляется посредством по меньшей мере одной непептидной связи. Природа ассоциации может быть ковалентной, ионной, гидрофобной, полярной или любой их комбинацией, предпочтительно природа ассоциации является ковалентной.

Сайт связывания, первый: В используемом в данном описании смысле фраза «первый сайт связывания» относится к элементу неприродного или природного происхождения, с которым может вступать в ассоциацию второй сайт связывания, расположенный на антигене или антигенной детерминанте. Первый сайт связывания может быть белком, полипептидом, аминокислотой, пептидом, сахаром, полинуклеотидом, природным или синтетическим полимером, вторичным метаболитом или соединением (биотин, флуоресцеин, ретинол, дигоксигенин, ионы металлов, фенилметилсульфонилфторид) или их комбинацией или их химически реакционно-способной группой. Первый сайт связывания обычно и предпочтительно расположен на поверхности центральной частицы, такой как предпочтительно вирусоподобная частица. Многочисленные первые сайты связывания обычно присутствуют на поверхности центральной частицы и, соответственно, вирусоподобной частицы в повторяющейся конфигурации.

Сайт связывания, второй: В используемом в данном описании смысле фраза «второй сайт связывания» относится к элементу, находящемуся в ассоциации с антигеном или антигенной детерминантой, с которым может вступать в ассоциацию первый сайт связывания, расположенный на поверхности центральной частицы и, соответственно, вирусоподобной частицы. Второй сайт связывания антигена или антигенной детерминанты может быть белком, полипептидом, пептидом, сахаром, полинуклеотидом, природным или синтетическим полимером, вторичным метаболитом или соединением (биотин, флуоресцеин, ретинол, дигоксигенин, ионы металлов, фенилметилсульфонилфторид) или их комбинацией или их химически реакционно-способной группой. На антигене или антигенной детерминанте присутствует по меньшей мере один второй сайт связывания. Термин «антиген или антигенная детерминанта по меньшей мере с одним вторым сайтом связывания», таким образом, относится к антигену или антигенной конструкции, содержащей по меньшей мере