Штамм гриба penicillium vermiculatum dang.визр-24 для получения препарата против фитопатогенных грибов

Штамм гриба penicillium vermiculatum dang.визр-24 для получения препарата против фитопатогенных грибов

Реферат

Изобретение относится к области сельскохозяйственной микробиологии и касается нового штамма, который может быть использован при получении препарата против фитопатогенных грибов.

Известен штамм гриба РК-1 Penicillium vermiculatum Dang.(ВИЗР №3) для получения препарата против белой и серой гнилей подсолнечника. Для получения препарата 30-дневную культуру гриба, выращенную на стерилизованной питательной среде, состоящей из семянок и лузги подсолнечника в соотношении 1:3, подсушивают и размалывают на мельнице до мелкодисперсного состояния (а.с. СССР №1476891, С12N 1/14, А01N 63/00, 1987 г. - прототип).

Недостатком известного штамма является то, что в процессе хранения и многократных пересевов он ослабил свою антагонистическую активность по отношению к возбудителям белой и серой гнилей подсолнечника, а также узкий спектр его антагонистической активности.

При создании изобретения ставилась задача получения препарата против фитопатогенных грибов на основе штамма, обладающего морфологической стабильностью, более высокой (по сравнению с известным) антагонистической активностью против возбудителей белой и серой гнилей, а также обладающего высокой активностью против широкого спектра грибных возбудителей болезней, ростостимулирующей активностью и устойчивостью к пестицидам, на основе отселектированного штамма.

Задача решается новым штаммом гриба Penicillium vermiculatum Dang., полученным из штамма РК-1 Penicillium vermiculatum Dang.(ВИЗР №3) путем селекции с помощью ступенчатого отбора по признакам антагонистической активности и морфологической выравненности при выращивании на плотных питательных средах и на его основе получают препарат при твердофазном и глубинном культивировании с титром 4,0-8,3×10⁹ КОЕ/г.

Новый штамм гриба Penicillium vermiculatum Dang.РК-С депонирован в коллекции чистых культур Всероссийского института защиты растений и ему присвоен номер ВИЗР-24.

Штамм характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиологическими признаками.

Культурально-морфологические признаки штамма гриба Penicillium vermiculatum Dang.ВИЗР-24

Морфологические признаки штамма гриба Penicillium vermiculatum Dang.ВИЗР-24 не отличались от исходного. Мицелий бесцветный, с возрастом темнеющий. Конидиеносцы бесцветные, септированные, прямостоящие, отходят от субстратного мицелия 10,0-15,0×1,7-2,4 мкм по 2-3 в мутовке. Фиалиды ланцетовидные, 8,0-12,0×1,7-2,5 мкм по 2-7 в мутовке. Конидии полуокруглые до эллиптических, 2,2-3,5×2,0-2,5 мкм, гладкие в массе коричневато-зеленые. Гриб имеет сумчатую стадию. Плодовые тела круглые, 200,0×500,0 мкм в диаметре, желтые. Перидий состоит из желтых, переплетенных инкрустированных гиф до 1,0-2,0 мкм толщины. Сумки круглые до широкоэллиптических, 8,0-12,0×7,5-10,0 мкм. Сумкоспоры широкоэллептические, 3,5-5,0×2,5-3,5 мкм, толстостенные, шиповатые, желтые, иногда с возрастом становятся красноватыми.

Культуральные признаки штамма гриба Penicillium vermiculatum Dang.ВИЗР-24 в сравнении с исходным РК-1 Penicillium vermiculatum Dang.ВИЗР-3 на разных агаризированных питательных средах и при различных температурах приведены в таблице 1.

На агаризированной среде из вытяжки семянок подсолнечника (вытяжка) колонии штамма гриба Penicillium vermiculatum Dang. ВИЗР-24 с лицевой стороны оливкового цвета, с обратной - коричневого, порошистые, при 20°С не сливаются, при 25 и 30°С - сливаются в единую колонию. Конидий образуется много (в массовом количестве), плодовых тел на этой среде нет. Рост мицелия 4 балла при температуре 20°С и 5 баллов при 25 и 30°С.

На агаризированной среде Чапека при всех температурах колонии сливаются, с лицевой стороны окрашены в оливково-желто-бежевый тон.

Таблица 1Культуральная характеристика штаммов гриба Penicillium vermiculatum Dang. ВИЗР-3 и ВИЗР-24 в условиях стационарного культивирования (возраст 10 суток) Краснодар, ВНИИМК, 1985-2005 гг.
Вариант	Характеристика колоний	Диаметр колоний, см	Спороношение, образование плодовых тел
t, °С	среда	штамм	рост колоний	цвет, со стороны	рост мицелия, балл
лицевой	обратной
1	2	3 -,	4	5	6	7	8	9
20	вытяжка	ВИЗР-3	средний, колонии не сливаются, порошистые	темно-оливковый	оливковый	3	1,2×2,4	конидий масса, плодовых тел нет
ВИЗР-24	средний, колонии не сливаются, порошистые	оливковый	коричневый	4	3,6×4,6	конидий масса, плодовых тел нет
Чапека	ВИЗР-3	средний, колонии сливаются, порошистые	бежевый	кремово-зеленый	3	1,5×2,9	конидий масса, плодовых тел мало, мелкие, по краю колоний
ВИЗР-24	средний, колонии сливаются, порошистые	бежевый	кремово-зеленый	4	3,0×3,8	конидий масса, плодовых тел мало, мелкие, по краю колоний
КСА	ВИЗР-3	средний, колонии не сливаются, порошистые	темно-оливковый	кремовый	3	1,4×2,3	конидий масса, плодовых тел мало, в центре колонии
	ВИЗР-24	средний, колонии сливаются, порошистые	темно-оливковый	кремовый	4	3,0×3,8	конидий масса, плодовых тел мало, в центре колонии

Продолжение таблицы 1
1	2	3	4	5	6	7	8	9
25	вытяжка	ВИЗР-3	сильный, колонии мелкие, не сливаются, порошистые	оливковый	оливковый	4	1,4×3,8	конидий масса, плодовых тел нет
ВИЗР-24	сильный, колонии сливаются, порошистые	оливковый	коричневый	5	3,6×4,6	конидий масса, плодовых тел нет
Чапека	ВИЗР-3	средний, колонии сливаются, порошистые	оливково-желтый	розовато-кремовый	4	2,4×2,4	конидий масса, плодовых тел масса, лимонно-желтые
ВИЗР-24	средний, колонии сливаются, порошистые	желтый	розовато-кремовый	5	4,8×6,0	конидий масса, плодовых тел масса, лимонно-желтые
КСА	ВИЗР-3	средний, колонии растут радиальными кругами, порошистые	темно-оливковый	светло-зеленый, желтый	4	2,4×3,2	конидий масса, плодовых тел масса, лимонно-желтые
ВИЗР-24	сильный, порошистые, сливаются	темно-оливковый	розовато-желтый, желтый	5	5,6×6,5	конидий масса, плодовых тел масса, лимонно-желтые

Продолжение таблицы 1
1	2	3	4	5	6	7	9	10
30	вытяжка	ВИЗР-3	сильный, колонии мелкие, порошистые	оливковый	светло-зеленый	4	0,6×1,6	конидий масса, плодовых тел нет
ВИЗР-24	сильный, колонии мелкие, порошистые	оливковый	светло-зеленый	5	4,5×6,5	конидий масса, плодовых тел нет
Чапека	ВИЗР-3	сильный, колонии сливаются, порошистые	темно-оливковый	розовато-желтый	4	1,7×3,5	конидий масса, плодовых тел масса, лимонно-желтые
ВИЗР-24	сильный, колонии сливаются, порошистые	темно-оливковый	розовато-желтый	5	4,0×6,0	конидий масса, плодовых тел масса, лимонно-желтые
КСА	ВИЗР-3	сильный, колонии мелкие, не сливаются, порошистые	оливковый	розовато-кремовый	4	2,0×2,0	конидий масса, плодовых тел масса, желтые
ВИЗР-24	сильный, колонии мелкие, сливаются, порошистые	оливковый	розовато-кремовый	5	4,6×6,5	конидий масса, плодовых тел масса, лимонно-желтые

С обратной стороны среда окрашена в розовато-кремовый и кремово-зеленый тон. Плодовые тела в массовом количестве образуются при температуре 25-30°С. Рост мицелия при температуре 20°С - 4 балла, при температуре 25-30°С - 5 баллов.

На картофельно-сахарозном агаре (КСА) колонии штамма гриба Penicillium vermiculatum Dang.ВИЗР-24 в отличие от исходного штамма сливаются в единую колонию, с лицевой стороны окрашены в оливковый и темно-оливковый тон, с обратной - в розовато-желтый и розовато-кремовый тон. Плодовые тела в массовом количестве образуются при температуре 25-30°С. Рост мицелия при 20°С - 4 балла, при температуре 25-30°С - 5 баллов.

Таким образом, отселектированный штамм гриба Penicillium vermiculatum Dang.ВИЗР-24 растет быстрее исходного РК-1 Penicillium vermiculatum Dang.BИ3P-3: рост мицелия заявляемого штамма ВИЗР-24 при температуре 20°С - 4 балла по сравнению с ростом исходного штамма ВИЗР-3 - 3 балла, а при температуре 25-30°С, рост мицелия ВИЗР-24 - 5 баллов, по сравнению с ростом мицелия ВИЗР-3 - 4 балла; диаметр колоний на 10-е сутки культивирования составил у ВИЗР-24 от 3,0×3,8 до 5,6×6,5 см, a у прототипа ВИЗР-3 - от 1,1×1,8 до 3,0×4,0 см.

Физиологические признаки штамма гриба Penicillium vermiculatum Dang.ВИЗР-24

Аэроб. Температурный оптимум роста 25-30°С. Оптимальный pH в пределах от 5,0 до 8,0. Оптимальный рост гриба отмечен на средах, где в качестве источника углерода использовали сахарозу, крахмал, мелассу, в качестве источников азота - хлористый аммоний, азотнокислый висмут, азотнокислый аммоний, кукурузный экстракт, дрожжевой экстракт, глютен. Тиомочевина и мочевина как источник азота грибом не используется.

Поддержание культуры гриба производится на твердой питательной среде - картофельно-сахаразном агаре (КСА). Температура культивирования 25-30°С, продолжительность выращивания не менее 4-х суток, затем штамм может храниться в холодильнике при +4°С в течение года.

Штамм стабильно сохраняет морфологические свойства и антагонистическую активность в течение 10 пассажей.

Селекция исходного штамма гриба Penicillium vermiculatum Dang.ВИЗР-3

Селекция исходного штамма гриба Penicillium vermiculatum Dang. ВИЗР-3 осуществлялась методом ступенчатого моноконидиального отбора по признакам морфологической стабильности и антагонистической активности к возбудителю белой гнили, в результате которой получен штамм гриба Penicillium vermiculatum Dang.ВИЗР-24. У отселектированного штамма гриба Penicillium vermiculatum Dang.ВИЗР-24 колонии морфологически однородные, с сильным ростом, занимающие в двойных культурах 80-100% площади питательной среды (пример 1).

Биологическая активность штамма гриба Penicillium vermiculatum Dang.ВИЗР-24

Штамм гриба Penicillium vermiculatum Dang. ВИЗР-24 обладает высокой антагонистической активностью против широкого спектра возбудителей болезней растений. В двойных культурах штамм обладает способностью быстро занимать пространство питательной среды, не давая возможности расти патогену. Максимальная антагонистическая активность штамма проявилась по отношению к Sclerotinia sclerotiorum (Lib) de Bary, Phomopsis helianthi Munt.-Cvet., Michal., Petr., Botrytis cinerea Pers., Verticillium dahliae Kleb. Подавление роста мицелия Fusarium oxysporum var. orthoceras (Appl. et Wr.) Bilai и Sclerotium bataticola Taub было на 30,0% ниже (пример 2). Кроме того, штамм подавляет на 70-100% рост Fusarium gibbosum, F. moniliforme, F. sambucinum, F. graminearum, Rhizoctonia solani. Штамм на 60% подавляет жизнеспособность склероциев белой гнили.

Механизм действия штамма гриба Penicillium vermiculatum Dang.ВИЗР-24 на возбудителей фитопатогенных грибов.

Штамм гриба Penicillium vermiculatum Dang. ВИЗР-24 является разрушителем гиф Sclerotinia sclerotiorum и других патогенных грибов. При соприкосновении колоний гифы антагониста обвивали гифы патогена в виде спирали. В дальнейшем, эффект обвивания еще более увеличивался, происходило проникновение гиф антагониста в стенки гиф патогена без образования апрессориев. Паразитическая активность антагониста приводила к разрушению клеточных стенок, грануляции цитоплазмы в гифах патогена, при этом разрушение цитоплазмы происходило и в соседних клетках, которые не были в контакте с гифами антагониста. Этот факт свидетельствует о наличии и антибиотического действия антагониста.

Таким образом, штамм гриба Penicillium vermiculatum Dang.ВИЗР-24 обладает полифункциональным типом действия - конкуренцией, гиперпаразитизмом и антибиогенезом.

Препарат на основе заявляемого штамма относится к малоопасным веществам четвертого класса, не фитотоксичен, не токсичен для пчел.

Штамм гриба Penicillium vermiculatum Dang.ВИЗР-24 обладает значительной ростостимулирующей активностью, что проявляется в увеличении длины корня и в увеличении веса корня за счет увеличения массы боковых корешков (пример 3).

Штамм гриба Penicillium vermiculatum Dang.ВИЗР-24 обладает устойчивостью (совместимостью) к ряду пестицидов, применяемых для защиты подсолнечника, зерновых и винограда от комплекса вредителей и болезней, что позволяет применять биопрепарат на основе предлагаемого штамма в интегрированной системе зашиты растений (пример 4).

Определяющими отличиями предлагаемого штамма от известного являются:

- более быстрый рост мицелия и в связи с этим более быстрое подавление возбудителя белой гнили в двойных культурах;

- морфологическая однородность;

- стабильность по антагонистической активности;

- расширенный спектр действия;

- ростостимулирующая активность;

- совместимость с рядом пестицидов.

Поскольку предлагаемый штамм гриба Penicillium vermiculatum Dang.ВИЗР-24 получен впервые и на основании вышеуказанных его свойств можно сделать вывод о соответствии заявляемого изобретения критериям патентоспособности «новизна» и «изобретательский уровень», а также «промышленная применимость», так как штамм может быть использован в сельском хозяйстве для получения биопрепарата против фитопатогенных грибов.

Изобретение поясняется следующими конкретными примерами получения и использования штамма гриба Penicillium vermiculatum Dang.ВИЗР-24.

Пример 1. Селекция штамма гриба Penicillium vermiculatum Dang.ВИЗР-3 для получения штамма гриба Penicillium vermiculatum Dang.ВИЗР-24.

Из моноконидиального рассева природного изолята (Penicillium vermiculatum Dang. ВИЗР-3) отбирали изоляты морфологически однородные, показавшие высокую антагонистическую активность в двойных культурах с возбудителем белой гнили для следующего моноконидиального рассева. Культуры, отличные от исходной, имеющие сектора с другим цветом, либо полностью изменившие цвет колонии, с низкой антагонистической активностью, отбраковывали (табл.2).

Таблица 2Структура популяции штаммов гриба Penicillium vermiculatum Dang. при селекции методом ступенчатого стабилизирующего отбораКраснодар, ВНИИМК, 1992-2005 гг.
Штамм	Рост колоний штамма антагониста в двойных культурах с возбудителем белой гнили
слабый	средний	сильный
см2	%	см2	%	см2	%
ВИЗР-3	17,8±0,27	22,2	49,2±0,27	62,7	78,5±1,48	15,1
ВИЗР-24	0	0	63,3±0,48	10,5	78,5±0,20	89,5

При сравнении структуры популяции исходного штамма ВИЗР-3 и отселектированного ВИЗР-24 методом двойных или встречных культур с возбудителем белой гнили установили, что у исходного штамма 15,1% колоний имели сильный рост, которые не давали начала роста колонии белой гнили, 62,7% - средний рост колоний, которые подавляли белую гниль на 7-10-ые сутки совместного культивирования, и 22,2% - слабый рост колоний, когда зарастание колоний патогена происходило на 12-15-ые сутки совместного культивирования. У заявляемого отселектированного штамма колонии морфологически однородные и имели 89,5% колоний с сильным ростом, 10,5% колоний со средним, ростом, а колонии со слабым ростом отсутствовали.

Пример 2. Антагонистическая активность штамма гриба Penicillium vermiculatum Dang.ВИЗР-24 к возбудителям болезней подсолнечника.

Антагонистическую активность штамма в лабораторных условиях определяли методом двойных или встречных культур. Для этого грибантагонист и тест-культуру (возбудителей болезней) выращивали на картофельно-сахарозном агаре в чашках Петри при 25°С в течение 3-х суток. Затем стерильным лабораторным сверлом диаметром 5 мм вырезали агаровые блоки с растущими на них грибами, которые помещали в противоположные чашки Петри на питательную среду на расстоянии 5 см друг от друга. Контролем служили те же виды, выращиваемые отдельно. Учет скорости роста и характер взаимоотношений патогена и антагониста проводили на 3, 5, 10-ые сутки культивирования (таблица 3).

Таблица 3Антагонистическая активность штаммов гриба Penicillium vermiculatum Dang. к возбудителям болезней подсолнечникаКраснодар, ВНИИМК, 1986-2005 гг.
Возбудитель болезни	Подавление роста патогенов, %
ВИЗР-3	ВИЗР-24
Sclerotinia sclerotiorum	100	100
Phomopsis helianthi	100	100
Fusarium oxysporum	70,0	87,0
Verticillium dahliae	96,7	100
Sclerotium bataticola	70,0	80,0
Botrytis cinerea	100	100

В отличие от исходного, предлагаемый штамм обладает расширенным спектром действия и проявляет более высокую антагонистическую активность к широкому кругу патогенов: к возбудителям фузариозов, фомопсиса, вертициллеза и пепельной гнили.

Штамм ВИЗР-24 подавляет рост Sclerotinia sclerotiorum, Phomopsis helianthi, Verticillium dahliae и Botrytis cinerea на 100%, Fusarium oxysporum - на 87,0% и Sclerotium bataticola - на 80,0%. Кроме того, штамм подавляет на 80,0-100% рост Fusarium gibbosum, Fusarium moniliforme, Fusarium sambucinum, Fusarium graminearum, Rhizoctonia solani. Штамм на 70,0% подавляет жизнеспособность склероциев белой гнили.

Пример 3. Определение ростостимулирующей активности штаммов Penicillium vermiculatum Dang. на подсолнечнике.

Опыт проводили в лабораторных условиях. Семена подсолнечника замачивали в суспензиях заявляемого и исходного штаммов гриба, приготовленных смывом спор с поверхности твердой питательной среды дистиллированной водой, в течение 1 часа, а затем раскладывали в рулоны из фильтровальной бумаги, которые смачивали и помещали в термостат при температуре 23°С. Контроль - семена без обработки. Через 7 дней проводили учеты длины и массы корня (таблица 4).

Таблица 4Ростостимулирующее влияние штаммов гриба Penicillium vermiculatum Dang. на растения подсолнечникаКраснодар, ВНИИМК, 2005 гг.
Штамм	Титр, КОЕ/мл	Длина корня	Масса корня
см	% к контролю	г	% к контролю
Penicillium vermiculatum ВИЗР-3	1,8×109	13,7	44,2	0,22	10,0
Penicillium vermiculatum ВИЗР-24	2,0×109	14,0	47,4	0,25	25,0
Контроль	-	9,5	-	0,20	-
HCP05		2,1		0,02

Установлена более высокая ростостимулирующая активность заявляемого штамма-антагониста, которая проявляется в большем увеличении длины и массы корня.

Пример 4. Определение совместимости штамма гриба Penicillium vermiculatum Dang.ВИЗР-24 с пестицидами.

Совместимость штамма гриба Penicillium vermiculatum Dang.ВИЗР-24 с пестицидами определяли по модифицированному методу лунок (Егоров, 1976, Маслиенко, 1999). Для этого на поверхности агара в чашках Петри специальным стерильным сверлом вырезали отверстия - лунки, в которые закапывали пипеткой определенное количество раствора пестицида в рабочей концентрации. В центре чашки Петри помещали блок питательной среды с мицелием гриба-антагониста. По активности роста гриба и образованию зон вокруг лунок судили о совместимости биопрепарата и пестицидов (таблица 5).

Таблица 5Совместимость штамма гриба Penicillium vermiculatum Dang.ВИЗР-24 с пестицидами, применяемыми на подсолнечникеКраснодар, ВНИИМК, 1995-2005 гг.
Вариант	Норма расхода, кг/га, л/га	Рост антагонистов, %	Образование зон, мм
1	2	3	4
Контроль: ВИЗР-24	-	100	0
Линдафор, кэ., (200 г/л) + ВИЗР-24	2,0	100	0
Сумитион, кэ., (500 г/л) + ВИЗР-24	2,0	100	0
Актеллик, кэ., (500 г/л + ВИЗР-24	2,5	100	0
Семафор, тпс., (200 г/ + ВИЗР-24	2,0	100	0
Космос-500, кс., (250 г/л) + ВИЗР-24	4,0	100	0
Ронилан, сп., (500 г/л) + ВИЗР-24	2,0	100	0
Спортак, кэ., (450 г/л) + ВИЗР-24	2,0	5,0	0
Корбел, кэ., (750 г/л) + ВИЗР-24	2,0	5,0	0
Винцит, ск., (25+25 г/л) + ВИЗР-24	2,0	0	0
Апрон-голд, вэ., (350 г/л) + ВИЗР-24	1,0-2,0	100	0
ТМТД, сп., (800 г/л) + ВИЗР-24	2,0-4,0	0	0

Установлена совместимость штамма гриба Penicillium vermiculatum Dang.ВИЗР-24 с целым рядом пестицидов и фунгицидов, применяемых для защиты подсолнечника от вредителей и болезней: апроном, рониланом, ридомилом, максимом, космосом, семафором, линдафором. Кроме того, штамм совместим с рядом пестицидов, применяемых для защиты зерновых колосовых и винограда: купроситом, оксихомом, сапролем, арцеридом, деланом, импактом, байлетоном, золоном, фьюри.

Совместимость с пестицидами позволяет использовать биопрепарат на основе штамма в интегрированной системе защиты растений от комплекса вредителей и болезней.

Пример 5. Определение эффективности обработки семян подсолнечника порошком биопрепарата в зависимости от питательной среды и активности штамма-продуцента на фоне искусственного заражения возбудителем белой гнили в лабораторных условиях.

Для получения порошка биопрепарата штаммы ВИЗР-3 и ВИЗР-24 выращивали на твердых питательных средах, состоящих из смеси лузги и семянок подсолнечника в соотношении 1:3 (прототип) и из отходов от очистки семян подсолнечника на семяочистительных машинах, состоящих из невыполненных семянок подсолнечника, кусочков прилистников корзинок, трубчатых и язычковых цветков подсолнечника с добавлением 0,3% гумата натрия (вариант). Штаммы выращивали в течение 30 суток, затем питательный субстрат высушивали и размалывали на мельнице до мелкодисперсного состояния. Титр биопрепарата определяли по формуле:

где: Т - титр препарата КОЕ/г;

А - среднее количество колоний в 10 чашках Петри;

10ⁿ - конечное разведение препарата;

V - объем микробной суспензии, закапываемой в чашки Петри.

На питательной среде, состоящей из отходов от очистки семян подсолнечника наблюдалось более быстрое зарастание питательной среды (5-8-е сутки), более интенсивное спороношение гриба и, соответственно, более высокий титр готового препарата (7,3-8,3×10⁹ КОЕ/г против 1,9-2,5×10⁹ КОЕ/г).

Опыт проводили в лабораторных условиях, в растильнях, во влажной камере, на фоне искусственного заражения семян подсолнечника возбудителем белой гнили при температуре 22-23°С. Инфекционный фон создавали прикладыванием кусочков агара с мицелием возбудителя белой гнили к семянкам подсолнечника. Возбудителя белой гнили предварительно выращивали на картофельно-сахарозном агаре в течение 10-15 дней. Для создания влажной камеры дно растилен выстилали несколькими слоями фильтровальной бумаги, которую смачивали дистиллированной водой, затем растильни укрывали полиэтиленовой пленкой. Семена подсолнечника обрабатывали порошком биопрепарата с нормой расхода 2,0 кг/т, с увлажнением 20 л воды на 1 т. Контролем служили семянки подсолнечника без обработки биопрепаратами, с заражением возбудителем белой гнили (таблица 6).

Таблица 6Биологическая эффективность обработки семян подсолнечника порошками биопрепарата на основе штаммов ВИЗР-3 и ВИЗР-24 в зависимости от питательной среды на фоне искусственного заражения возбудителем белой гнилиКраснодар, ВНИИМК, 2005 г.
Вариант	Штамм	Титр, КОЕ/г	Норма расхода, кг/т	Поражено белой гнилью, %	Биологическая эффективность, %
Биопрепарат, П* (лузга+семянки 1:3)	ВИЗР-3	1,9×109	2,0	25,5	68,2
ВИЗР-24	2,5×109	2,0	12,0	85,1
Биопрепарат, П (отходы+гумат 0,3%)	ВИЗР-3	7,3×109	2,0	21,8	72,9
ВИЗР-24	8,3×109	2,0	6,8	91,5
Контроль	-	-	80,3	-
НСР05	0,7
* П - порошок

Установлена более высокая эффективность против возбудителя белой гнили отселектированного (заявляемого) штамма гриба Penicillium vermiculatum Dang. ВИЗР-24, выращенного на питательной среде из отходов от очистки семян подсолнечника. Биологическая эффективность биопрепарата на основе штамма ВИЗР-24 составила 85,1-91,5% против 68,2-72,9% у известного штамма ВИЗР-3.

Пример 6. Испытание эффективности жидкой культуры вермикулена в лабораторных условиях на фоне искусственного заражения возбудителем белой гнили.

Глубинное культивирование штаммов ВИЗР-3 и ВИЗР-24 гриба Penicillium vermiculatum Dang. осуществляли на круговой качалке с оборотом двигателя 200 об/мин, в колбах Эрленмейера объемом 750 мл, при объемах среды 150 мл, при температуре 27°С, на мелассо-солевой среде. Опыт проводили в лабораторных условиях, в растильнях, в условиях влажной камеры, на фоне искусственного заражения семян подсолнечника возбудителем белой гнили (как описано в примере). Титр глубинной культуры 2,0-2,7×10⁹ КОЕ/мл. Норма расхода препарата 3,0 л/т. Опыт проводили при температуре 23-24°С, в трех повторностях, в одной растильне 25 семянок, растильни ежедневно увлажняли (таблица 7).

Таблица 7Биологическая эффективность обработки семян подсолнечника глубинной культурой биопрепарата на основе штаммов гриба Penicillium vermiculatum Dang. ВИЗР-3 и ВИЗР-24 на фоне искусственного заражения возбудителем белой гнили Краснодар, 2005 г.
Вариант	Норма расхода препарата, л/т	Титр, КОЕ/мл	Поражено белой гнилью, %	Биологическая эффективность, %
ВИЗР-24, ГК*	3,0	2,7	5,8	92,2
ВИЗР-3, ГК	3,0	2,0	10,0	86,5
Контроль - чистые семена с внесением инфекции	-	-	74,0	-
НСР05			1,3
*ГК - глубинная культура

На фоне поражения белой гнилью в контроле 74,0% установлена высокая эффективность применения биопрепарата на основе обоих штаммов. Биологическая эффективность препарата на основе штамма гриба ВИЗР-24 была выше, чем препарата на основе штамма ВИЗР-3, и составила 92,2% против 86,5%.

Пример 7. Полевые испытания композиции на основе биопрепарата вермикулена (глубинное культивирование) для защиты подсолнечника от болезней.

С целью применения биопрепарата вермикулена в интегрированной системе защиты подсолнечника от вредителей и болезней испытывали композицию, включающую биопрепарат (глубинное культивирование штамма гриба Penicillium vermiculatum Dang.ВИЗР-24, титр 2,0×10⁹ КОЕ/мл) с нормой расхода 3,0 л/т, апрон-голд с нормой расхода 1,0 л/т, для защиты от ложно-мучнистой росы и семафор с нормой расхода 2,0 кг/т для защиты от проволочников. Опыт проводили на делянках площадью 28 м², повторность четырехкратная. Сорт подсолнечника Р-453 (Родник). Расход рабочей жидкости - 10,0 л/т семян подсолнечника. Контроль - посев чистыми семенами. Эталон - фунгицид винцит с нормой расхода 2,0 кг/т в комплексе с апроном и семафором с теми же нормами расхода, что и в варианте. Посев ручными сажалками, уборка вручную, обмолот комбайном Hőgst.

Опыт проводили на экспериментальной базе ВНИИМК на естественном фоне поражения подсолнечника вредителями и болезнями в 2005 г. (табл.8).

Установлена эффективность обработки семян подсолнечника композицией, включающей глубинную культуру биопрепарата, против фомопсиса 37,1-38,3%, при эффективности эталонной композиции 15,4-41,7% дополнительный урожай в вариантах с биопрепаратом составил 0,33-0,35 т/га, а в вариантах с эталоном - 0,30-0,41 т/га.

Таблица 8Биологическая эффективность обработки семян и вегетирующих растений подсолнечника сорта Р-453 препаратом, полученным на основе штамма ВИЗР-24 против фомопсиса Краснодар, ВНИИМК, 2005 г.
Вариант	Титр, КОЕ/г, мл	Способ применения	Норма расхода, кг/т, л /т, кг/га, л/га	Поражено растений, %	Биологическая эффективность, %	Урожай, т/га	Дополнительный урожай, т/га
Препарат на основе штамма ВИЗР-24, ГК	1,3×109	обработка семян	3,0	11,0	37,1	3,41	0,33
обработка семян+2 обработки вегетирующих растений	3,0 3,0+3,0	10,8	38,3	3,43	0,35
Винцит-форте, СК*	-	обработка семян	2,0	14,8	15,4	3,38	0,30
обработка семян+2 обработки вегетирующих растений	2,0 2,0+2,0	10,2	41,7	3,50	0,42
Контроль без обработки	17,5	-	3,08	-
НСР05	0,15
* СК - суспензионный концентрат

Пример 8. Испытание композиции, включающей биопрепарат, полученный на основе штамма гриба Penicillium vermiculatum Dang.ВИЗР-24, для защиты подсолнечника от болезней и вредителей в производственных условиях.

Производственные испытания инкрустирования композицией, включающей глубинную культуру биопрепарата на основе штамма гриба Penicillium vermiculatum Dang.ВИЗР-24, в 2005 г. проведены в Шовгеновском районе в колхозе "Победа" на сорте подсолнечника Р-453 (Родник). Эталон - винцит-форте с нормой применения 1,0 л/т. Композиция против ложно-мучнистой росы включала апрон-голд с нормой расхода 1,0 л/т, против проволочников - актеллик с нормой расхода 3,0 л/т (табл.9).

Таблица 9Эффективность обработки семян подсолнечника (сорт Р-453) композицией, включающей препарат на основе заявляемого штамма гриба ВИЗР-24, против болезней. Производственные испытания, Шовгеновский район, колхоз «Победа», 2005 г.
Вариант	Норма расхода, кг/т, л/т	Биологическая эффективность, % против
фузариоза	фомопсиса
1. Композиция, включающая биопрепарат на основе штамма ВИЗР-24, ГК	3,0	70,6	90,7
2. Эталон - композиция, включающая препарат винцит-форте, КС**	1,0	47,1	37,3
3. Контроль б/о	-	5,7*	25,0*
* Поражение болезнями в контроле без обработки, в %** Концентрированная суспензия

По сложившимся погодным условиям 2005 г. в республике Адыгея при позднем сроке посева поражение фомопсисом к моменту уборки в контроле составило 25,0%, фузариозом - 5,7%. На этом фоне биологическая эффективность против фомопсиса при обработке семян подсолнечника композицией, включающей биопрепарат на основе штамма ВИЗР-24 (глубинная культура), составила 90,7%, а эффективность эталона винцита-форте 37,3%. Против фузариоза биологическая эффективность эталона винцита-форте составила 47,1%, а биопрепарата на основе заявляемого штамма ВИЗР-24 - 70,6%.

Штамм гриба Penicillium vermiculatum Dang.ВИЗР-24 для получения препарата против фитопатогенных грибов.