Штамм "новосибирский" вируса гриппа птиц influenzae virus avicum для контроля иммуногенной и антигенной активности вакцин и изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики гриппа птиц

Штамм "новосибирский" вируса гриппа птиц influenzae virus avicum для контроля иммуногенной и антигенной активности вакцин и изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики гриппа птиц

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, в частности к новому штамму Influenzae virus avicum, и может быть использовано для контроля иммуногенной и антигенной активности вакцин, а также при разработке и изготовлении средств диагностики и специфической профилактики гриппа типа А.

Таксономически вирусы гриппа отнесены к семейству ортомиксовирусов (Ortho-myxoviridae, по классификации ICTV - 00.046).

В рамках семейства Orthomyxoviridae (по классификации ICTV - 00.046) вирусы типов А и В образуют род Genus Influenzavirus А (по классификации ICTV - 00.046.0.01, по классификации NCBI, соответственно, ID: 197911 и ID: 197912).

Вирусы типа С образуют род Genus Influenzavirus С (по классификации ICTV - 00.046.02.001, по классификации NCBI ID: 197913).

Принадлежность штамма вируса гриппа к одному из этих родов определяется консервативными элементами генома, задающими антигенные характеристики нуклеокапсидов.

Вирионы вируса гриппа - оболочечные, плеоморфные. Диаметр сфероподобных частиц, преобладающих в культуре клеток, 50-120 нм. Филаментовидные вирионы, доминирующие при размножении вируса в макроорганизме, имеют диаметр около 20 нм, длину 200-300 нм и более.

На поверхности вириона находятся шипообразные выступы (спайки) длиной 10-14 нм, диаметром 4-6 нм, в количестве около 500. Спайк - гомотример молекул гемагглютинина (НА - hemagglutinin), укорененных в вирусной мембране гидрофобными доменами.

В промежутках между кластерами спайков у вирусов типа А размещаются около 100 молекул экзо-альфа-сиалидазы (нейраминидазы) (NA - neuraminidase). Этот вирусный фермент расщепляет сиалоолигосахариды - производные N-ацетилнейраминовой (сиаловой) кислоты, которые используются вирусом в качестве рецепторов для прикрепления к клеточной мембране. Их синтетические аналоги - занамивир и озельтамивир - применяются для химиотерапии гриппа.

Помимо НА и NA на мембране вириона экспонированы тетрамеры белка М2, эктодомены которых, будучи намного мельче эктодоменов ГА, тем не менее, служат поверхностными антигенами, антитела к которым усиливают иммунитет к гриппу.

Молекулы М2 функционируют в качестве протонных каналов, необходимых для запуска функции слияния вирусной и эндосомной мембран. Эти каналы служат мишенями таких противовирусных химиопрепаратов, как ремантадин и амантадин.

Внутри оболочки вириона размещаются восемь винтообразно закрученных нуклеокапсидов (в диаметре 9-15 нм, длиной от 50 до 130 нм) с петлей на одном из концов каждого из них. В нуклеокапсидах находятся фрагменты вирусного генома, представленные линейными одноцепочечными антисмысловыми молекулами РНК.

Восемь генов вируса кодируют 10 белков. Все они, кроме NS1, представлены в составе вириона. Транскрипты генов NS и М испытывают сплайсинг, и с каждого из них транслируется по два белка - NS1, NS2 и М1, M2, соответственно. Сплайсинг осуществляется в клеточном ядре, куда рибонуклеопротеидные системы вируса импортируются в целях его репликации.

Общий размер генома составляет около 13600 нуклеотидов (нт).

Фрагмент №1 (около 2350 нт) кодирует РВ2 (polymerase basic unite 2) - вторую субъединицу гетеротримерного РНК-полимеразного вирусного комплекса (основный белок 2), изоэлектрическая точка (pI) которого находится в щелочной области.

Фрагмент №2 (как правило, чуть менее 2350 нт) кодирует другой компонент того же комплекса - основной белок РВ1 (polymerase basic unite 1).

Фрагмент №3 (около 2250 нт) кодирует кислый белок РНК-полимеразного комплекса PA (polymerase acidic unite).

Комплекс РВ1-РВ2-РА осуществляет как транскрипцию, так и репликацию генов вируса. При этом РВ1 работает как «классическая» полимераза, обеспечивающая полимеризацию в сочетании с эндонуклеазным вырезанием; РВ2 специфически связывается с кэпом - 7-метил-гуанозиновым остатком на 5′- на конце плюс-РНК, пришитым к ней посредством 5′-5′-трифосфатного сегмента; РА задействована в репликации, элонгации и эндонуклеазной активности.

В 5′ и 3′-концевых участках всех генов находятся повторяющиеся 13- и 12-нуклеотидные сегменты промоторов - специфических сайтов связывания РВ 1. Повторы 5′-концевого участка (у вирусов типа А они имеют вид 5′-AGUAGAAACAAGG) комплементарны инвертированным повторам, расположенным на 3′-конце. Кроме того, 3′-концевые области некоторых фрагментов генома содержат консервативные отрезки, типичные для вирусных штаммов, поражающих субъектов определенного биологического вида.

Фрагмент №4 (около 1780 нт) кодирует гемагглютинин (НА).

Фрагмент №5 (ген NP, около 1575 нт) кодирует нуклеопротеин (NP).

Агрегаты синтезированного в зараженной клетке NP захватывают вирусные РНК с компонентами РНК-полимеразного комплекса (белками РА, ВР1, ВР2) и способствуют почкованию вирионов.

Фрагмент №6 (около 1420 нт) кодирует нейраминидазу (NA).

Фрагмент №7 (ген МР, около 1050 нт) кодирует нуклеокапсидный матриксный белок М1 и мембранный матриксный белок М2. Их последовательности частично совпадают в N-концевых участках вследствие сплайдинга транскриптов гена М, создающего условия для неоднозначного синтеза и -РНК. При этом крупный С-концевой сегмент белка М2 транслируется со сдвигом рамки.

Фрагмент №8 (ген NS, около 900 нт), транскрипт которого содержит крупный нитрон и подвергается сплайсингу, кодирует белки NS2 и NS1.

Их последовательности частично перекрываются вследствие неоднозначной трансляции. При этом крупный С-концевой сегмент белка NS1 (аналогично С-концевому сегменту белка М2) синтезируется при трансляции со сдвигом рамки. Белок NS2, ответственный за транспорт нуклеопротеидных компонентов вируса в клеточное ядро, иногда упоминают как NEF (nuclear exportfactor). Некоторое время его считали неструктурным белком, но позднее обнаружили в составе вирионов. Неструктурный белок NS1 регулирует сплайсинг и трансляцию РНК, а также модулирует синтез интерферона клеткой в ответ на заражение вирусом.

Общая молекулярная масса вириона составляет примерно 250×10⁶, плотность 1,19 г/см³, коэффициент седиментации сфероподобных частиц 700-800 S_20w. Вирионы чувствительны к воздействию растворителей липидов, неионных детергентов, формальдегида, окислителей, бета-пропиолактона, производных азиридина, быстро инактивируется при нагревании (56°С), ультрафиолетовом облучении и при снижении рН ниже 5,0 [ICTV - International Committee on Taxonomy of Viruses (2006).

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ICTVdb/ICTVdB/]

Грипп А - контагиозное вирусное заболевание, которое вызывает сезонные эпизоотии и панзоотии с различным уровнем смертности в зависимости от степени патогенности возбудителей.

Вирус гриппа А широко распространен в природе, поражает многие виды млекопитающих и птиц, в основном водного и околоводного экологических комплексов. От диких птиц выделены вирусы со всеми известными сочетаниями поверхностных белков, при этом инфекция у диких птиц протекает в виде энтерита, без видимых признаков заболевания. Это указывает на высокую степень адаптации вирусов гриппа А к диким птицам, которые являются естественными хозяевами вирусов гриппа. Вирус сохраняется в воде в течении длительного времени (6-8 месяцев), инфицирование происходит водно-фекальным путем.

Вирус гриппа А отличается высокой степенью вариабельности, особенно это касается поверхностных гликопротеинов вириона: НА и NA. Установлено, что антитела хозяина к НА и NA обеспечивают основу гуморального иммунитета, при этом ведущую роль играют протективные антитела к НА. Известно 16 антигенных подтипов НА (Н1-Н16) и 9 подтипов NA (N1-N9). Вирус гриппа обладает сегментированным геномом. состоящим их 8 сегментов, которые обладают высокой способностью к реассортации.

Различные комбинации НА и NA способны привести к появлению высоковирулентных штаммов вируса, вызывающих высокий процент смертности.

В настоящее время наблюдается распространение гриппа птиц (ГП). вызванного вирусом типа А, подтипа H5N1, на территории Евразии. Считается, что этот подтип является одним из наиболее опасных в плане возникновения пандемий (1).

Заболевание, вызванное высокопатогенными штаммами возбудителя ГП типа А (H5N1), наносит колоссальный экономический ущерб в промышленном птицеводстве, что подтверждается недавними эпизоотическими вспышками «куриного гриппа» в Сибирском, Центральном и Южном регионах Российской Федерации, а также на территории стран ближнего и дальнего зарубежья.

Важными условиями успешной борьбы с этим заболеванием являются своевременная и правильная его диагностика и проведение мер специфической профилактики.

При сравнении выделенных изолятов вируса ГП обнаруживается чрезвычайно высокая их генетическая и антигенная вариабельность. Это обстоятельство вынуждает вести постоянный поиск новых изолятов вируса ГП, пригодных для изготовления диагностических и вакцинных препаратов.

В странах, где отмечены вспышки этого заболевания, специфическая профилактика ГП проводится с помощью инактивированных и рекомбинантных вакцин.

Известен ряд зарубежных штаммов вируса ГП, используемых для изготовления диагностических и вакцинных препаратов (2-7).

Известен штамм H7N1/Rostock (№ доступа последовательности в Genbank=х 52226) вируса ГП, используемый для изготовления диагностических и вакцинных препаратов (8).

Известен штамм А /turkey/Ontario/7732/66 (H5N9) вируса ГП, используемый для изготовления диагностических и вакцинных препаратов (9-11).

Известен штамм A /chicken/Pakistan/95 (H7N3) вируса ГП, используемый для изготовления диагностических и вакцинных препаратов (12).

Известен штамм А /chicken /Queretaro/14588-19/95 (H5N2) вируса ГП, используемый для изготовления диагностических и вакцинных препаратов (13).

Известен штамм A /turkey/Wisconsin 68 (H5N9) вируса ГП, используемый для изготовления диагностических и вакцинных препаратов (13).

Известен штамм A /turkey/Oregon/71 (H7N3) вируса ГП, используемый для изготовления диагностических и вакцинных препаратов (13).

Известен штамм A /mallard/Ohio/556/87 (H5N9) вируса ГП, используемый для изготовления диагностических и вакцинных препаратов (13).

Известен штамм A /chicken/Mexico/31381-7/94 (H5N2) вируса ГП, используемый для изготовления диагностических и вакцинных препаратов (13).

Известен штамм A /chicken/Mexico/26654-1374/94 (H5N2) вируса ГП, используемый для изготовления диагностических и вакцинных препаратов (13).

Известен штамм A /turkey/Minnesota/10734-5/95 (H5N2) вируса ГП, используемый для изготовления диагностических и вакцинных препаратов (13).

Известен штамм A /chicken/Jalisco/14589-660/94 (H5N2) вируса ГП, используемый для изготовления диагностических и вакцинных препаратов (13).

Известен штамм A /chicken/Veracruz/28159-398/95 (H5N2) вируса ГП, используемый для изготовления диагностических и вакцинных препаратов (13).

Известен штамм A /chicken/Puebla/28159-474/95 (H5N2) вируса ГП, используемый для изготовления диагностических и вакцинных препаратов (13).

Известен штамм A /chicken/Chiapas/28159-488/95 (H5N2) вируса ГП, используемый для изготовления диагностических и вакцинных препаратов (13).

Известен штамм A /turkey/Minnesota/3689-1551/81 (H5N2) вируса ГП, используемый для изготовления диагностических и вакцинных препаратов (14).

Известен штамм A /duck/Singapore/F119/97 (H5N3) вируса ГП, используемый для изготовления диагностических и вакцинных препаратов (14).

Известен штамм A /Hong Kong/156/97 (H5N1) вируса ГП, используемый для изготовления диагностических и вакцинных препаратов (14).

Известен штамм A /Hong Kong/483/97 (H5N1) вируса ГП, используемый для изготовления диагностических и вакцинных препаратов (14).

Известен штамм A /duck/Potsdam/1402/86 (H5N2) вируса ГП, используемый для изготовления диагностических и вакцинных препаратов (14).

Известен штамм A /duck/Potsdam/2243/84 (H5N6) вируса ГП, используемый для изготовления диагностических и вакцинных препаратов (15).

Известен штамм A /ck/Italy/473/99 (H7N1) вируса ГП, используемый для изготовления диагностических и вакцинных препаратов (15).

Известен штамм A /duck/Potsdam/15/80 (H7N7) вируса ГП, используемый для изготовления диагностических и вакцинных препаратов (15).

Известен штамм A /ck/UAE/415/99 (H7N1) вируса ГП, используемый для изготовления диагностических и вакцинных препаратов (15).

Наиболее близким предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является штамм A /Hong Kong/483/97 (H5N1) вируса ГП, используемый для изготовления диагностических и вакцинных препаратов (14).

Задача, на решение которой направлено настоящее изобретение, заключается в расширении арсенала штаммов вируса ГП, обладающих высокой инфекционной, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде, сохраняющих антигенную и иммуногенную активность после инактивации, обеспечивая тем самым получение чувствительных и высокоспецифичных диагностикумов и вакцинных препаратов, создающих эффективную защиту домашней птицы против гомологичного вируса и предотвращающих выделение вакцинированной птицей возбудителя инфекции в окружающую среду.

Указанная задача решена получением штамма «Новосибирский» (авторское наименование) ГП типа А, подтипа H5N1, используемого для контроля иммуногенной и антигенной активности вакцин и изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ГП.

Вирусный изолят, послуживший источником для получения штамма «Новосибирский», был выделен в ФГУ «ВНИИЗЖ» в августе 2005 г. из проб, поступивших 22 июля того же года из села Копкуль Купинского района Новосибирской области. Это были ткани трахеи, легких, селезенки и головного мозга, взятые у заболевших одномесячных утят домашней утки (Anas platyrhynchos domesticus).

При выделении вируса с целью получения его однородной популяции, обладающей оптимальными биотехнологическими свойствами, использовали метод формирования бляшек под агаром на культуре клеток MDCK. Для пассирования каждый раз отбирали вирус из одной бляшки, имевшей типичные размеры. После 15 пассажей получена вирусная популяция, обладающая относительно стабильными инфекционными и иммунологическими свойствами. Титр инфекционной активности для клеток MDCK составлял 10^8,5 ЦПД₅₀, титр в реакции гемагглютинации (РГА) составил 1:128.

После вышеописанного клонирования была проведена адаптация вируса к эмбрионам кур посредством семи последовательных пассажей в эмбрионах SPF-кур, после чего был получен штамм «Новосибирский», имеющий стабильные биотехнологические свойства, которые позволяют использовать его в качестве производственной расплодки для получения антигенного материала при изготовлении диагностикумов и вакцинных препаратов.

Штамм «Новосибирский» вируса ГП типа А, подтипа H5N1, депонирован 12 апреля 2006 г. во Всероссийскую государственную коллекцию штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, Федерального государственного учреждения «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ «ВГНКИ») под регистрационным номером (ссылкой) - производственный штамм «ВНИИЗЖ» №125-ДЕП «Новосибирский» вируса ГП типа А, подтипа H5N1.

По сравнению с исходным изолятом штамм имеет генетические и фенотипические особенности. В отличие от исходного изолята, он воспроизводимым образом клонируется в культуре MDCK, продуцируя однородные бляшки; обладает высокой вирулентностью, дает хороший урожай при размножении в эмбрионах кур и лучше сохраняет антигенную силу после инактивации. Экспериментально подтверждена возможность его использования для контроля иммуногенной и антигенной активности вакцин и для приготовления биопрепаратов для специфической профилактики и диагностики ГП.

Сущность изобретения пояснена чертежами, на которых на:

фиг.1 представлена дендрограмма, отражающая результаты филогенетического анализа последовательностей нуклеотидов фрагмента гена Н5 (731-1113 нт) изолятов высокопатогенного вируса ГП. Выделены группы: I - российские изоляты и изоляты Qinghai; II - изоляты генетической линии A/Guangdong/1/96, -

фиг.2 - дендограмма, отражающая результаты филогенетического анализа последовательностей нуклеотидов фрагмента гена N1 (605-937 нт) изолятов высокопатогенного вируса ГП. Выделены группы: I - российские изоляты и изоляты Qinghai; II - изоляты генетической линии A/Guangdong/1/96, -

а также в перечне последовательностей, в котором:

SEQ ID NO:1 представляет последовательность нуклеотидов гена ВР2 штамма «Новосибирский» вируса ГП;

SEQ ID NO:2 - последовательность нуклеотидов гена ВР1;

SEQ ID NO:3 - последовательность нуклеотидов гена РА;

SEQ ID NO:4 - последовательность нуклеотидов гена НА;

SEQ ID NO:5 - последовательность нуклеотидов гена NA;

SEQ ID NO:6 - последовательность нуклеотидов гена NP;

SEQ ID NO:7 - последовательность нуклеотидов гена МР;

SEQ ID NO:8 - последовательность нуклеотидов гена NS;

SEQ ID NO:9 - последовательность аминокислот белка ВР2 штамма «Новосибирский» вируса ГП;

SEQ ID NO:10 - последовательность аминокислот белка ВР1;

SEQ ID NO:11 - последовательность аминокислот белка PA;

SEQ ID NO:12 - последовательность аминокислот белка НА;

SEQ ID NO:13 - последовательность аминокислот белка NA;

SEQ ID NO:14 - последовательность аминокислот белка NP;

SEQ ID NO:15 - последовательность аминокислот белка М1;

SEQ ID NO:16 - последовательность аминокислот белка М2;

SEQ ID NO:17 - последовательность аминокислот белка NS1;

SEQ ID NO:18 - последовательность аминокислот белка NS2;

Штамм «Новосибирский» вируса ГП характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические признаки

Штамм «Новосибирский» вируса ГП относится к семейству Orthomyxoviridae, серотипу А, подтипу H5N1 и обладает морфологическими признаками, характерными для вируса гриппа типа А.

Вирионы вируса гриппа - оболочечные, плеоморфные. Диаметр сфероподобных частиц 50-120 нм; филаментовидные частицы около 20 нм в диаметре, длиной 200-300 нм и более. На поверхности вириона, возвышаясь над липидной мембраной на 10-14 нм, находятся около 500 шипообразных выступов (спайков), образованных гомотримерами НА.

В промежутках между кластерами спайков у вирусов типа А размещаются, как правило, около 100 молекул NA.

Липидная мембрана окружает петлеобразные филаменты нуклеокапсидов с восемью фрагментами вирусного генома, каждый из которых представлен линейной одноцепочечной антисмысловой РНК.

Общая длина генома составляет около 13600 нуклеотидов (нт). Наиболее крупный фрагмент (№1) содержит около 2350 нт; №2 - чуть менее 2350 нт; №3, как правило, - 2250 нт; №4 - 1780 нт; №5 - 1575 нт; №6 - 1420 нт; №7 - 1050 нт; №8 - 900 нт.

На обоих концах каждой геномной цепи РНК содержатся повторяющиеся отрезки, причем повторы 5′-концевого участка (у вирусов типа А они имеют вид 5′-AGUAGAAACAAGG) комплементарны инвертированным повторам, расположенным на 3′-конце. Кроме того, 3′-концевые участки некоторых фрагментов генома содержат консервативные отрезки, типичные для вирусных штаммов, поражающих субъектов определенного биологического вида [ICTV-International Committee on Taxonomy of Viruses (2006). http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ICTVdb/ICTVdB/].

Антнгенные свойства

По своим антигенным свойствам штамм «Новосибирский» вируса ГП относится к типу А, подтипу H5N1.

Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой.

Инактивированный вирус индуцирует антитела, выявляемые методами РТГА, РН, РДП и ИФА. Так, через 12 дней после однократной иммунизации цыплят инактивированной вакциной из штамма «Новосибирский» титр антител к НА, обеспечивающих реакцию торможения гемагглютинации, составил 5,0 log₂; титр антител, определяемых методом ИФА, равнялся 1:1243, преципитирующие антитела обнаруживались при разведении исследуемых сывороток от 1:2 до 1:4 (см. табл.1)

Определение и сравнительный анализ первичной структуры амплифицированных фрагментов кДНК показал, что исследованная проба содержала фрагменты генома полевых изолятов вируса ГП. Первичная структура сайта разрезания белка NA изолята имела вид PQGRERRRKKR*GLF, что свидетельствует о том, что он относится к группе высокопатогенных штаммов вируса ГП.

Сравнение полученных последовательностей с последовательностями гена НА типа Н5 и гена NA типа N1 из банка данных «Flu. The Influenza Sequence Database» (http://www.flu.lanl.gov/) показало, что НА штамма «Новосибирский» относится к подтипу Н5, а его NA - к подтипу N1. Последовательности того и другого белка состоят в близком родстве с соответствующими последовательностями обширной линии изолятов филогенетической группы A/Goose/Guandong/1/96 (H5N1), выделенных на территории Китая и Юго-Восточной Азии после 1997 года (см. фиг.1 и 2).

Биотехнологические характеристики

Штамм «Новосибирский» проявляет высокую биологическую, антигенную и иммуногенную активность, предназначен для получения диагностических препаратов и для изготовления инактивированной вакцины против вируса ГП.

Штамм репродуцируется в 10-12-суточных эмбрионах кур при температуре 37,0±0,5°С и влажности 50-70%. Заражение в дозе в пределах от 1 до 10^4,0 ЭЛД₅₀ вызывает специфическую гибель эмбрионов кур в период от 24 до 48 часов инкубирования. При этом вирус накапливается с титрами от 9,0 до 10,2 lg ЭЛД₅₀/мл. Такой урожай обеспечивает приготовление 50-70 прививных доз вакцины из одного погибшего эмбриона. Штамм «Новосибирский» вируса ГП является стабильным, обладает высокой вирулентностью и адаптирован к размножению в эмбрионах кур.

Хемо- и генотаксономическая характеристика

Геном штамма «Новосибирский» вируса ГП состоит из восьми неодинаковых по размеру (900-2350 нт) фрагментов односпиральной минус-РНК, суммарная длина которых составляет около 14 тыс. нуклеотидов с молекулярной массой 4,5 МД. Вирионная РНК не обладает инфекционностью. В вирионах обнаружено 10 белков. Белки делятся на поверхностные (НА, NA, M2) и внутренние (РВ1, РВ2, PA, NP, M1, NS1, NS2).

НА и NA имеют важнейшие антигенные сайты, на которые вырабатывается защитный иммунитет, в первую очередь в виде нейтрализующих антител.

Физические свойства

Молекулярная масса вирионов составляет 250 МД, плавучая плотность в сахарозе 1,19 г/см³, коэффициент седиментации вирионов 700-800 S 20w.

Устойчивость к внешним факторам

Штамм «Новосибирский» вируса ГП чувствителен к детергентам, формальдегиду, бета-пропиолактону, производным азиридина, быстро инактивируется при прогревании (56°С), ультрафиолетовом облучении и при рН ниже 5,0.

Дополнительные признаки и свойства

Иммуногенная активность - иммуногенен в составе инактивированной вакцины.

Реактогенность - реактогенными свойства не обладает. Иммунизация цыплят дозой, в два раза превышающей прививную, не вызывает видимых клинических изменений в общем состоянии птицы, а также локальных поражений ткани в месте введения.

Патогенность - высокая (внутривенный индекс 2,87, что соответствует высокопатогенным штаммам вируса ГП).

Вирулентность - 100% гибель внутримышечно зараженных цыплят в дозе 10^6,0 ЭЛД₅₀.

Онкогенность - отсутствует.

Контагиозность - контагиозен. Неиммунные цыплята заражаются при совместном содержании с зараженными.

Стабильность штамма отмечена при проведении 5 последовательных пассажей на чувствительных цыплятах.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1

Определение подтиповой антигенной характеристики штамма проводили с помощью перекрестной реакции торможения гемагглютинации (РТГА) с референтными гипериммунными сыворотками к антителам 15 Н-типов вируса ГП и гетерологичной сывороткой к вирусу ньюкаслской болезни. Испытуемый антиген исследовали с использованием набора референтных сывороток в РТГА.

Было отмечено торможение гемагглютинирующей активности штамма в разведениях от 1:32 до 1:256, как при использовании референтных сывороток, специфичных по отношению к вирусам подтипа Н5, так и при проверке экспериментальной сыворотки, полученной от цыплят при введении инактивированного препарата, приготовленного из штамма «Новосибирский» (см. табл.2). Это позволило отнести новый штамм к подтипу Н5 вируса гриппа типа А.

Для выявления генома вируса ГП из проб тканей птиц и экстраэмбриональной жидкости (ЭЭЖ) зараженных эмбрионов кур выделяли общую РНК, которую использовали для реакций ОТ и ПЦР. Первичную индикацию гена М проводили, используя праймеры AIVM49F и AIVM941R. После амплификации ДНК, полученной с применением указанных праймеров, был синтезирован вирусспецифический фрагмент кДНК размером 892 пар нуклеотидов (п.нт).

В случае получения положительного результата реакций ОТ и ПЦР проводили дифференциацию штамма. Посредством амплификации с применением праймеров aivH5_av_667F1, aivH5_av_1065R, nl_nov_408f, nl_nov_912r, был синтезирован вирусспецифический фрагмент кДНК размером 398 п.нт (Н5 ген) и 432 п.нт (N1 ген).

Анализ первичной структуры амплифицированных фрагментов кДНК показал, что исследованная проба содержала фрагменты генома полевых изолятов вируса ГП. Первичная структура сайта разрезания белка NA изолята имела вид PQGRERRRKKR*GLF, что свидетельствует о его принадлежности группе высокопатогенных штаммов вируса ГП.

Проведено сравнение полученных последовательностей с последовательностями гена НА типа Н5 и гена NA типа N1 из банка данных «Flu. The Influenza Sequence Database» (http://www.flu.lanl.gol/). Показано, что НА выделенного изолята принадлежит к подтипу Н5, а NA к подтипу N1 обширной линии изолятов вируса ГП A/Goose/Guangdong/1/96 (H5N1), выделенных на территории Юго-Восточной Азии (включая Индонезию) и Китая, начиная с 1996 г. и по настоящее время (см. фиг.1 и 2).

Ближайшими аналогами российских изолятов являются изоляты с озера Qinghai в одноименной провинции КНР (северо-восток Тибета), выделенные в мае 2005 г. во время вспышки гриппа у дикой водной птицы - гусей и чаек. У отдельных изолятов (как китайских, так и российских) обнаружены 1 или 2 аминокислотные и 2 или 3 нуклеотидные замены. В случае российских изолятов прослеживается корреляция определенных замен с географическим положением участков, на которых эти вирусные изоляты были получены.

По результатам ПЦР получено заключение о принадлежности штамма «Новосибирский» семейству Orthomyxoviridae, вирусам гриппа А, подтипу H5N1.

Таким образом, по данным серологического (с помощью РТГА) и молекулярно-биологического методов исследований (посредством ПЦР) установлена принадлежность штамма «Новосибирский» семейству Orthomyxoviridae, вирусам гриппа А, подтипу H5N1.

Кроме того, доказана генетическая близость штамма «Новосибирский» и обширного набора изолятов вируса подтипа H5N1, выделенных на территории Юго-Восточной Азии в период с 1996 г. по настоящее время, а также группе российских изолятов, выделенных в 2005 г. Это обстоятельство позволяет использовать указанный штамм для изготовления вакцины, предназначенной для защиты домашних птиц от заражения особо опасными актуальными штаммами вируса гриппа.

Пример 2

Для оценки патогенности штамма использовали внутривенный индекс патогенности (IVPI), определяя его по методу, описанному в издании OIE «Manual of Diagnostic Test and Vaccines for Terrestrial Animals». С учетом данных, представленных нами в таблице 3, этот индекс составил 2,9. Согласно критериям OIE данный штамм можно считать высокопатогенным.

Пример 3

Штамм «Новосибирский» высокопатогенен и действует очень быстро - его «полулетальная» доза вызывает гибель 50% эмбрионов кур в период от 24-х до 48-ми часов после заражения, что практически во всех случаях позволяет не сомневаться в специфичности гибели. При этом инфекционная активность ЭЭЖ, содержащейся в яйце с погибшим эмбрионом, составляла 9,2-10,2 lg ЭЛД₅₀/мл (см. табл.4). Вирусного материала, полученного из одного эмбриона, хватает на производство 50-70 прививных доз инактивированной эмульсионной вакцины.

Доза вируса, достаточная для гибели всех зараженных эмбрионов кур в течение вторых суток после заражения, составляла 10-1000 ЭЛД₅₀/0,2 мл.

В результате проведенных исследований были определены оптимальные параметры культивирования исследуемого штамма. Штамм ВНИИЗЖ №125-ДЕП «Новосибирский» вируса ГП типа А, подтипа H5N1, репродуцируется в 10-12-суточных эмбрионов кур при температуре 37,0±0,5°С и влажности 50-70%. Заражающая доза в пределах от 10^1,0 до 10^4,0 ЭЛД₅₀ вызывает специфическую гибель эмбрионов кур, ограниченную временным промежутком от 24 до 48 часов инкубирования. В течение указанного промежутка времени вирус накапливается в титрах от 9,2 до 10,2 lg ЭЛД₅₀/мл.

Пример 4

Гипериммунную сыворотку получали с использованием цыплят в возрасте 30-60 дней, у которых отсутствовали антитела к НА вируса гриппа. Для этого их иммунизировали штаммом «Новосибирский» внутримышечно в область грудной группы мышц или подкожно в область средней трети шеи дозой 0,5 мл двукратно с интервалом 21 сутки. Для иммунизации использовали инактивированный препарат с масляным адъювантом, прививная доза составляла не менее 7,0 lg ЭЛД₅₀/0,5 мл препарата, определенная до инактивации. Затем не ранее чем через 28 суток после второй иммунизации цыплят обескровливали, получали сыворотку и определяли ее активность.

Затем сыворотку дополняли стабилизирующими добавками, лиофильно высушивали и использовали в качестве достоверно положительного тест-препарата, специфического по отношению к штамму «Новосибирский» при проведении серологических исследований (РТГА, РДП, РН, ИФА и др.).

Результаты исследований полученной сыворотки представлены в таблице 5.

Пример 5

Для изготовления вакцины в качестве чувствительной биологической системы используют 10-12-суточные эмбрионы SPF-кур. ЭЭЖ очищают от балластных примесей центрифугированием при 1000 об/мин в течение 10-15 мин. После центрифугирования вирусный материал сливают в 10-20-литровые бутыли и подвергают инактивации. Перед инактивацией инфекционная активность вируса должна быть не ниже 9,0 lg ЭЛД₅₀/мл, а НА-активность не ниже 1:64.

Для инактивации вируса используют аминоэтилэтиленимин (АЭЭИ), формальдегид или бета-пропиолактон (16).

АЭЭИ добавляют в вирусосодержащую суспензию при перемешивании в виде 10%-ного раствора до конечной концентрации 0,1-0,2%, формальдегид - до конечной концентрации 1/1000, а бета-пропиолактон - до конечной концентрации 1/2000-1/4000. Инактивацию вируса проводят в течение 24 часов при температуре от 20 до 37°С. По окончании инактивации АЭЭИ нейтрализуют внесением тиосульфата натрия в суспензию антигенного материала.

После контроля на стерильность и авирулентность антиген подвергают повторной очистке от балластных примесей, пропуская его через промежуточную центрифугу ОТР-102К-01 при 15000-17000 об/мин со скоростью подачи антигена 40-50 л/час и фильтровальную установку.

Очищенный и авирулентный антигенный материал должен иметь НА-активность не менее 1:64 и рН в пределах 7,2-7,4.

Эмульсионную вакцину получают путем диспергирования очищенного и авирулентного антигенного материала с масляным адъювантом в соотношении, мас.%, 30:70-40:60.

Из адъювантов целесообразно использовать масляный адъювант на основе минерального масла «Marcol-52» и эмульгаторов - неионогенных поверхностно-активных веществ (алкилмодифицированный полиоксиалкилен-силоксановый сополимер (АПС) и ланолин) или коммерческий масляный адъювант марки Montanide ISA-70 производства фирмы «Seppic» (Франция).

Содержание антигенного материала и масляного адъюванта в прививной дозе вакцины в соотношении, мас.%, 30:70-40:60 является оптимальным, так как обеспечивает толерантную презентацию антигена в организме иммунизированной птицы.

Полученная вакцина представляет собой однородную эмульсию белого цвета типа «вода в масле». Допускается в верхней части флакона наличие слоя масляного адъюванта. При интенсивном встряхивании однородность содержимого легко восстанавливается.

Полученную вакцину контролируют на соответствие показателям, установленным стандартом организации.

Пример 6

В лабораторных условиях проведено определение иммуногенной активности производственной серии №1 инактивированной эмульсионной вакцины против ГП из штамма «Новосибирский», приготовленной так, как описано в примере 5, и содержащей, мас.%:

Очищенный и авирулентный антигенный материал
из штамма «Новосибирский» вируса ГП типа А, подтипа H5N1,
полученного в 10-12-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной
активностью 9,1 lg ЭЛД50/мл и НА-активностью 1:1024	30,0
Масляный адъювант	70,0.

Для определения протективной активности вакцины использовали 5 цыплят в возрасте 50 дней. Каждого из них иммунизировали внутримышечно в область грудной группы мышц дозой 0,5 мл. Через 16 суток после иммунизации цыплят заражали живым вирусом штамма «Новосибирский» в дозе 6,0 lg ЭЛД₅₀ внутримышечно.

Совместно с опытной группой иммунизированных цыплят (группа №1) в одной клетке находилась контрольная группа (группа №2), состоявшая из невакцинированных и незараженных особей. Через 60 часов в клетку к указанным цыплятам были помещены цыплята еще одной контрольной группы - ее членов, не вакцинировав, заразили (группа №3). Результаты осмотров, проводившихся с интервалами 12 ч, представлены в таблице 6. Они позволяют сделать ряд выводов:

1. Цыплята группы №3, невакцинированные и зараженные штаммом «Новосибирский», заболели и погибли после проявления клинических признаков и при обнаружении патологоанатомических признаков, характерных для тяжелой формы ГП.

2. Судя по тому, что цыплята группы №2 с задержкой на 7-8 дней также заболели и погибли с клиническими и патологоанатомическими признаками, характерными для тяжелой формы ГП, можно полагать, что они заразились от цыплят группы №3.

3. Цыплята, иммунизированные испытуемой вакциной, имели абсолютную защиту против заражения высокопатогенным штаммом вируса гриппа типа А, подтипа H5N1.

Таким образом, инактивированная вакцина против ГП из штамма «Новосибирский» обладает высокой протективной активностью в отношении гомологичного штамма «Новосибирский» ГП типа А, подтипа H5N1.

Для более полной характеристики иммуногенной активности инактивированной вакцины против ГП проводили исследование антигенной активности сывороток крови опытных групп цыплят. В таблице 7 представлены результаты определения антигенной активности сывороток крови методом РТГА.

Из представленных в таблице 7 данных можно сделать вывод, что титр антител, равный 5,8 log₂ у иммунизированных испытуемой вакциной цыплят (гр. №1) на момент заражения (16 сутки после иммунизации), был достаточным для обеспечения 100% иммунитета против заболевания ГП. Контрольное заражение вирулентным штаммом вируса ГП «Новосибирский» не вызвало подъема уровня специфических антител в крови опытных цыплят.

Суммируя вышесказанное, можно сделать вывод, что инактивированная вакцина против ГП из штамма «Новосибирский» обладает высокой иммуногенной активностью.

Штамм ВНИИЗЖ №125-ДЕП «Новосибирский» вируса ГП, полученный в соответствии с предлагаемым изобретением, обладает высокой биологической, антигенной и протективной активностью, расширяет арсенал штаммов вируса ГП, пригодных для изготовления высокоиммуногенных и безвредных вакцинных препаратов.

Пример 7

Проведены испытания антигенной активности инактивированной вакцины против ГП (серия №1), полученной так, как описано в примерах 5 и 6.

Цель исследований - изучить формирование иммунитета к ГП у цыплят разного возраста, привитых вакциной в объеме 0,25 мл, а также формирование иммунитета к ГП у птиц разного вида: утят, гусят и индюшат.

Для изучения иммунитета у цыплят разного возраста были сформированы 4 опытные и 4 контрольные группы цыплят, свободных от антител к вирусу гриппа. Опытные и контрольные группы содержали по 5 цыплят одинакового возраста. Цыплят опытных групп иммунизировали инактивированной эмульсионной вакциной внутримышечно в область правой грудки в объеме 0,25 мл.

В пробах сыворотки крови, отобранной у цыплят в разные сроки, определяли активность антител к НА в РТГА.

Представленные в таблице 8 результаты исследований свидетельствуют, что испытуемая вакцина против ГП эмульсионная инактивированная из штамма «Новосибирский» обладает высокой антигенной активностью и способна вызывать формирование антигемагглютинирующих антител у вакцинированных цыплят в возрасте от 1 до 30 суток при введении им вакцины в объеме 0,25 мл.

Для изучения формирования иммунитета у птиц разного вида были сформированы 3 опытных и 3 контрольных группы из утят, гусят и индюшат, свободных от антител к вирусу гриппа. Птиц опытных групп иммунизировали испытуемой вакциной в объеме 0,5 мл.

В пробах сыворотки крови, отобранной у птиц разного вида в разные сроки, определяли активность антител к НА в РТГА.

Представленные в таблице 9 результаты исследований свидетельствуют, что испытуемая вакцина об