Вакцина против гриппа птиц инактивированная эмульсионная

Вакцина против гриппа птиц инактивированная эмульсионная

Реферат

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и может быть использовано при разработке и изготовлении вакцины против гриппа типа А.

Таксономически вирусы гриппа отнесены к семейству ортомиксовирусов (Ortho-myxoviridae, по классификации ICTV - 00.046). Оно включает серотипы А, В и С.

Первые два из них составляют один род (00.046.0.01), серотип С образует другой (00.046.02.001). Принадлежность к одному из них определяется антигенными характеристиками нуклеопротеина (НП) и матриксного белка (M1), расположенных внутри вириона.

Грипп А - контагиозное вирусное заболевание, которое вызывает сезонные эпизоотии и панзоотии с различным уровнем смертности в зависимости от степени патогенности возбудителей.

Вирус гриппа А широко распространен в природе, поражает многие виды млекопитающих и птиц, в основном водного и околоводного экологических комплексов. От диких птиц выделены вирусы со всеми известными сочетаниями поверхностных белков, при этом инфекция у диких птиц протекает в виде энтерита, без видимых признаков заболевания. Это указывает на высокую степень адаптации вирусов гриппа А к диким птицам, которые являются естественными хозяевами вирусов гриппа. Вирус сохраняется в воде в течение длительного времени (6-8 месяцев), инфицирование происходит водно-фекальным путем.

Вирус гриппа А отличается высокой степенью вариабельности, особенно это касается поверхностных гликопротеинов вириона: гемагглютинина (ГА) и нейраминидазы (НА). Установлено, что антитела хозяина к ГА и НА обеспечивают основу гуморального иммунитета, при этом ведущую роль играют протективные антитела к ГА. Известно 16 антигенных подтипов ГА (H1-H16) и 9 подтипов НА (N1-N9). Вирус гриппа обладает сегментированным геномом, состоящим из 8 сегментов, которые обладают высокой способностью к реассортации.

Различные комбинации ГА и НА способны привести к появлению высоковирулентных штаммов вируса, вызывающих высокий процент смертности.

В настоящее время наблюдается распространение гриппа птиц (ГП), вызванного вирусом типа А, подтипа H5N1, на территории Евразии. Считается, что этот подтип является одним из наиболее опасных в плане возникновения пандемий (1).

Заболевание, вызванное высокопатогенными штаммами возбудителя ГП типа А (H5N1), наносит колоссальный экономический ущерб в промышленном птицеводстве, что подтверждается недавними эпизоотическими вспышками «куриного гриппа» в Сибирском, Центральном и Южном регионах Российской Федерации, а также на территории стран ближнего и дальнего зарубежья.

В странах, где отмечены вспышки этого заболевания, в качестве одного из методов борьбы с ним используют вакцинацию. Уменьшение экономических потерь в результате вакцинации связано с предотвращением вспышек заболевания, с ограничением распространения вируса и с возможной минимизацией вероятности его мутации вследствие уменьшения количества восприимчивых к нему птиц.

Известны три вида инактивированных противогриппозных вакцин:

1) вирионные (корпускулярные, или цельные), представляющие собой смесь антигенного материала из гомологичного возбудителю инфекции штамма вируса гриппа с адъювантом в эффективном соотношении;

2) расщепленные, или дезинтегрированные препараты («сплит-вакцины»), представляющие собой смесь структурных компонентов вириона (как поверхностных, так и внутренних), разъединенных с помощью различных детергентов, с адъювантами в эффективном соотношении;

3) субъединичные, содержащие смесь поверхностных структур вириона ГА и НА-носителей протективных антигенов вируса с адъювантами в эффективном соотношении. По способу приготовления почти все перечисленные виды вакцин являются смешанными, так как содержат и цельные вирионы, и их структурные компоненты, в том числе единицы суперкапсида (2).

Современные генно-инженерные методы позволяют создавать вакцины на основе плазмид, встроенных в вирусы оспы или инфекционного ларинготрахеита птиц, что унифицирует высокий выход вируса и, главное, обеспечивает маркирование их по НА. Примером могут служить вакцины, созданные в США и некоторых других странах на основе авирулентных вирусов оспы кур и оспы канареек.

Другой тип вакцин - живые вакцины на основе вирусов со встроенным геном ГА, способных репродуцироваться в организме птиц, не вызывая патологии. Рекомбинантная вакцина фирмы Merial, экспрессирующая ГА Н5, зарегистрирована во многих странах. Эти вакцины высокоэффективны и технологичны, просты в применении, обеспечивают достаточно надежную защиту против гомологичных вирусов, однако они не используются в настоящее время, поскольку являются биопрепаратами «стратегического запаса». Каждая из этих вакцин имеет свои достоинства и недостатки (3-7).

В борьбе с ГП наиболее часто используют инактивированные препараты, включающие полноценные вирионы в смеси с масляным адъювантом.

Известна вакцина против ГП инактивированная эмульсионная, содержащая активное вещество в виде антигенного материала из штамма H7N1/Rostock (№ доступа последовательности в Genbank=×52226) вируса ГП, полученного в постоянной культуре клеток фибробластов эмбрионов кур, очищенного от балластных примесей и инактивированного с помощью бета-пропиолактона в конечной концентрации 1:3000 с 2-часовой экспозицией при 37°С, и целевой добавки в виде масляного адъюванта в эффективном соотношении (8).

Известна вакцина против ГП инактивированная эмульсионная, содержащая активное вещество в виде антигенного материала из штамма A/Turkey/Ontario/7732/66 (H5N9) вируса ГП, полученного в 10-суточных эмбрионах кур с инфекционной активностью 8,9 lg ЭЛД₅₀/мл и инактивированного с помощью формалина 0,5%-ной концентрации в течение 72 часов при 4°С, и целевую добавку в виде масляного адъюванта в соотношении 1:9 (9-11).

Известна вакцина против ГП инактивированная эмульсионная, содержащая активное вещество в виде очищенного и авирулентного антигенного материала из штамма A/Chicken/Pakistan/95 (H7N3) вируса ГП, полученного в чувствительной биологической системе, и целевую добавку в виде масляного адъюванта в эффективном соотношении (12).

Известна вакцина против ГП инактивированная эмульсионная, содержащая активное вещество в виде антигенного материала из штамма A/Chicken/Queretaro/14588-19/95 (H5N2) вируса ГП, полученного в 10-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью 7,3 lg ЭЛД₅₀/0,1 мл и гемагглютинирующей активностью (ГА-активностью) 1:64, очищенного от балластных примесей и инактивированного с помощью 2-бромэтиламина гидробромида, взятого в количестве 3 mM, и целевую добавку в виде масляного адъюванта в соотношении 1:4 (13).

Известна вакцина против ГП инактивированная эмульсионная, содержащая активное вещество в виде антигенного материала из штамма A/Turkey/Wisconsin 68 (H5N9) вируса ГП, полученного в 10-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью 8,5 lg ЭЛД₅₀/0,1 мл и ГА-активностью 1:512, очищенного от балластных примесей и инактивированного с помощью 2-бромэтиламина гидробромида, взятого в количестве 3 mM, и целевую добавку в виде масляного адъюванта в соотношении 1:4 (13).

Известна вакцина против ГП инактивированная эмульсионная, содержащая активное вещество в виде антигенного материала из штамма A/Turkey/Oregon/71 (H7N3) вируса ГП, полученного в 10-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью 8,7 lg ЭЛД₅₀/0,1 мл и ГА-активностью 1:2048, очищенного от балластных примесей и инактивированного с помощью 2-бромэтиламина гидробромида, взятого в количестве 3 mM, и целевую добавку в виде масляного адъюванта в соотношении 1:4 (13).

Известна вакцина против ГП инактивированная эмульсионная, содержащая активное вещество в виде антигенного материала из штамма A/Mallard/Ohio/556/87 (H5N9) вируса ГП, полученного в 10-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью 7,9 lg ЭЛД₅₀/0,1 мл и ГА-активностью 1:64, очищенного от балластных примесей и инактивированного с помощью 2-бромэтиламина гидробромида, взятого в количестве 3 mM, и целевую добавку в виде масляного адъюванта в соотношении 1:4 (13).

Известна вакцина против ГП инактивированная эмульсионная, содержащая активное вещество в виде антигенного материала из штамма A/Chicken/Mexico/31381-7/94 (H5N2) вируса ГП, полученного в 10-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью 7,7 lg ЭЛД₅₀/0,1 мл и ГА-активностью 1:48, очищенного от балластных примесей и инактивированного с помощью 2-бромэтиламина гидробромида, взятого в количестве 3 mM, и целевую добавку в виде масляного адъюванта в соотношении 1:4 (13).

Известна вакцина против ГП инактивированная эмульсионная, содержащая активное вещество в виде антигенного материала из штамма A/Chicken/Mexico/26654-1374/94 (H5N2) вируса ГП, полученного в 10-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью 8,3 lg ЭЛД₅₀/0,1 мл и ГА-активностью 1:128, очищенного от балластных примесей и инактивированного с помощью 2-бромэтиламина гидробромида, взятого в количестве 3 mM, и целевую добавку в виде масляного адъюванта в соотношении 1:4 (13).

Известна вакцина против ГП инактивированная эмульсионная, содержащая активное вещество в виде антигенного материала из штамма A/Turkey/Minnesota/10734-5/95 (H5N2) вируса ГП, полученного в 10-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью 7,9 lg ЭЛД₅₀/0,1 мл и ГА-активностью 1:96, очищенного от балластных примесей и инактивированного с помощью 2-бромэтиламина гидробромида, взятого в количестве 3 mM, и целевую добавку в виде масляного адъюванта в соотношении 1:4 (13).

Известна вакцина против ГП инактивированная эмульсионная, содержащая активное вещество в виде антигенного материала из штамма A/Chicken/Jalisco/14589-660/94 (H5N2) вируса ГП, полученного в 10-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью 7,7 lg ЭЛД₅₀/0,1 мл и ГА-активностью 1:48, очищенного от балластных примесей и инактивированного с помощью 2-бромэтиламина гидробромида, взятого в количестве 3 mM, и целевую добавку в виде масляного адъюванта в соотношении 1:4 (13).

Известна вакцина против ГП инактивированная эмульсионная, содержащая активное вещество в виде антигенного материала из штамма A/Chicken/Veracruz/28159-398/95 (H5N2) вируса ГП, полученного в 10-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью 8,9 lg ЭЛД₅₀/0,1 мл и ГА-активностью 1:256, очищенного от балластных примесей и инактивированного с помощью 2-бромэтиламина гидробромида, взятого в количестве 3 mM, и целевую добавку в виде масляного адъюванта в соотношении 1:4 (13).

Известна вакцина против ГП инактивированная эмульсионная, содержащая активное вещество в виде антигенного материала из штамма A/Chicken/Puebla/28159-474/95 (H5N2) вируса ГП, полученного в 10-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью 8,7 lg ЭЛД₅₀/0,1 мл и ГА-активностью 1:256, очищенного от балластных примесей и инактивированного с помощью 2-бромэтиламина гидробромида, взятого в количестве 3 mM, и целевую добавку в виде масляного адъюванта в соотношении 1:4 (13).

Известна вакцина против ГП инактивированная эмульсионная, содержащая активное вещество в виде антигенного материала из штамма A/Chicken/Chiapas/28159-488/95 (H5N2) вируса ГП, полученного в 10-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью 7,3 lg ЭЛД₅₀/0,1 мл и ГА-активностью 1:48, очищенного от балластных примесей и инактивированного с помощью 2-бромэтиламина гидробромида, взятого в количестве 3 mM, и целевую добавку в виде масляного адъюванта в соотношении 1:4 (13).

Известна вакцина против ГП инактивированная эмульсионная, содержащая активное вещество в виде антигенного материала из штамма A/Turkey/Minnesota/3689-1551/81 (H5N2) вируса ГП, полученного в 10-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью 8,7 lg ЭЛД₅₀/0,1 мл и ГА-активностью 1:1024, очищенного от балластных примесей и инактивированного с помощью формалина, и целевую добавку в виде масляного адъюванта в эффективном соотношении (14).

Известна вакцина против ГП инактивированная эмульсионная, содержащая активное вещество в виде антигенного материала из штамма A/Duck/Singapore/F119/97 (H5N3) вируса ГП, полученного в 10-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью 8,1 lg ЭЛД₅₀/0,1 мл и ГА-активностью 1:128, очищенного от балластных примесей и инактивированного с помощью 2-бромэтиламина гидробромида, взятого в количестве 3 mM, и целевую добавку в виде масляного адъюванта в соотношении 1:4 (14).

Известна вакцина против ГП инактивированная эмульсионная, содержащая активное вещество в виде очищенного и авирулентного антигенного материала из штамма A/Hong Kong/156/97 (H5N1) вируса ГП, полученного в чувствительной биологической системе, и целевую добавку в виде масляного адъюванта в эффективном соотношении (14).

Известна вакцина против ГП инактивированная эмульсионная, содержащая активное вещество в виде очищенного и авирулентного антигенного материала из штамма A/Hong Kong/483/97 (H5N1) вируса ГП, полученного в чувствительной биологической системе, и целевую добавку в виде масляного адъюванта в эффективном соотношении (14).

Известна вакцина против ГП инактивированная эмульсионная, содержащая активное вещество в виде очищенного и авирулентного антигенного материала из штамма A/Duck/Potsdam/1402/86 (H5N2) вируса ГП, полученного в чувствительной биологической системе, и целевую добавку в виде масляного адъюванта в эффективном соотношении (15).

Известна вакцина против ГП инактивированная эмульсионная, содержащая активное вещество в виде очищенного и авирулентного антигенного материала из штамма A/Duck/Potsdam/2243/84 (H5N6) вируса ГП, полученного в чувствительной биологической системе, и целевую добавку в виде масляного адъюванта в эффективном соотношении (15).

Известна вакцина против ГП инактивированная эмульсионная, содержащая активное вещество в виде очищенного и авирулентного антигенного материала из штамма A/CK/Italy/473/99 (H7N1) вируса ГП, полученного в чувствительной биологической системе, и целевую добавку в виде масляного адъюванта в эффективном соотношении (15).

Известна вакцина против ГП инактивированная эмульсионная, содержащая активное вещество в виде очищенного и авирулентного антигенного материала из штамма A/Duck/Potsdam/15/80 (H7N7) вируса ГП, полученного в чувствительной биологической системе, и целевую добавку в виде масляного адъюванта в эффективном соотношении (15).

Известна вакцина против ГП инактивированная эмульсионная, содержащая активное вещество в виде очищенного и авирулентного антигенного материала из штамма А/СК/ИАЕ/415/99 вируса ГП, полученного в чувствительной биологической системе, и целевую добавку в виде масляного адъюванта в эффективном соотношении (15).

Наиболее близкой предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является вакцина против ГП инактивированная эмульсионная, содержащая активное вещество в виде очищенного и авирулентного антигенного материала из штамма A/Hong Kong/483/97 (H5N1) вируса ГП, полученного в чувствительной биологической системе, и целевую добавку виде масляного адъюванта в эффективном соотношении (14).

Задача, на решение которой направлено настоящее изобретение, заключается в расширении арсенала вакцин против гриппа птиц инактивированных эмульсионных, обладающих высокой антигенной и иммуногенной активностью, обеспечивающих эффективную защиту домашней птиц против вируса ГП типа А (H5N1) и предотвращающих выделение вакцинированной птицей возбудителя инфекции в окружающую среду.

Указанная задача решена созданием вакцины против ГП инактивированной эмульсионной, охарактеризованной следующей совокупностью признаков.

Предлагаемая вакцина содержит активное вещество в виде очищенного и авирулентного антигенного материала из штамма «Новосибирский» (авторское наименование) ГП типа А, подтипа H5N1, полученного в 10-12-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью не менее 9,0 lg ЭЛД₅₀/мл и ГА-активностью не менее 1:64, и целевую добавку в виде масляного адъюванта в соотношении, мас.%, 30:70-40:60.

Для изготовления вакцины в качестве чувствительной биологической системы используют 10-12-суточные эмбрионы SPF-кур. Экстраэмбриональную жидкость (ЭЭЖ) очищают от балластных примесей центрифугированием при 1000 об/мин в течение 10-15 мин. После центрифугирования вирусный материал сливают в 10-20-литровые бутыли и подвергают инактивации. Перед инактивацией инфекционная активность вируса должна быть не ниже 9,0 lg ЭЛД₅₀/мл, а ГА-активность не ниже 1:64.

Для инактивации вируса используют аминоэтилэтиленимин (АЭЭИ), формальдегид или бета-пропиолактон (16).

АЭЭИ добавляют в вируссодержащую суспензию при перемешивании в виде 10%-ного раствора до конечной концентрации 0,05-0,1%, формальдегид - до конечной концентрации 1:1000, а бета-пропиолактон до конечной концентрации 1:2000-1:4000. Инактивацию вируса проводят в течение 24 часов при температуре от 20 до 37°С. По окончании инактивации АЭЭИ нейтрализуют внесением тиосульфата натрия в суспензию антигенного материала.

После контроля на стерильность и авирулентность антиген подвергают повторной очистке от балластных примесей, пропуская его через промежуточную центрифугу ОТР-102К-01 при 15000-17000 об/мин со скоростью подачи антигена 40-50 л/час и фильтровальную установку.

Очищенный и авирулентный антигенный материал должен иметь ГА-активность не менее 1:64 и рН в пределах 7,2-7,4.

Эмульсионную вакцину получают путем диспергирования очищенного и авирулентного антигенного материала с масляным адъювантом в соотношении 30:70-40:60 по весу.

Из адъювантов целесообразно использовать масляный адъювант на основе минерального масла «Marcol-52» и эмульгаторов-неиногенных поверхностно-активных веществ (алкилмодифицированный полиоксиалкилен-силоксановый сополимер - АПС и ланолин) или коммерческий масляный адъювант марки Montanide ISA-70 производства фирмы «Seppic» (Франция).

Содержание антигенного материала и масляного адъюванта в прививной дозе вакцины в соотношении, мас.%, 30:70-40:60 является оптимальным, так как обеспечивает толерантную презентацию антигена в организме иммунизированной птицы.

Полученная вакцина представляет собой однородную эмульсию белого цвета типа «вода в масле». Допускается в верхней части флакона наличие слоя масляного адъюванта. При интенсивном встряхивании однородность содержимого легко восстанавливается.

Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые испрашивается правовая охрана:

1. Вакцина против ГП инактивированная эмульсионная.

2. Активное вещество в виде очищенного и авирулентного антигенного материала из штамма «Новосибирский» вируса ГП типа А, подтипа H5N1 в эффективном количестве.

3. Целевая добавка.

Признаками изобретения, характеризующими предлагаемую вакцину и совпадающими с признаками прототипа, в том числе родовое понятие, отражающее назначение, являются:

1. Вакцина против ГП инактивированная эмульсионная.

2. Активное вещество.

3. Целевая добавка.

По сравнению с вакциной-прототипом существенным отличительным признаком предлагаемого изобретения является то, что в качестве активного вещества она содержит очищенный и авирулентный антигенный материал из штамма «Новосибирский» вируса ГП типа А, подтипа H5N1 в эффективном количестве.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:

1. Очищенный и авирулентный антигенный материал из штамма «Новосибирский» вируса ГП типа А, подтипа H5N1, полученный в 10-12-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью не менее 9,0 lg ЭЛД₅₀/мл и ГА-активностью не менее 1:64.

2. Очищенный и авирулентный антигенный материал из штамма «Новосибирский» вируса ГП типа А, подтипа H5N1, полученный в 10-12-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью не менее 9,0 lg ЭЛД₅₀/мл и ГА-активностью не менее 1:64, в количестве 30,0-40,0 мас.%.

3. В качестве целевой добавки вакцина содержит масляный адъювант.

4. Вакцина содержит масляный адъювант в количестве, обеспечивающем толерантную презентацию антигена в организме иммунизированной птицы.

5. Вакцина содержит масляный адъювант в количестве 60,0-70,0 мас.%.

6. Вакцина содержит очищенный и авирулентный антигенный материал из штамма «Новосибирский» вируса ГП типа А, подтипа H5N1 и масляный адъювант в соотношении, мас.%:

Антигенный материал	30,0-40,0
Масляный адъювант	До 100,0

Результаты проведенных испытаний показали, что предлагаемая вакцина обладает высокой антигенной и иммуногенной активностью и обеспечивает надежную защиту домашней птицы против вируса ГП типа А, подтипа H5N1, а также предотвращает выделение вакцинированной птицей возбудителя инфекции в окружающую среду.

Достижение указанного результата от использования изобретения объясняется тем, что в состав предлагаемой вакцины введен в качестве активного вещества антигенный материал из штамма «Новосибирский» вируса ГП типа А, подтипа H5N1, обладающего высокой инфекционной, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и сохраняющего антигенную и иммуногенную активностью после инактивации, обеспечивая тем самым получение вакцины против ГП типа А, подтипа H5N1, создающей эффективную защиту домашней птицы против гомологичного вируса и предотвращающей выделение вакцинированной птицей возбудителя инфекции в окружающую среду.

Штамм «Новосибирский» вируса ГП типа А, подтипа H5N1 депонирован 12 апреля 2006 г. во Всероссийскую государственную коллекцию штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, Федерального государственного учреждения «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ «ВГНКИ») под регистрационным номером (ссылкой) - производственный штамм «ВНИИЗЖ» №125-ДЕП «Новосибирский» вируса ГП типа А, подтипа H5N1.

По сравнению с исходным изолятом штамм «Новосибирский» вируса ГП типа А, подтипа H5N1 имеет генетические и фенотипические особенности. Он клонирован в культуре MDCK, при размножении в куриных эмбрионах обладает высокой вирулентностью и сохраняет антигенную силу после инактивации. Экспериментально подтверждена возможность его использования для приготовления инактивированных вакцинных препаратов.

Штамм «Новосибирский» вируса ГП характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические признаки

Штамм «Новосибирский» вируса ГП относится к семейству Orthomyxoviridae, серотипу А, подтипу H5N1 и обладает морфологическими признаками, характерными для вируса гриппа типа А.

Вирионы вируса гриппа - оболочечные, плеоморфные. Диаметр сфероподобных частиц 50-120 нм; филаментовидные частицы около 20 нм в диаметре, длиной 200-300 нм и более. На поверхности вириона, возвышаясь над липидной мембраной на 10-14 нм, находятся около 500 шипообразных выступов (спайков), образованных гомотримерами ГА.

В промежутках между кластерами спайков у вирусов типа А размещаются, как правило, около 100 молекул НА.

Липидная мембрана окружает петлеобразные филаменты нуклеокапсидов с восемью фрагментами вирусного генома, каждый из которых представлен линейной одноцепочечной антисмысловой РНК.

Общая длина генома составляет около 13600 нуклеотидов (нт). Наиболее крупный фрагмент (№1) содержит около 2350 нт; №2 - чуть менее 2350 нт; №3 - как правило, 2250 нт; №4 - 1780 нт; №5 - 1575 нт; №6 - 1420 нт; №7 - 1050 нт; №8 - 900 нт.

На обоих концах каждой геномной цепи РНК содержатся повторяющиеся отрезки, причем повторы 5′-концевого участка (у вирусов типа А они имеют вид 5′-AGUAGAAACAAGG) комплементарны инвертированным повторам, расположенным на 3′-конце. Кроме того, 3′-концевые участки некоторых фрагментов генома содержат консервативные отрезки, типичные для вирусных штаммов, поражающих субъектов определенного биологического вида [ICTV-Intemational Committee on Taxonomy of Viruses (2006). http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ICTVdb/ICTVdB/].

Антигенные свойства

По своим антигенным свойствам штамм «Новосибирский» вируса гриппа птиц относится к типу А, подтипу H5N1.

Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой.

Инактивированный вирус индуцирует антитела, выявляемые методами РТГА, РН и ИФА. Так, через 12 дней после однократной иммунизации цыплят предлагаемой вакциной титр антител к ГА, обеспечивающих реакцию торможения гемагглютинации, составил 5,0 log₂; титр антител, определяемых методом ИФА, равнялся 1:1243, преципитирующие антитела обнаруживались при разведении исследуемых сывороток от 1:2 до 1:4.

Определение и сравнительный анализ первичной структуры амплифицированных фрагментов кДНК показал, что исследованная проба содержала фрагменты генома полевых изолятов вируса гриппа птиц. Первичная структура сайта разрезания белка НА изолята имела вид PQGRERRRKKR*GLF, что свидетельствует о том, что он относится к группе высокопатогенных штаммов вируса ГП.

Проведено сравнение полученных последовательностей с последовательностями гена ГА типа Н5 и гена НА типа N1 из банка данных «Flu. The Influenza Sequence Database» (http://www.flu.lanl.gov/). Показано, что ГА выделенного изолята принадлежит к подтипу Н5, а НА к подтипу N1 обширной линии высокопатогенных изолятов ГП A/Goose/Guandong/1/96 (H5N1), выделенных на территории Юго-Восточной Азии, включая Индонезию и Китай, в период с 1996 г. и по настоящее время.

Биотехнологические характеристики

Штамм «Новосибирский» проявляет высокую биологическую, антигенную и иммуногенную активность как в нативном виде, так и после инактивации. Штамм предназначен для получения диагностических сывороток и антигенных препаратов, а также для изготовления инактивированной вакцины против вируса ГП.

Штамм «Новосибирский» вируса ГП типа А, подтипа H5N1 репродуцируется в 10-12-суточных эмбрионах кур при температуре 37,0±0,5°С и влажности 50-70%. Заражающая доза в пределах от 1 до 4,0 lg ЭЛД₅₀ вызывает специфическую гибель КЭ, ограниченную временным промежутком от 24 до 48 часов инкубирования. В течение указанного промежутка времени вирус накапливается в титрах от 9,0 до 10,2 lg ЭЛД₅₀/мл. Такой урожай позволяет с использованием одного куриного эмбриона получить материал для 50-70 прививных доз вакцины. Штамм «Новосибирский» вируса гриппа птиц является стабильным, обладает высокой вирулентностью и адаптирован к размножению в эмбрионах кур.

Хемо- и генотаксономическая характеристика

Геном штамма «Новосибирский» вируса ГП состоит из восьми неодинаковых по размеру (900-2350 нуклеотидов) фрагментов односпиральной минус-РНК, суммарная длина которых составляет около 14 тыс. нуклеотидов с молекулярной массой 4,5 МД. Вирионная РНК не обладает инфекционностью. В вирионах обнаружено 10 белков. Белки делятся на поверхностные (ГА, НА, М2) и внутренние (РВ1, РВ2, PA, NP, M1, NS1, NS2).

ГА и НА имеют важнейшие антигенные сайты, на которые вырабатывается защитный иммунитет, в первую очередь в виде нейтрализующих антител.

Физические свойства

Молекулярная масса вирионов составляет 250МД, плавучая плотность в сахарозе 1,19 г/см³, коэффициент седиментации вирионов 700-800 S 20w.

Устойчивость к внешним факторам

Штамм «Новосибирский» вируса ГП чувствителен к детергентам, формальдегиду, бета-пропиолактону, производным азиридина, быстро инактивируется при прогревании (56°С), ультрафиолетовом облучении и при рН ниже 5,0.

Дополнительные признаки и свойства

Иммуногенная активность - иммуногенен в составе инактивированной вакцины.

Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает. Иммунизация цыплят дозой, в два раза превышающей прививную, не вызывает видимых клинических изменений в общем состоянии птицы, а также локальных поражений ткани в месте введения.

Патогенность - высокая (внутривенный индекс 2,87, что соответствует высокопатогенным штаммам вируса ГП).

Вирулентность - 100% гибель внутримышечно зараженных цыплят в дозе 10^6,0 ЭЛД₅₀.

Онкогенность - отсутствует.

Контагиозность - контагиозен. Неиммунные цыплята заражаются при совместном содержании с зараженными.

Стабильность штамма отмечена при проведении пяти последовательных пассажей на чувствительных цыплятах.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его осуществления и использования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1.

Для изготовления вакцины против ГП инактивированной эмульсионной используют вирусный материал штамма «Новосибирский», полученный культивированием в эмбрионах кур. Посевной вирус первого порядка (матровая расплодка вируса) хранится в лиофилизованном состоянии в герметически закрытых флаконах в темном месте при температуре не выше -40°С и не более 12 месяцев со дня изготовления.

Для получения посевного вируса второго порядка содержимое трех флаконов разводят стерильным фосфатно-буферным раствором (ФБР), содержащим 500 ЕД/пенициллина и 500 мкг/см³ стрептомицина, при значении рН 7,2-7,4 с таким расчетом, чтобы в дозе вируса объемом 0,2 мл, предназначенной для заражения одного эмбриона SPF-кур, содержалось не менее 2,0 lg ЭЛД₅₀ вируса. После заражения куриные эмбрионы инкубируют 24-48 часов при 37±0,5°С и относительной влажности 60-70%. Овоскопирование зараженных эмбрионов проводят до 24-часового срока инкубации однократно, а далее через каждые 5 часов. Эмбрионы погибают через 24-48 часов. Эмбрионы, погибшие раньше 24 часов, выбраковывают, а остальные используют в качестве посевного вируса. В стерильных условиях от каждых 5-7 эмбрионов отбирают ЭЭЖ в отдельную стерильную емкость, плотно закрывающуюся. Содержимое каждой емкости проверяют на предмет бактериального загрязнения и контаминации грибами. После проведения контроля стерильный вируссодержащий материал сливают в один сосуд и фасуют в стерильные пенициллиновые флаконы, закрывают стерильными резиновыми пробками, заливают парафином и хранят при температуре не выше минус 40°С.

Содержимое одного из флаконов используют для определения содержания антигена, идентичности вирусного сырья и биологической активности вируса.

Посевной вирус считается пригодным для заражения производственной партии эмбрионов, если вирус идентифицирован, ГА-активность не ниже 1:64, инфекционная активность не ниже 9,0 lg ЭЛД₅₀/мл.

Посевной вирус хранят при температуре не выше минус 30°С в течение не более 4-6 месяцев, не допуская даже однократного его оттаивания.

Для получения производственной расплодки посевной вирус размораживают при температуре 18-24°С в стерильных условиях, вскрывают флакон и его содержимое центрифугируют при 2500 об/мин в течение 10 минут. Надосадочную жидкость отбирают, разводят стерильным физиологическим раствором рН 7,0-7,4 из расчета 1000-10000 ЭЛД₅₀/мл, добавляют 500 мкг стрептомицина и 500 ЕД пенициллина на 1 мл материала. Приготовленный таким образом вируссодержащий материал используют для заражения куриных эмбрионов. Куриные эмбрионы в возрасте 10-12-суток заражают в аллантоисную полость вируссодержащим материалом в объеме 0,2 мл. Зараженные эмбрионы помещают в термостат при температуре 37,0±0,5°С и относительной влажности воздуха 50-70%. Овоскопию зараженных эмбрионов проводят ежедневно 2 раза в сутки.

Эмбрионы погибают через 24-48 часов. По окончании инкубации эмбрионы помещают в холодильные камеры при температуре 2-6°С на 6-18 часов с тем, чтобы при вскрытии исключить попадание эритроцитов в аллантоисно-эмбриональную жидкость. Охлажденные эмбрионы вскрывают. ЭЭЖ от каждых 20-30 эмбрионов собирают в стерильные флаконы вместимостью 200-500 мл. В стерильные флаконы перед сбором ЭЭЖ добавляют бензилпенициллина натриевую соль 200 ЕД/мл и стрептомицина сульфат 200 мкг/мл. Контакт ЭЭЖ с антибиотиками проводят в течение 2 часов при температуре 24±6°С.

Полученную ЭЭЖ центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10-15 мин для удаления эритроцитов. После центрифугирования вирусный материал сливают в 15-20-литровые бутыли и передают на инактивацию. Из каждой бутыли берут пробу в количестве 1 мл для определения титра ГА и инфекционной активности вируса ГП.

Инфекционная активность вируссодержащего материала, идущего на составление серии вакцины, должна быть не ниже 9,0 lg ЭЛД₅₀/мл, а ГА-активность не ниже 1:64.

Инактивацию вируса ГП проводят рабочим раствором АЭЭИ, формальдегида или бета-пропиолактона.

Вирусную суспензию нагревают до комнатной температуры или до температуры 37°С в зависимости от используемого инактиванта. При перемешивании в суспензию добавляют 10%-ный раствор АЭЭИ до конечной концентрации 0,05-0,1% или формальдегида до конечной концентрации 1/1000, или бета-пропиолактона до конечной концентрации 1/2000-1/4000.

Дополнительно в суспензию вносят мертиолят из расчета 1/10000 и бензилпенициллина натриевую соль или какой-либо другой антибиотик, выбранный по подтитровке, в количестве 500 ЕД/мл.

После добавления инактиванта смесь перемешивают в течение 20-30 минут. Инактивацию вируса проводят в течение 24 часов и при температуре 37±0,5°С. По окончании инактивации АЭЭИ нейтрализуют добавлением тиосульфата натрия в суспензию антигенного материала. После проведения контроля на стерильность и авирулентность антигенный материал подвергают повторной очистке от балластных примесей, пропуская его через проточную центрифугу ОТР-102К-01 при 15000-17000 об/мин со скоростью подачи жидкости 40-50 л/час и фильтровальную установку.

Очищенный и авирулентный антигенный материал должен иметь ГА-активность не менее 1:64 и рН в пределах 7,2-7,4.

Эмульсионную вакцину получают путем диспергирования очищенного и авирулентного антигенного материала с масляным адъювантом в соотношении, мас.%, 30:70-40:60.

Из адъювантов целесообразно использовать масляный адъювант на основе минерального масла «Marcol-52» и эмульгаторов неионогенных поверхностно-активных веществ (алкилмодифицированный полиоксиалкиленсилоксановый сополимер - АПС и ланолин) или коммерческий масляный адъювант марки Montanide ISA-70 производства фирмы «Seppic» (Франция).

Изготовление вакцины проводят в две стадии: получения предэмульсии и получения эмульсии. На стадии получения предэмульсии в реактор со стерильным масляным адъювантом при включенной мешалке (250-300 об/мин) подают необходимый объем антигенного материала со скоростью 100-120 л/час. После подачи антигена в масляный адъювант смесь перемешивают с той же скоростью в течение 60-90 мин, поддерживая температуру смеси в пределах 12-16°С.

На стадии получения эмульсии включают гомогенизатор «Silverson-450 LS» и проводят эмульгирование смеси в течение 3 часов. Мешалка при этом отключена.

Учитывая термолабильность вирусного антигена, процесс эмульгирования проводят при температуре 12-16°С.

После окончания эмульгирования из реактора отбирают пробу вакцины, выдерживают ее в течение суток и проводят контроль физических параметров эмульсии: тип эмульсии, вязкость и стабильность. Вакцина с положительной характеристикой качества поступает на фасовку. Фасовку и укупорку вакцины во флаконы проводят автоматически на разливочном автомате и автомате закатки, находящихся под ламинарным потоком.

Полученную вакцину контролируют на соответствие показателям, установленным стандартом организации.

Пример 2.

Проведены испытания иммуногенной активности вакцины против ГП инактивированной эмульсионной (серия №1), изготовленной так, как описано в примере 1, и содержащей, мас.%:

Очищенный и авирулентный антигенный материал
из штамма «Новосибирский» вируса ГП типа А, подтипа H5N1,
полученного в 10-12-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной
активностью 9,1 lg ЭЛД50/мл и ГА-активностью 1:1024	30,0
Масляный адъювант	70,0

Для этого полученной вакциной иммунизировали 5 цыплят в возрасте 50 суток внутримышечно в область грудной группы мышц в объеме 0,5 мл. Через 16 суток после иммунизации цыплят заражали гомологичным штаммом вируса ГП в дозе 6,0 lg ЭЛД₅₀ внутримышечно. Иммунизированных цыплят (гр. №1) содержали в одной клетке с контрольной группой цыплят (гр. №2), состоящей из незараженных и невакцинированных цыплят.

Через 60 часов в клетку подсадили цыплят второй контрольной группы (гр. №3), состоящую из зараженных цыплят (положительный контроль).

Результаты наблюдения с 12-часовым интервалом за цыплятами опытных групп с фиксацией видимых клинических признаков болезни представлены в таблице 1 (эту и все последующие таблицы см. в конце описания).

Данные таблицы 1 позволяют сделать ряд выводов:

1. Неиммунные и зараженные вир