Медицинская повязка, содержащая комплекс ферментов из гепатопанкреаса краба, и способ ее получения

Медицинская повязка, содержащая комплекс ферментов из гепатопанкреаса краба, и способ ее получения

Реферат

Изобретение относится к медицине, конкретно к медицинским повязкам, содержащим ферменты, в частности, вызывающие гидролиз белков коллагена и эластина.

Медицинские повязки, содержащие ферменты, широко известны. Например, в заявке Великобритании №2240040 речь идет о медицинской повязке из частично окисленного целлюлозосодержащего материала в форме марли, к которому химическими связями присоединены ферменты, обладающие протеолитической, коллагенолитической и/или бактериолитической активностью.

В патенте Российской Федерации №2127128 описан способ получения повязки, который заключается в смешении раствора коллагена с комплексом протеолитических ферментов, выделяемых из гепатопанкреаса камчатского краба и обладающих коллагенолитической активностью, с последующим воздействием газообразным формальдегидом. К недостаткам способа можно отнести то обстоятельство, что смешение фермента с его субстратом (т.е. коллагенолитик с коллагеном) вынуждает очень строго контролировать рН и температуру; кроме того, формальдегид, следы которого неизбежно присутствуют в повязке, обладает канцерогенным действием в отношении слизистых оболочек носа и, возможно, раны.

В выбранной в качестве ближайшего аналога-прототипа медицинской повязке согласно патенту Российской Федерации №2003111997 А содержится комплекс протеолитических ферментов, включая коллагенолитические протеазы из гепатопанкреаса краба. В качестве основы выбрана целлюлоза, модифицированная химическим путем - частично окисленная целлюлоза, содержащая альдегидные группы. К недостаткам такой повязки можно отнести то обстоятельство, что в процессе хранения быстро теряется ферментативная активность (в течение 1 года), ферменты с окисленной целлюлозы быстро переходят в раневое содержимое (в течение 2 часов) и катастрофически падают механические свойства носителя («Журнал химические волокна, 2007, №3»).

Цель изобретения заключается в создании медицинской повязки, лишенной указанных выше недостатков и обладающей биоцидными свойствами (за счет введения хитозана) и расширенными терапевтическими возможностями.

Поставленная цель достигнута благодаря тому, что в медицинской повязке, включающей основу в виде производного целлюлозы, содержащего хитозан и протеолитические ферменты, в качестве основы выбрана частично окисленная перйодатом целлюлоза со степенью окисления 0,01-2,5 мгЭкв/г, а в качестве протеолитических ферментов выбран комплекс ферментов из гепатопанкреаса краба, обладающий протеолитической, эластолитической и коллагенолитической активностями.

Заявлен также способ получения такой повязки, включающий

- частичное окисление целлюлозы в виде медицинской марли до содержания альдегидных групп 0,01÷2,5 мгЭкв/г (использование частично окисленной целлюлозы с содержанием альдегидных групп более 2,5 мгЭкв/г или более 4% ведет к катастрофическому ухудшению механических свойств перевязочного материала, особенно после иммобилизации протеолитического комплекса и в процессе хранения);

- обработку полученного модифицированного носителя раствором хитозана, в концентрации 0,05-0,5% и модуле ванны 5;

- приготовление раствора ферментов гепатопанкреаса в концентрации 0,1÷0,5 мг/мл;

- введение полученного раствора ферментов при модуле ванны 7÷10 во взаимодействие с частично окисленной и модифицированной хитозаном целлюлозой в течение 0,5-1 часа при температуре 15÷25°С и рН 4,5÷8,5;

- отделение модифицированным белком материала, промывку буферным раствором для удаления физически адсорбированных белка и сушку до постоянной массы.

Известно, что коллагенолитические ферменты различного происхождения значительно отличаются друг от друга по субстратной специфичности, причем коллагенолитические протеазы принадлежат к суперсемейству сериновых протеиназ.

Протеазы из гепатопанкреаса имеют низкие изоэлектрические точки (ниже 3,5) (Biochemistry, 1973, vol.12, p.1814-1822). Используемые обычно модифицированные текстильные носители также имеют отрицательный заряд, что приводит к быстрому и легкому вымыванию иммобилизованного белка с носителя, низкому содержанию ферментов на матрице после иммобилизации и, как следствие, низкому значению ферментативной активности. Степень извлечения ферментов из раствора в лучшем случае достигает 20% (отношение ферментативной активности после иммобилизации к ферментативной активности после иммобилизации), а при отмывке сорбированного белка от носителя на матрице остается не более 30% от первоначального количества иммобилизованного белка. С другой стороны, хитозан имеет положительный заряд и легко взаимодействует с диальдегидцеллюлозой, сообщая матрице положительный заряд. При использовании хитозансодержащих матриц весь белок из раствора в течение 1 часа иммобилизуется на матрицу прочной связью. Кроме того, при биодеструкции хитозана в организме за счет эндогенных ферментов образуется гиалуроновая кислота, обладающая мощным ранозаживляющим действием. Общеизвестно, что сам хитозан и его производные обладают биоцидным действием. Иммобилизация ферментов на хитозансодержащих носителях приводит к сдвигу рН-оптимума ферментативной активности препарата в более кислую область - около рН 6,0, что близко рН для гнойно-некротических и ожоговых ран.

Для иммобилизации использовали раствор протеолитического комплекса с рН от 5,0 до 8,5, т.к. использование растворов, имеющих рН ниже 5,0 и выше 8,5, приводит к полной и необратимой инактивации комплекса в процессе иммобилизации, высушивания и хранения; увеличение времени иммобилизации более 1-го часа не ведет к иммобилизации дополнительного количества активного белка, а при иммобилизации менее 0,5 часа основная масса активного комплекса остается в растворе, что ведет к технологическим потерям; при использовании при иммобилизации раствора комплекса с концентрацией менее 0,1 мг/мл образующийся материал имеет ферментативную активность меньше требуемого лечебного значения, особенно в конце срока хранения препарата, а увеличение концентрации комплекса в растворе для иммобилизации более 0,5 мг/мл ведет к значительному перерасходу ферментного препарата; проведение процесса при температуре выше 25°С ведет к инактивации ферментного комплекса, а уменьшение температуры ниже 15°С требует дополнительного оборудования и затрат на охлаждение.

Изобретение детально поясняется следующими примерами своего практического осуществления.

ПРИМЕР 1. Диальдегидцеллюлозу, полученную окислением хлопковой марли IO₄ ^--ионом до содержания альдегидных групп 0,10 мгЭкв/г, обрабатывают в течение 1 часа 0,25% водным раствором хитозана (ТУ 9289-067-00472124-97, производство ЗАО "Биопрогресс" п.Биокомбинат, Моск. обл). Полученный материал высушивают на воздухе. Содержание хитозана 4,0 мг/1 г материала. Готовят 1 л раствора комплекса гепатопанкреаса краба (производство ЗАО " Биопрогресс" п.Биокомбинат, Моск. обл.), содержащего 0,40 г вещества, которым заливают 100 г полученного выше хитозансодержащего материала. Через 0,5 часа материал отжимают от избытка раствора и сушат с получением готового продукта, имеющего следующие характеристики:

- протеолитическая активность по казеину 1,5 ПЕ/г (метод Кунитца);

- триптическая активность по скорости гидролиза этилового эфира бензоиларгинина паранитроанилида 1,50 мкМ/г·мин;

- эластолитическая активность по скорости гидролиза п-нитрофенилового эфира N-бутилоксикарбонил-L-аланина 150 нМ/г·мин;

- активность в отношении гидролиза коллагена 300 ЕД/г (по методу Мандейла).

ПРИМЕР 2. В 1 л 1/15 М фосфатно-калий-натриевого буфера (рН 6,0) растворяют 0,5 г комплекса из гепатопанкреаса краба, которым заливают 100 г диальдегидцеллюлозы, содержащей хитозан (2,5 мг-экв/г альдегидных групп, содержание хитозана 6,0 мг/г); через 1,5 часа продукт отжимают на вальцах и сушат. Полученный продукт обладает следующими характеристиками:

- протеолитическая активность по казеину 0,81 ЕД/г;

- триптическая активность по скорости гидролиза этилового эфира бензоиларгинина паранитроанилида 0,95 мкМ/г·мин;

- эластолитическая активность по скорости гидролиза этилового эфира ацетилтирозина 80 нМ/г·мин;

- активность в отношении гидролиза коллагена 100 ЕД/г (по методу Мандейла).

ПРИМЕР 3. Из материала, полученного согласно примеру 1, нарезают салфетки размером 10×10 см, которые используют в экспериментальных условиях для лечения гнойных ран. Результаты лечения (на 80 белых крысах-самцах линии «Вистар» массой 190±10 г) отражены в таблице, в которой для сравнения приведены данные по лечению ран традиционным способом (с использованием гипертонического раствора-хлорида натрия). Для сравнения с экспериментальными раневыми покрытиями и контроля применяли модифицированную медицинскую марлю - диальдегидцеллюлозу (носитель для иммобилизации) и разработанную ранее НИИ текстильных материалов и внедренную в хирургическую практику салфетку с трипсином "Протеокс-Т" в форме раневого покрытия.

В 1 контрольной группе животных (n=20) заживление ран проходило под струпом. Во 2 контрольной группе (n=20) лечение ран проходило под диальдегидцеллюлозой, смоченной 0,9% раствором гипохлорида натрия. В 3 контрольной группе (n=20) применялось раневое покрытие "Протеокс-Т".

Плоскостную кожно-мышечную рану воспроизводили по методу М.П. Толстых, который заключается в следующем. Крыс вводили в общий лекарственный наркоз путем внутримышечного введения Sol. Ketamini hydrochloridi 0,05% - 0,4 мл и Sol. Relanii 0,2 мл; крепили на препаровочном столике. После предварительной обработки кожи в межлопаточной области иссекали кожно-фасциальный лоскут в виде квадрата 2×2 см (400 мм²). Мышечное дно раны раздавливали зажимом Кохера. Для предупреждения контракции раны за счет эластичности, а также для стандартизации условий лечения к краям раны подшивали пластмассовую рамку, соответствующую размерам раны, с полиэтиленовым «капюшоном» для удержания перевязочного материала на дне и предупреждения высыхания раневой поверхности. Затем рану инфицировали 1 мл суточной взвеси культуры Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa (1 мл взвеси - 10⁸ КОЕ). Через 48 часов развивалась картина гнойного воспаления. С этого времени начинали местное лечение гнойных ран животных. Перевязки выполняли каждый день до полного очищения ран от некротических тканей.

Таблица.Время наступления заживления, дни.
№п/ п	Изучаемые образцы	Количество животных	Очищение ран, средние сроки в сутках	Заживление ран, средние сроки в сутках
1	Животные без лечения (контроль 1)	20	14,2+0,35	27,3+0,15
2	Диальдегидцеллюлоза (контроль 2)	20	13,3+0,6	24,2+0,5
3	Салфетка с трипсином"Протекс-Т"(контроль 3)	20	4,8+0,4	16,2+0,3
4	Аппликации «Мультиферм» Салфетки по примеру 3	20	3,0+0,2	12,1+0,1

1. Медицинская повязка, состоящая из основы в виде производного целлюлозы, содержащего хитозан и комплекс ферментов из гепатопанкреаса краба, отличающаяся тем, что в качестве основы выбрана частично окисленная целлюлоза с содержанием альдегидных групп 0,01-2,5 мгЭкв/г, модифицированная раствором хитозана в концентрации 0,05-0,5%, модуле ванны 7-10.

2. Способ получения медицинской повязки по п.1, включающий взаимодействие модифицированной целлюлозы с протеолитическими ферментами в водном буферном растворе, отличающийся тем, что в качестве модифицированной целлюлозы используют частично окисленную целлюлозу с содержанием альдегидных групп 0,01-2,5 мгЭкв/г, содержащую хитозан и комплекс ферментов из гепатопанкреаса краба, реакцию ведут при рН 5,0-8,5, температуре 15-25°С в течение 0,5-1,0 ч при начальной концентрации комплекса 0,1-0,5 мг/мл и модуле ванны 7-10.