Биокатализатор на основе иммобилизованных клеток фототрофных бактерий для получения водорода

Биокатализатор на основе иммобилизованных клеток фототрофных бактерий для получения водорода

Реферат

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой биокатализатор на основе иммобилизованных клеток фототрофных бактерий, включенных в матрицу гелевого носителя, с помощью которых осуществляют микробиологическое получение водорода. Водород рассматривается как одно из наиболее перспективных, «чистых» синтетических топлив энергетики 21 века [Teplyakov V.V., Gassanova L.G., Sostina E.G., Slepova E.V., Modigell M., Netrusov A.I., Lab-scale bioreactor integrated with active membrane system for hydrogen production: experience and prospects. // Int. J. Hydrogen Energy, V.27, p.1149-1155 (2002)]. Его достоинствами являются:

1) высокая энергоемкость, которая при расчете на единицу массы, позволяет водороду превосходить все известные топлива - природный газ в 2,6 раза, нефть в 3,3 раза, целлюлозу в 8,3 раза [Балашов К.П., Фотокаталитическое преобразование солнечной энергии. // Соросовский образовательный журнал. Т.8, с.58-64 (1998)];

2) фактическая неисчерпаемость источника для получения водорода - воды (молекула воды содержит по массе примерно 10% водорода);

3) высокая эффективность и легкость превращения энергии водорода в любой энергетический вид.

Водород используют в топливных элементах для получения электроэнергии. Он также является сырьем для производства аммиака, метанола, для синтеза метана. Водород активно расходуется при переработке нефти.

Микробиологический способ получения водорода в последние годы привлекает к себе значительное внимание, так как имеет ряд преимуществ перед химическим способом, а именно: микроорганизмы способны использовать различные субстраты, в том числе промышленные отходы, для их конверсии в водород как в аэробных, так и в анаэробных условиях.

Одним из эффективных приемов повышения технологичности процессов является иммобилизация клеток, с использованием в качестве носителей различных материалов.

Использование иммобилизованных клеток позволяет употреблять многократно одни и те же клетки микроорганизмов и, таким образом, избегать необходимости решения проблемы постоянной утилизации накапливающейся биомассы. Кроме того, применение клеток в иммобилизованном виде позволяет повысить их устойчивость к воздействию неблагоприятных факторов (высокие концентрации накапливающегося продукта, изменение рН среды и др.), обеспечить более длительное и эффективное проведение процесса с их участием [ V., Willaert R. Fundamentals of cell immobillisation biotechnology.// Kluwer Academic Publishers, 555 p. (2004)].

Основными характеристиками любого иммобилизованного биокатализатора для получения водорода является его продуктивность и длительность использования. Эти основные характеристики биокатализатора используются для их сравнительного анализа.

На сегодняшний день известен ряд биокатализаторов, разработанных на основе иммобилизованных клеток различных микроорганизмов.

Известен биокатализатор на основе активного ила, имеющего сложный микробиологический состав, который иммобилизуют в смесь альгинатного геля и активированного угля [Wu. S.-Y., Lin С.-Х., Chang J.-S., Lee K.-S., Lin P.-J., Microbial hydrogen production with immobilized sewage sludge. // Biotechnol. Prog. V.18, p.921-926 (2002)]. Согласно способу получения этого биокатализатора, активный ил в количестве 2% (мас.) вносят в смесь 0,3% водного раствора альгината и сюда же добавляют активированный уголь (2% мас). Полученную суспензию по каплям вводят в 0,2 М раствор CaCl₂ для формирования гелевых гранул размером 2,5-3,0 мм. Гранулы выдерживают в данном растворе минимум 2 часа до начала использования.

Полученный биокатализатор способен функционировать не более 10 циклов или 400 ч, так как максимальная длительность одного цикла составляет 40 ч. Исходя из данных авторов этой разработки, максимальная продуктивность биокатализатора составляет 200 мл водорода на 1 л матрицы в час.

Таким образом, сам получаемый биокатализатор характеризуется невысокой продуктивностью и коротким временем работы, несмотря на простоту реализации способа получения данного биокатализатора. При этом необходима сложная система контроля за состоянием биокатализатора, поскольку в основе его лежит активный ил, представляющий собой сложный гетерогенный, с точки зрения биологического состава, объект. К тому же существенным недостатком биокатализатора является то, что он способен эффективно функционировать только на достаточно дорогом субстрате - сахарозе.

Известный биокатализатор на основе клеток бактерий Clostridium butyricum, иммобилизованных в гель агара [Yokio H., Maeda Y., Hirose J., Hayashi S., Takasaki Y., Н₂ production by immobilized cells of Clostridium bytyricum on porous glass beads. // Biotechnol. Techniques., Vol 11, p.431-433 (1997)], получают смешиванием 25 мл суспезии клеток и 60 мл 3% раствора агара при 40°С. После остывания полученной смеси формируют гелевые гранулы размером 3 мм, содержащие иммобилизованные клетки.

Длительность работы такого биокатализатора составляет 5 ч. Согласно данным разработчиков этого биокатализатора максимальная его продуктивность составляет 124,5 мл водорода на 1 л матрицы в час.

Несмотря на простоту технического решения, лежащего в основе получения биокатализатора на основе клеток Clostridium butyricum, иммобилизованных в гель агара, данный биокатализатор имеет основной недостаток, не позволяющий рассматривать возможность его практического применения, - это очень короткое время функционирования. При этом в качестве субстрата используется достаточно высокая концентрация (5-7 г/л) относительно дорогого субстрата - глюкозы. К тому же, согласно данным самих авторов биокатализатора, при проведении процесса получения водорода с его участием отмечается вымывание клеток бактерий из используемого носителя, что приводит к существенному снижению эффективности процесса получения водорода.

Наиболее перспективными продуцентами водорода считаются фототрофные микроорганизмы, поскольку выделение ими водорода связано с поглощением энергии солнца и, следовательно, может повысить эффективность использования солнечной энергии.

Известен биокатализатор, представляющий собой фототрофные бактерии Rhodobacter sphaeroides GL-1, химически иммобилизованные на поверхности матрицы носителя - пористого стекла [Tsygankov A.A., Hirata Y., Miyake M., Asada Y., Miyake J. Photobioreactor with photosynthetic bacteria immobilized on porous glass for hydrogen photoproduction. J. Ferm. Bioengin., V.77, p.575-578 (1994)]. Матрицей служат 4 пластины пористого стекла размером 50×50×0,5 мм³ с порами диаметром 9,8 мкм. Химическую активацию поверхности стекла осуществляют, обрабатывая ее 3-(2-аминометиламинопропил)-триметоксисиланом (LS-2480), который придает ей положительный заряд. Предварительно поверхность стекла обрабатывают 5% раствором К₂Cr₂O₇ в 50% H₂SO₄ в течение 1 ч при 80°С. Затем стеклянную матрицу замачивают в 15% растворе LS-2480 в дихлорметане при комнатной температуре на 2 ч. Трансформированную таким образом поверхность пористого стекла промывают 4 раза по 5 мин дихлорметаном и высушивают при комнатной температуре над осушителем Р₂О₅ в атмосфере аргона. Иммобилизацию клеток Rhodobacter sphaeroides GL-1 проводят путем организации протока суспендированных в дистиллированной воде клеток бактерий вдоль поверхности пластин из пористого стекла в течение 90 минут со скоростью 105 мл/ч. Общий объем матрицы составляет 5 мл.

Стабильная работа такого биокатализатора длится в течение 860 ч, а максимальная продуктивность биокатализатора составляет 3800 мл водорода на 1 л матрицы в час.

Несмотря на высокую продуктивность биокатализатора, получение водорода с его помощью обладает основным недостатком, связанным с тем, что иммобилизованные клетки продуцента водорода слабо удерживаются на носителе, несмотря на химическую активацию с целью обеспечения взаимодействия силановых производных, введенных на поверхность стекла, с функциональными группами различных химических соединений, локализованных на поверхности клетки. В результате при эксплуатации биокатализатора происходит отрыв части иммобилизованных клеток, что отрицательно сказывается на показателях процесса получения водорода в целом, а продуктивность биокатализатора при этом снижается.

Известен биокатализатор, представляющий собой клетки фототрофных бактерий Rhodopseudomonas palustris, иммобилизованные методом включения в гель агара [Vincenzini M., Materassi R., Tredici M., Florenzano G., Hydrogen production by immobilized cells - I. Light dependent dissimilation of organic substances by Rhodopseudomonas palustris // Int. J. Hydrogen Energy, V.7, p.231-236 (1982)]. Согласно способу получения биокатализатора, клетки Rhodopseudomonas palustris 42OL в экспоненциальной фазе роста концентрируют, ресуспендируют в питательной среде и инкубируют в течение 36 часов в атмосфере аргона при 30°С. Далее клетки еще раз центрифугируют и ресуспендируют в фосфатном буфере (0,05 M; pH 7). 0,5 мл полученной суспензии смешивают с 9,5 мл 3% раствора агара. Смесь заливают в емкости объемом 250 мл с резиновыми пробками. После того как смесь застывает, в те же емкости доливают по 10 мл 10 мМ раствора органического субстрата. Систему продувают аргоном в течение 10 мин в анаэробных условиях. В результате получают биокатализатор на основе иммобилизованных клеток фототрофных бактерий, представляющий собой гелевый блок толщиной 3,5 мм.

Полученный биокатализатор способен функционировать в течение 100 ч. Исходя из данных разработчиков биокатализатора расчетная максимальная продуктивность биокатализатора составляет 103,9 мл водорода на л матрицы в час.

Агар, используемый для получения гелевого носителя для иммобилизованных клеток в составе этого биокатализатора, подвержен биодеструкции, что составляет один из его существенных недостатков.

В связи с этим использование носителей на основе синтетических пористых матриц более предпочтительно при создании активных биокатализаторов, предназначенных для длительного использования.

Так, известен биокатализатор, разработанный на основе клеток бактериального штамма Rhodobacter capsulatus, при получении которого используется синтетический полимер, а именно поливиниловый спирт [Кочеткова Н.А., Ефременко Е.Н., Нетрусов А.И. Иммобилизованные клетки фототрофных бактерий для биотехнологического получения водорода.// Всерос. симпозиум с межд. участием «Биотехнология микробов», Москва, Россия, 20-23 октября, 2004, с.48].

Иммобилизация клеток осуществляется посредством включения бактериальных клеток в матрицу криогеля поливинилового спирта. Применение криогеля синтетического полимера, формируемого при замораживании-оттаивании раствора соответствующего полимерного гелеобразователя, обусловлено высокой пористостью гелевой матрицы, обеспечивающей незатрудненную диффузию субстратов и продуктов соответственно к и от иммобилизованных клеток, а также хорошими эксплуатационными характеристиками криогеля на основе поливинилового спирта [Лозинский В.И., Криогели на основе природных и синтетических полимеров: получение, свойства и области применения. // Успехи химии, т.71(6), с.559-585 (2002)].

Полученный биокатализатор способен функционировать в течение 3 месяцев (2160 ч или 90 сут). Максимальная продуктивность биокатализатора составляет 3870 мл водорода на л матрицы в час.

Данное техническое решение как наиболее близкое к заявляемому по типу используемых клеток (фототрофные бактерии) и носителя (криогель поливинилового спирта), а также по методу иммобилизации клеток (включение в гель), используемых для получения биокатализатора, принято за прототип.

Задачей предлагаемого изобретения является получение высокоактивного биокатализатора для синтеза водорода на основе клеток фототрофных бактерий, иммобилизованных в криогель поливинилового спирта, с улучшенной эффективностью действия и способного обеспечить высокий уровень накопления водорода на протяжении длительного времени.

Поставленная задача решается путем создания биокатализатора, где в качестве матрицы для иммобилизованных клеток фототрофных бактерий используют криогель на основе синтетического полимера поливинилового спирта, при следующем соотношении компонентов (мас.%): клетки бактерий - 0,125-0,725 (по сух. массе); поливиниловый спирт (ПВС) - 7,6-10,5; водная фаза - до 100 (к общей массе иммобилизованного биокатализатора).

Получение водорода с помощью предлагаемого биокатализатора на основе иммобилизованных клеток проводят путем его внесения в питательную среду с различными источниками углерода и азота.

Предлагаемый биокатализатор характеризуется длительным периодом функционирования (550 сут.) и способен продуцировать 5530 мл водорода на л матрицы в час.

Состав заявляемого биокатализатора и соотношение компонентов были выбраны на основе проведенных экспериментов с использованием клеток различных фототрофных бактерий и являются отличительной характеристикой заявляемого биокатализатора, так как обеспечивают максимально высокие его характеристики по стабильности функционирования и продуктивности по водороду.

Существенным отличием заявляемого изобретения является новый, ранее неизвестный состав биокатализатора и сочетание его компонентов, а именно различных фототрофных бактерий и криогеля поливинилового спирта, формируемого в присутствии клеток при получении биокатализатора, предназначенного для получения водорода с высоким выходом, которое ранее известно не было.

Собственно получение водорода с помощью биокатализатора на основе иммобилизованных клеток состоит в том, что биокатализатор вносится в реактор, где при рН 7,0-7,4 проводится процесс микробной конверсии субстрата(ов) в водород.

Ниже приводятся конкретные примеры реализации заявляемого технического решения.

Пример 1. Биокатализатор на основе иммобилизованных клеток Rhodospirillum rubrum 2R, включенных в криогель поливинилового спирта.

8,4 г биомассы клеток фототрофных бактерий Rhodospirillum rubrum 2R, полученной после центрифугирования (20 мин, 8000 об/мин), смешивают с 167,6 г 8%-ного раствора поливинилового спирта, приготовленного на основе физиологического раствора (0,9% NaCl), при комнатной температуре до получения однородной массы. Эту суспензию далее используют для получения гранул иммобилизованного биокатализатора. Гранулирование проводят следующим образом: полученную суспензию распределяют с помощью дозирующего устройства (шприц, дозатор и др.) в лунки иммунологических 96-луночных планшетов по 0,2 мл. Замораживание осуществляют при -22°С, продолжительность выдерживания в замороженном состоянии - 17 ч, оттаивание проводят при +2°С. Получают биокатализатор с цилиндрической формой гранул, имеющий следующий состав (мас.%): биомасса клеток бактерий - 0,48 (по сух. массе); ПВС - 7,6; водная фаза - до 100.

Для получения водорода гранулы биокатализатора помещают в реактор объемом 1 л с периодическим режимом культивирования при непрерывном перемешивании среды. Культивирование проводят при 28°С, основным органическим субстратом является глюкоза.

Полученный биокатализатор способен функционировать 6100 ч (254 сут). Максимальная продуктивность данного биокатализатора составляет 3870,5 мл водорода на л матрицы в час.

Пример 2. Биокатализатор на основе клеток Rhodobacter sphaeroides 2R, включенных в криогель ПВС, для получения водорода.

4,3 г биомассы клеток фототрофных бактерий Rhodobacter sphaeroides 2R, полученной после центрифугирования (10 мин, 10000 об/мин), перемешивают с 171,7 г 10%-ного раствора поливинилового спирта, приготовленного на основе 100 мМ Na-фосфатного буфера (рН 6,8), при комнатной температуре до получения однородной массы. Полученную смесь выливают ровным слоем на противень с бортами высотой 3 см для получения гелевых блоков высотой 0,5 см, замораживают при -15°С, выдерживают в замороженном состоянии 15 ч, оттаивают при +10°С и, таким образом, получают биокатализатор, имеющий следующий состав (мас.%): биомасса клеток бактерий - 0,24 (по сух. массе); ПВС - 9,76; водная фаза - до 100.

Для получения водорода биокатализатор в виде свернутого гелевого листа помещают в биореактор объемом 2,5 л с проточным режимом культивирования при непрерывном перемешивании среды. Культивирование проводят при 30°С, основным органическим субстратом является малат натрия.

Биокатализатор способен функционировать 8110 ч (338 сут). Максимальная продуктивность данного биокатализатора составляет 4200 мл водорода на л матрицы в час.

Пример З. Биокатализатор на основе клеток Rhodobacter capsulatus В10, включенных в криогель ПВС, для получения водорода.

8,4 г биомассы клеток фототрофных бактерий Rhodobacter capsulatus В10, полученной после отделения от культуральной жидкости центрифугированием (30 мин, 7000 об/мин), смешивают с 167,6 г 10%-ного раствора поливинилового спирта, приготовленного на основе дистиллированной воды, при комнатной температуре до получения однородной массы. Полученную суспензию распределяют в иммунологические 96-луночные планшеты по 0,15 мл. Замораживание осуществляют при -18°С, продолжительность выдерживания в замороженном состоянии - 16 ч, оттаивание - при +4°С. Получают биокатализатор с цилиндрической формой гранул, имеющий следующий состав (мас.%): биомасса клеток бактерий - 0,45 (по сух. массе); ПВС - 9,5; водная фаза - до 100.

Для получения водорода гранулы биокатализатора помещают в реактор объемом 0,75 л с периодическим режимом культивирования без перемешивания среды. Культивирование проводят при 30°С, основным органическим субстратом является молочная кислота.

Биокатализатор способен функционировать в таких условиях 13198 ч (550 сут), а максимальная продуктивность данного биокатализатора составляет 5530 мл водорода на л матрицы в час.

Пример 4. Биокатализатор на основе клеток Rhodopseudomonas capsulata, включенных в криогельПВС, для получения водорода.

11 г биомассы клеток фототрофных бактерий Rhodopseudomonas capsulata, полученной после отделения от культуральной жидкости центрифугированием (15 мин, 8500 об/мин), смешивают с 869 г 8%-ного раствора ПВС, приготовленного на основе стерильной водопроводной воды, при комнатной температуре до получения однородной массы. Полученную суспензию распределяют в лунки иммунологических 96-луночных планшетов со сферическим дном по 0,1 мл. Замораживание осуществляют при -20°С, продолжительность выдерживания в замороженном состоянии - 12 ч, оттаивание - при +1°С. Получают биокатализатор со сферической формой гранул, имеющий следующий состав (мас.%): биомасса клеток бактерий - 0,125 (по сух. массе); ПВС - 7,9; водная фаза - до 100.

Для получения водорода гранулы биокатализатора помещают в реактор объемом 2,0 л с непрерывным режимом культивирования без перемешивания среды. Культивирование проводят при 32°С, основным органическим субстратом является лактат натрия.

Биокатализатор способен функционировать в таких условиях 1630 ч (68 сут), а максимальная продуктивность данного биокатализатора составляет 4050 мл водорода на л матрицы в час.

Пример 5. Биокатализатор на основе клеток цианобактерий Gloecapsa alpicola CALU 743, включенных в криогель ПВС, для получения водорода.

23,2 г биомассы клеток фототрофных бактерий Gloecapsa alpicola CALU 743, полученной после отделения от культуральной жидкости центрифугированием (25 мин, 6500 об/мин), смешивают с 456,8 г 8%-ного раствора поливинилового спирта, приготовленного на основе 50 мМ Na-фосфатного буфера (рН 6,8-7,0) при комнатной температуре до получения однородной массы. Полученную суспензию распределяют в прямоугольную металлическую форму с бортами высотой 3 см для получения гелевых блоков высотой 0,3 см. Замораживание осуществляют при -19°С, продолжительность выдерживания в замороженном состоянии - 15 ч, оттаивание - при +3°С. Получают биокатализатор со сферической формой гранул, имеющий следующий состав (мас.%): биомасса клеток бактерий - 0,725 (по сух. массе); ПВС - 7,6; водная фаза - до 100.

Для получения водорода гранулы биокатализатора помещают в реактор объемом 0,5 л с периодическим режимом культивирования без перемешивания среды. Культивирование проводят при 27°С, основным органическим субстратом является цитрат натрия.

Биокатализатор способен функционировать в таких условиях 1440 ч (60 сут), а максимальная продуктивность данного биокатализатора составляет 3950 мл водорода на л матрицы в час.

Пример 6. Биокатализатор на основе клеток Rb. capsulatus В10, включенных в криогель ПВС, для получения водорода.

21,5 г биомассы клеток фототрофных бактерий Rb. capsulatus В10, полученной после отделения от культуральной жидкости центрифугированием (30 мин, 7000 об/мин), смешивают с 428,5 г 10%-ного раствора ПВС, приготовленного на основе среды роста, при комнатной температуре до получения однородной массы. Полученную суспензию распределяют по лункам иммунологических 96-луночных планшетов по 0,2 мл. Замораживание осуществляют при -18°С, продолжительность выдерживания в замороженном состоянии - 16 ч, оттаивание - при +4°С. Получают биокатализатор с цилиндрической формой гранул, имеющий следующий состав (мас.%): биомасса клеток бактерий - 0,5 (по сух. массе); ПВС - 10,5; водная фаза - до 100.

Для получения водорода гранулы биокатализатора помещают в реактор объемом 2,5 л с проточным режимом культивирования и постоянным перемешиванием среды. Культивирование проводят при 32°С, основным органическим субстратом является молочная кислота.

Биокатализатор способен функционировать в таких условиях 2210 ч (92 сут), а максимальная продуктивность данного биокатализатора составляет 3890 мл водорода на л матрицы в час.

Таким образом, такое ранее неизвестное сочетание компонентов биокатализатора, то есть биомасса фототрофных бактерий и криогель ПВС, при заявляемом соотношении компонентов данного биокатализатора приводит к получению биокатализатора, имеющего следующие преимущества по сравнению с аналогами и прототипом.

1. Заявляемый биокатализатор характеризуется существенно увеличенным периодом эксплуатации, в частности в заявляемом изобретении биокатализатор функционирует до 13198 ч (550 сут, Пример 3), что превышает продолжительность использования аналогичных биокатализаторов, представленных в качестве аналогов и прототипа, более чем в 6 раз.

2. Использование в качестве матрицы носителя вязкоупругого нехрупкого материала - полимерного криогеля ПВС, практически не подвергаемого абразивному износу, в отличие от аналогов позволяет применять предлагаемый биокатализатор в реакторах различного типа, в том числе с интенсивным перемешиванием, что существенно ускоряет скорость массообменных биокаталитических процессов.

3. Заявляемый биокатализатор обладает существенно улучшенной продуктивностью, которая превышает ту же характеристику, известную для всех аналогов и прототипа, как минимум в 1,5 раза.

Биокатализатор для получения водорода, содержащий иммобилизованную биомассу фототрофных бактерий, продуцирующих водород, и криогель поливинилового спирта в качестве носителя, отличающийся тем, что биокатализатор имеет следующее соотношение компонентов, мас.%:

клетки бактерий	0,1-3,0
поливиниловый спирт	7,0-15,0
водная фаза	до 100.