Гликоформы фактора vii

Гликоформы фактора vii

Реферат

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к композициям, содержащим фактор VII и другие факторы системы свертывания крови, имеющим измененные конфигурации аспарагинсвязанного гликозилирования.

Предпосылки изобретения

Белки, вовлеченные в систему свертывания, включая, например, фактор VII, фактор VIII, фактор IX, фактор X и белок C, как показано, являются терапевтическими агентами, пригодными для лечения разнообразных патологических состояний. В соответствии с этим существует все возрастающая потребность в препаратах, содержащих эти белки, которые являются фармацевтически приемлемыми и демонстрируют однородную и предсказуемую клиническую эффективность.

Из-за множества недостатков, связанных с использованием плазмы крови человека в качестве источника фармацевтических продуктов, является предпочтительным получение этих белков в рекомбинантных системах. Белки системы свертывания крови, однако, подвергаются множеству ко- и посттрансляционных модификаций, включая, например, аспарагинсвязанное (N-связанное) гликозилирование; O-связанное гликозилирование; и γ-карбоксилирование остатков glu. Эти модификации могут различаться качественно или количественно, когда в качестве хозяев для промышленного получения белков используются гетерологичные клетки. В частности, продуцирование в гетерологичных клетках часто приводит к получению ряда различных гликоформ, которые представляют собой идентичные полипептиды, содержащие различные ковалентно-связанные конфигурации олигосахаридов.

В различных системах различия в конфигурации олигосахаридов терапевтических белков связаны, inter alia, с изменениями в иммуногенности и с клиренсом in vivo. Таким образом, в данной области существует потребность в композициях и способах, которые обеспечивают препараты белков системы свертывания крови, в частности, препараты, содержащие рекомбинантный фактор VII человека, модифицированный фактор VII или полипептиды, родственные фактору VII, которые содержат заданные конфигурации гликоформ.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение относится к препаратам, содержащим полипептиды фактора VII или полипептиды, родственные фактору VII, которые демонстрируют предопределенные конфигурации гликоформ. Как используется здесь, препарат фактора VII или препарат, родственный фактору VII, относится к множеству полипептидов фактора VII или полипептидов, родственных фактору VII, включая варианты и химически модифицированные формы, а также формы, которые активируются протеолитически (например, фактор VIIa), которые выделяются из клетки, в которой они синтезируются. Конфигурация гликоформ относится к распределению в препарате олигосахаридных цепей, имеющих различные конфигурации, которые являются ковалентно-связанными с полипептидами фактора VII или полипептидами, родственными фактору VII.

В одном из аспектов настоящее изобретение предусматривает препарат, содержащий множество полипептидов фактора VII или полипептидов, родственных фактору VII, где полипептиды содержат аспарагинсвязанные олигосахаридные цепи и где выполняется одно или несколько из следующих условий: (i) в пределах примерно 94-100% олигосахаридных цепей содержат, по меньшей мере, один остаток сиаловой кислоты; (ii) в пределах примерно 0-7% олигосахаридных цепей имеют нейтральный заряд; (iii) менее чем примерно 16%, например, в пределах примерно 6-16%, олигосахаридных цепей содержат, по меньшей мере, один конечный остаток галактозы; (iv) менее чем примерно 25%, например, в пределах примерно 6-9%, олигосахаридных цепей, содержат, по меньшей мере, один конечный остаток N-ацетилгалактозамина; или (v) менее чем примерно 30%, например, в пределах примерно 11-23%, олигосахаридных цепей содержат, по меньшей мере, один конечный остаток галактозы или N-ацетилгалактозамина. В некоторых воплощениях в дополнение к одному или нескольким из условий (i)-(v): все остатки сиаловой кислоты в олигосахаридных цепях являются связанными с галактозой посредством связи α2->3; по меньшей мере, некоторые из остатков сиаловой кислоты содержат N-гликолилнейраминовую кислоту (Neu5Gc) в дополнение к N-ацетилнейраминовой кислоте (Neu5Ac); и/или олигосахаридные цепи содержат остатки фукозы, связанные α1->6 с каркасом N-ацетилглюкозамина. В одном из воплощений настоящее изобретение охватывает препарат, содержащий фактор VIIa дикого типа, в котором в пределах примерно 94-100% олигосахаридных цепей содержат, по меньшей мере, один остаток сиаловой кислоты, и все остатки сиаловой кислоты связаны с галактозой посредством связи α2->3. В другом воплощении настоящее изобретение охватывает препарат, содержащий фактор VIIa дикого типа, в котором в пределах примерно 94-100% олигосахаридных цепей содержат, по меньшей мере, один остаток сиаловой кислоты, и по меньшей мере, некоторые из остатков сиаловой кислоты представляют собой N-гликолилнейраминовую кислоту. Еще в одном воплощении настоящее изобретение охватывает препарат, содержащий фактор VIIa дикого типа, в котором в пределах примерно 94-100% олигосахаридных цепей содержат, по меньшей мере, один остаток сиаловой кислоты, и по меньшей мере, некоторые из цепей содержат N-ацетилгалактозамин. Препараты по настоящему изобретению, таким образом, не охватывают фактор VII дикого типа или фактор VIIa, который выделяется из плазмы крови человека и не модифицируется ex vivo путем обработки гликозидазой.

В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает препарат, содержащий множество полипептидов фактора VII или полипептидов, родственных фактору VII, где полипептиды содержат аспарагинсвязанные олигосахаридные цепи и где, по меньшей мере, примерно 2% олигосахаридных цепей содержат, по меньшей мере, одну фукозу, связанную α1->3 с антеннарным остатком N-ацетилглюкозамина (то есть с остатком N-ацетилглюкозамина, который связан β1->2, 4 или 6 с остатком Man). Предпочтительно, по меньшей мере, примерно 5% олигосахаридных цепей содержат, по меньшей мере, один такой антеннарный остаток фукозы; более предпочтительно, по меньшей мере, примерно 10% или 20%; и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, примерно 40%.

Препараты в соответствии с настоящим изобретением могут содержать один или несколько из следующих соединений: фактора VII дикого типа; фактора VII дикого типа, который подвергся химической и/или ферментативной модификации; и вариантов фактора VII, имеющих одно или несколько изменений в аминокислотной последовательности, по отношению к фактору VII дикого типа. Препараты по настоящему изобретению могут быть получены из клеток человека, экспрессирующих фактор VII из эндогенного гена фактора VII, или из клеток, запрограммированных на экспрессию фактора VII или полипептида, родственного фактору VII, из рекомбинантного гена.

В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает препараты, содержащие фактор VII или полипептиды, родственные фактору VII, которые демонстрируют одно или несколько улучшенных функциональных свойств, включая, без ограничения, повышенную стабильность при хранении, биологическую доступность и/или половинное время жизни.

В другом аспекте настоящее изобретение охватывает способы для определения и/или оптимизации конфигурации гликоформ фактора VII и полипептидов, родственных фактору VII, которые осуществляются с помощью стадий:

(a) культивирования клетки, экспрессирующей фактор VII или полипептиды, родственные фактору VII, при первом наборе заданных условий культивирования;

(b) извлечения фактора VII или полипептидов, родственных фактору VII, из культуры, с получением препарата, содержащего полипептиды; и

(c) анализа конфигурации олигосахаридов, связанных с полипептидами, для определения конфигурации гликоформ препарата.

Способы могут дополнительно включать в себя изменение условий культивирования стадии (a) для получения второго набора, заданных условий культивирования; и повторение стадий до тех пор, пока не будет получена желаемая конфигурация гликоформ. Альтернативно, способы могут дополнительно включать в себя химическую или ферментативную обработку препарата для изменения конфигурации олигосахаридов; и повторение стадий до тех пор, пока не будет получена желаемая конфигурация гликоформ. Кроме того, способы могут включать в себя дополнительные стадии, на которых препараты, имеющие заданные конфигурации гликоформ, подвергаются, по меньшей мере, одному исследованию на биологическую активность или иную функциональность (например, фармакокинетический профиль или стабильность) и установлению корреляций между конкретными структурами гликоформ и конкретными профилями биологической активности или функциональности.

В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает способы для получения препарата, содержащего полипептиды фактора VII или полипептиды, родственные фактору VII, имеющие заданную конфигурацию N-связанного гликозилирования. В некоторых воплощениях способы осуществляются путем культивирования клетки, экспрессирующей полипептиды, при условиях, в которых, по меньшей мере, примерно 94% аспарагинсвязанных олигосахаридов, связанных с полипептидами фактора VII или с полипептидами, родственными фактору VII, содержат, по меньшей мере, один остаток сиаловой кислоты, например, один, два, три или четыре остатка сиаловой кислоты. В некоторых воплощениях способы осуществляются путем культивирования клетки, экспрессирующей полипептиды, при условиях, в которых, по меньшей мере, примерно 5% олигосахаридных цепей содержат, по меньшей мере, одну фукозу, связанную α1->3 с антеннарным остатком N-ацетилглюкозамина. В некоторых воплощениях полипептиды фактора VII или полипептиды, родственные фактору VII, в зависимости от их происхождения подвергаются ферментативным обработкам для получения желаемых конфигураций гликоформ.

В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает фармацевтические препараты, содержащие препараты по настоящему изобретению и способы для предотвращения и/или лечения синдромов, которые являются чувствительными к полипептидам фактора VII или к полипептидам, родственным фактору VII. Способы включают в себя введение фармацевтических препаратов пациенту, нуждающемуся в лечении, в условиях, приводящих либо к усилению, либо к ингибированию свертывания крови. В одной серии воплощений препараты фактора VII вводятся, когда является желательным усиление свертывания крови, например, при гемофилии A, гемофилии B, дефиците фактора XI, дефиците фактора VII, тромбоцитопении или болезни фон Виллебранда; при синдромах, сопровождаемых присутствием ингибитора фактора свертываемости; до, во время или после хирургической операции или терапевтического лечения с помощью антикоагулянтов; или после травмы. В другой серии воплощений препараты полипептидов, родственных фактору VII (то есть препараты, имеющие пониженную или модифицированную биологическую активность по отношению к фактору VII дикого типа), вводятся для уменьшения свертывания крови, например, у пациентов, подвергающихся ангиопластике, или у тех, кто страдает глубоким тромбозом вен, легочной эмболией, инсультом, диссеминированным внутрисосудистым свертыванием (DIG), отложением фибрина в легких и почках, связанным с грамотрицательной эндотоксимией, или инфарктом миокарда. В соответствии с настоящим изобретением препараты полипептидов, родственных фактору VII, также могут вводиться, когда является желательным модифицировать, например, уменьшить, внутриклеточную передачу сигнала через путь, опосредуемый тканевым фактором (TF), для лечения таких состояний, например, как острый респираторный дистресс-синдром (ARDS), синдром системной воспалительной реакции (SIRS), синдром гемолитической уремии (HUS), множественный отказ органов (MOF) и тромбоцитопеническая пурпура (TTP).

Подробное описание изобретения

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что препараты белков-коагулянтов, имеющих заданные конфигурации гликоформ, демонстрируют улучшенные функциональные свойства. В соответствии с этим настоящее изобретение относится к способам и композициям, которые обеспечивают получение этих белковых препаратов. В частности, настоящее изобретение относится к препаратам, содержащим полипептиды фактора VII и полипептиды, родственные фактору VII, имеющим конкретные заданные конфигурации аспарагинсвязанных (N-связанных) олигосахаридов. Препараты по настоящему изобретению демонстрируют измененные свойства, включая, без ограничения, улучшенные фармакокинетические свойства и улучшенную клиническую эффективность. Настоящее изобретение также охватывает фармацевтические композиции, которые содержат эти препараты, а также терапевтические способы, которые используют эти препараты.

Полипептиды фактора VII и полипептиды, родственные фактору VII

Настоящее изобретение охватывает полипептиды фактора VII человека, например, такие как те, которые имеют аминокислотную последовательность, описанную в патенте США № 4784950 (фактор VII дикого типа). Как используется здесь, "фактор VII" или "полипептид фактора VII" охватывает фактор VII дикого типа, а также варианты фактора VII, демонстрирующие, по существу, такую же или улучшенную биологическую активность по сравнению с фактором VII дикого типа. Термин "фактор VII" предназначен для того, чтобы охватывать полипептиды фактора VII в их нерасщепленной (зимогенной) форме, а также те, которые обрабатываются протеолитически, с получением соответствующих их биологически активных форм, которые могут быть обозначены как фактор VIIa. Как правило, фактор VII расщепляется между остатками 152 и 153 для получения фактора VIIa.

Как используется здесь, термин "полипептиды, родственные фактору VII" охватывает полипептиды, включая варианты, в которых биологическая активность фактора VIIa значительно изменяется или понижается, если сравнивать с активностью фактора VIIa дикого типа. Эти полипептиды включают в себя, без ограничения, фактор VII или фактор VIIa, которые химически модифицируются, и варианты фактора VII, в которые вводятся конкретные изменения аминокислотной последовательности, которые модифицируют или разрушают биологическую активность полипептида.

Биологическая активность фактора VIIa при свертывании крови происходит от его способности (i) связываться с тканевым фактором (TF) и (ii) катализировать протеолитическое расщепление фактора IX или фактора X с получением активированного фактора IX или X (фактора IXa или Xa, соответственно). Для целей настоящего изобретения биологическая активность фактора VIIa может быть определена количественно, путем измерения способности препарата способствовать свертыванию крови, с использованием плазмы с дефицитом фактора VII и тромбопластина, как описывается, например, в патенте США № 5997864. В этом анализе биологическая активность выражается как уменьшение времени свертывания по сравнению с контрольным образцом и преобразуется в "единицы фактора VII" путем сравнения с хранимым стандартом сыворотки крови человека, содержащим 1 единицу/мл активности фактора VII. Альтернативно, биологическая активность фактора VIIa может быть определена количественно путем (i) измерения способности фактора VIIa продуцировать фактор Xa в системе, содержащей TF, включенный в липидную мембрану, и фактор X. (Persson et al., J. Biol. Chem. 272:19919-19924, 1997); (ii) измерения гидролиза фактора X в водной системе (см. пример 5, ниже); (iii) измерения его физического связывания с TF, используя средства на основе поверхностного плазмонного резонанса (Persson, FEBS Letts. 413:359-363, 1997); (iv) измерения гидролиза синтетического субстрата (см. пример 4, ниже); и (v) измерения генерации тромбина в TF-независимой системе in vitro.

Варианты фактора VII, имеющие, по существу, такую же или улучшенную биологическую активность по сравнению с фактором VIIa дикого типа, охватывают те соединения, которые демонстрируют, по меньшей мере, примерно 25%, предпочтительно, по меньшей мере, примерно 50%, более предпочтительно, по меньшей мере, примерно 75% и, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, примерно 90% от специфичной активности фактора VIIa дикого типа, который продуцируется в том же типе клеток, когда они исследуются в одном или нескольких анализах из числа анализа с помощью свертывания, анализа с помощью протеолиза или анализа связывания TF, как описано выше. Варианты фактора VII, имеющие значительно пониженную биологическую активность по сравнению с фактором VIIa дикого типа, представляют собой такие, которые демонстрируют менее чем примерно 25%, предпочтительно, менее чем примерно 10%, более предпочтительно, менее чем примерно 5% и, наиболее предпочтительно, менее чем примерно 1% от специфичной активности фактора VIIa дикого типа, который продуцируется в клетках того же типа, если исследовать в одном или нескольких анализах из числа анализа свертывания, анализа протеолиза или анализа связывания TF, как описано выше. Варианты фактора VII, имеющие значительно модифицированную биологическую активность по сравнению с фактором VII дикого типа, включают в себя, без ограничения, варианты фактора VII, которые демонстрируют TF-независимую протеолитическую активность фактора X, и те, которые связывают TF, но не расщепляют фактор X.

Варианты фактора VII, либо демонстрирующие, по существу, такую же или лучшую биологическую активность, чем фактор VII дикого типа, либо, альтернативно, демонстрирующие значительно модифицированную или пониженную биологическую активность по сравнению с фактором VII дикого типа, включают в себя, без ограничения, полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность, которая отличается от последовательности фактора VII дикого типа вставкой, удалением или заменой одной или нескольких аминокислот. Не ограничивающие примеры вариантов фактора VII, имеющих, по существу, такую же биологическую активность, как и фактор VII дикого типа, включают в себя S52A-FVIIa, S60A-FVIIa (lino et al., Arch. Biochem. Biophys. 352:182-192, 1998); варианты FVIIa, демонстрирующие повышенную протеолитическую стабильность, описаны в патенте США № 5580560; фактор VIIa, который протеолитически расщеплен между остатками 290 и 291 или между остатками 315 и 316 (Mollerup et al., Biotechnol. Bioeng. 48:501-505, 1995); и окисленные формы фактора VIIa (Kornfelt et al., Arch. Biochem. Biophys. 363:43-54, 1999). Не ограничивающие примеры вариантов фактора VII, имеющих существенно пониженную или модифицированную биологическую активность по сравнению с фактором VII дикого типа, включают в себя R152E-FVIIa (Wildgoose et al., Biochem 29:3413-3420, 1990), S344A-FVIIa (Kazama et al., J. Biol. Chem. 270:66-72, 1995), FFR-FVIIa (Holst et al., Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg. 15:515-520, 1998), и фактор VIIa, где отсутствует домен Gla (Nicolaisen et al., FEBS Letts. 317:245-249, 1993). Неограничивающие примеры полипептидов и вариантов последовательностей химически модифицированного фактора VII описаны, например, в патенте США № 5997864.

Аспарагинсвязанное гликозилирование

Настоящее изобретение предусматривает препараты полипептидов фактора VII или полипептидов, родственных фактору VII, которые содержат определенный спектр гликоформ фактора VII, то есть полипептиды фактора VII или полипептиды, родственные фактору VII, имеющие заданные конфигурации аспарагинсвязанных (N-связанных) олигосахаридных цепей.

Как здесь используется, "конфигурация" N-связанного гликозилирования или "конфигурация" гликоформ, "распределение" или "спектр" относится к представлению конкретных конфигураций олигосахаридов в данной популяции полипептидов фактора VII или полипептидов, родственных фактору VII. Неограничивающие примеры таких конфигураций включают в себя относительную долю олигосахаридных цепей, которые (i) содержат, по меньшей мере, один остаток сиаловой кислоты; (ii) не имеют никаких остатков сиаловой кислоты (то есть являются нейтральными по заряду); (iii) содержат, по меньшей мере, один конечный остаток галактозы; (iv) содержат, по меньшей мере, один конечный остаток N-ацетилгалактозамина; (v) содержат, по меньшей мере, одну "неблокированную" антенну, то есть содержат, по меньшей мере, один конечный остаток галактозы или N-ацетилгалактозамина; или (vi) содержат, по меньшей мере, одну фукозу, связанную α1->3 с антеннарным остатком N-ацетилглюкозамина.

Как здесь используется, термин олигосахаридная цепь относится ко всей олигосахаридной конфигурации, которая ковалентно связана с одним отдельно взятым аспарагиновым остатком. Фактор VII обычно является гликозилированным на Asn 145 и Asn 322. N-связанная олигосахаридная цепь, присутствующая на факторе VII, продуцируемом у человека in situ, может быть би-, три или тетраантеннарным, при этом каждая антенна, имеющая конфигурацию Neu5Ac(α2->3 или α2->6)Gal(β1->4) GlcNAc, связывается (β1->2, 4 или 6) с остатком Man, который является связанным (α1->3 или 6) с Man(β1->4)GlcNAc(β1->4)GlcNAc-Asn. (Neu5Ac обозначает N-ацетилнейраминовую кислоту (сиаловую кислоту), Gal обозначает галактозу, GlcNAc обозначает N-ацетилглюкозамин, и Man обозначает маннозу). Олигосахаридные цепи также могут содержать остатки фукозы, которые могут быть связаны α1->6 с GlcNAc. когда фактор VII продуцируется у человека in situ, у некоторых олигосахаридных цепей отсутствуют остатки фукозы в каркасе; у всех цепей отсутствуют антеннарные остатки фукозы; и все цепи являются почти полностью сиалилированными, то есть конечный сахар каждой антенны представляет собой N-ацетилнейраминовую кислоту, связанную с галактозой посредством связи α2->3 или α2->6.

Однако, когда он продуцируется в других обстоятельствах, фактор VII может содержать олигосахаридные цепи, имеющие различные конечные конфигурации на одной или нескольких из их антенн, например, такие, где отсутствуют остатки сиаловой кислоты; содержащие остатки N-гликолилнейраминовой кислоты (Neu5Gc); содержащие конечный остаток N-ацетилгалактозамина (GalNAc) вместо галактозы; и тому подобное. Когда они продуцируются, например, в клетках BHK, культивируемых в присутствии сыворотки теленка, препараты фактора VII демонстрируют следующие конфигурации олигосахаридов:

- 87-93% олигосахаридных цепей содержат, по меньшей мере, один остаток сиаловой кислоты;

- 7-13% являются нейтральными (сиаловая кислота отсутствует);

- 9-16% содержат, по меньшей мере, один конечный остаток галактозы;

- 19-29% содержат, по меньшей мере, один конечный остаток N-ацетилгалактозамина; и

- 30-39% содержат, по меньшей мере, одну неблокированную антенну, то есть содержат, по меньшей мере, один конечный остаток галактозы или N-ацетилгалактозамина.

Авторы настоящего изобретения создали препараты фактора VII, содержащие конкретные заданные конфигурации олигосахаридов, которые отличаются от тех, которые описаны ранее. Настоящее изобретение охватывает препараты, содержащие полипептиды фактора VII или полипептиды, родственные фактору VII, демонстрирующие одну или несколько из следующих конфигураций гликоформ:

(i) В пределах примерно 94-100% олигосахаридных цепей содержат, по меньшей мере, один остаток сиаловой кислоты, например, в пределах примерно 94-99%, в пределах примерно 95-98% или в пределах примерно 96-97%. В различных воплощениях, по меньшей мере, примерно 94%, 95%, 96% или 97% олигосахаридных цепей содержат, по меньшей мере, один остаток сиаловой кислоты.

(ii) 6% или меньше олигосахаридных цепей являются нейтральными, например, в пределах примерно 1,5-6% или в пределах примерно 2-4%.

(iii) Менее чем примерно 16%, предпочтительно, менее чем примерно 10% олигосахаридных цепей содержат, по меньшей мере, одну конечную галактозу, например, в пределах примерно 6-10% или в пределах примерно 8-9%;

(iv) Менее чем примерно 25%, предпочтительно, менее чем примерно 10% олигосахаридных цепей содержат, по меньшей мере, один конечный остаток GalNAc, например, в пределах примерно 6-9% или в пределах примерно 7-8%;

(v) Менее чем примерно 30%, предпочтительно, менее чем примерно 25% олигосахаридных цепей содержат, по меньшей мере, одну неблокированную антенну, например, в пределах примерно 11-23% или в пределах примерно 12-18%; и

(vi) по меньшей мере, примерно 2%, предпочтительно, по меньшей мере, примерно 5%, более предпочтительно, по меньшей мере, примерно 10% или 20% и, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, примерно 40% олигосахаридных цепей содержат, по меньшей мере, одну фукозу, связанную α1->3 с антеннарным остатком N-ацетилглюкозамина (то есть с остатком N-ацетилглюкозамина, который связан β1->2, 4 или 6 с остатком Man).

Будет понятно, что каждое из условий (i)-(vi) может представлять отличную конфигурацию гликоформ, которая охватывается настоящим изобретением, то есть препарат в соответствии с настоящим изобретением может быть описан только одним из (i)-(vi). Альтернативно, в зависимости от конкретной конфигурации гликоформ, препарат, охватываемый настоящим изобретением, может быть описан более чем одним условием из (i)-(vi).

Кроме того, препарат, охватываемый настоящим изобретением, может быть описан одним или несколькими условиями из (i)-(vi) в сочетании с одной или несколькими другими структурными особенностями. Например, настоящее изобретение охватывает препараты, содержащие полипептиды фактора VII или полипептиды, родственные фактору VII, в которых остатки сиаловой кислоты (Neu5Ac или Neu5Gc) связаны с галактозой исключительно в конфигурации α2->3. Настоящее изобретение также охватывает препараты, содержащие полипептиды фактора VII или полипептиды, родственные фактору VII, которые содержат фукозу, связанную α1->6 с N-ацетилглюкозамином в каркасе, и/или фукозу, связанную α1->3 с антеннарным N-ацетилглюкозамином. В одном из воплощений препараты по настоящему изобретению охватывают полипептиды фактора VII или полипептиды, родственные фактору VII, в которых более чем 99% олигосахаридных цепей содержат, по меньшей мере, один остаток сиаловой кислоты, и (a) остатки сиаловой кислоты связываются исключительно в конфигурации α2->3, и/или (b) существуют остатки фукозы, связанные с N-ацетилглюкозаминами в каркасе, и/или (c) детектируемое количество антенн заканчивают собой N-ацетилгалактозамин. В одном из воплощений настоящее изобретение охватывает препараты, содержащие фактор VIIa дикого типа, в котором более чем 99% олигосахаридных цепей содержат, по меньшей мере, один остаток сиаловой кислоты, и остатки сиаловой кислоты связаны с галактозой исключительно в конфигурации α2->3. В другом воплощении настоящее изобретение охватывает препараты, содержащие фактор VIIa дикого типа, в котором более чем 99% олигосахаридных цепей содержат, по меньшей мере, один остаток сиаловой кислоты, и по меньшей мере, некоторые олигосахаридные цепи содержат N-ацетилгалактозамин. Настоящее изобретение не охватывает фактор VII дикого типа или фактор VIIa дикого типа, который выделяется из плазмы крови человека и не модифицируется ex vivo путем обработки с помощью гликозидаз.

В одном из воплощений препарат фактора VIIa содержит олигосахаридные цепи, имеющие одну фукозу, связанную α1->3 с одним антеннарным N-ацетилглюкозамином. В другом воплощении препарат фактора VIIa содержит олигосахаридные цепи, имеющие остатки фукозы, связанные α1->3 с каждым антеннарным N-ацетилглюкозамином биантеннарного олигосахарида (сиалиловая структура Льюиса X). В другом воплощении препарат фактора VIIa содержит олигосахаридные цепи, имеющие (i) фукозу, связанную N-ацетилглюкозамином в каркасе, и (ii) одну фукозу, связанную α1->3 с одним антеннарным N-ацетилглюкозамином. В другом воплощении препарат фактора VIIa содержит олигосахаридные цепи, имеющие (i) фукозу, связанную с N-ацетилглюкозамином в каркасе, и (ii) остатки фукозы, связанные α1->3 с каждым антеннарным N-ацетилглюкозамином биантеннарного олигосахарида.

При осуществлении настоящего изобретения конфигурация N-связанных олигосахаридов может определяться с использованием любого способа, известного в данной области, включая, без ограничения: высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ); капиллярный электрофорез (КЭ); ядерный магнитный резонанс (ЯМР); масс-спектрометрию (МС) с использованием методик ионизации, таких как бомбардировка быстрыми атомами, электрораспыление или лазерная десорбция из вспомогательной матрицы (MALDI); газовую хроматографию (ГХ); и обработку с помощью экзогликозидаз в сочетании с анионообменной (АО)-ВЭЖХ, вытеснительной хроматографии (ВХ) или МС. См., например, Weber et al., Anal. Biochem. 225:135 (1995); Klausen et al., J. Chromatog. 718:195 (1995); Morris et al., in Mass spectrometry of biological Materials, McEwen et al., eds., Marcel Dekker, (1990), pp. 137-167; Conboy et al., Biol. Mass Spectrom. 21:397, 1992; Hellerqvist, Meth. Enzymol. 193:554 (1990); Sutton et al., Anal. Biochem. 318:34 (1994); Harvey et al., Organic Mass Spectrometry 29:752 (1994).

После определения полученных из фактора VII олигосахаридных цепей с использованием любого из указанных выше способов (или любого другого способа, который идентифицирует олигосахаридные цепи, имеющие различные конфигурации), определенные типы сопоставляются, например, с одной из групп (i)-(v). Относительное содержание каждого из (i)-(v) вычисляется как сумма олигосахаридов, сопоставляемых с этой группой, по отношению к общему содержанию олигосахаридных цепей в образце.

Например, используя АО-ВЭЖХ, могут быть выявлены 13 или более пиков N-связанных олигосахаридов из препарата рекомбинантного фактора VII, продуцируемого клетками BHK. См., например, Klausen et al., Mol. Biotechnol. 9:195, 1998. Пять из пиков (обозначенных 1-5 в Klausen et al.) не содержат сиаловой кислоты в то время, как восемь из пиков (обозначенные 6, 7, и 10-15) содержат сиаловую кислоту.

Станет понятно, что при данном анализе количество и распределение цепей, содержащих сиаловую кислоту и не содержащих сиаловую кислоту, может зависеть от (a) того полипептида, который экспрессируется; (b) типа клеток и условий культивирования; и (c) способа анализа, который используется, и что получаемые конфигурации могут изменяться в соответствии с этим.

В любом случае после определения олигосахаридов, содержащих сиаловую кислоту, и олигосахаридов, не содержащих сиаловой кислоты, обычные программы анализа данных используются для вычисления площади под каждым пиком; общей площади пиков и процентной доли от общей площади пиков, представленной конкретным пиком. Таким образом, для данного препарата сумма площадей пиков, содержащих сиаловую кислоту/общая площадь пиков ×100 дает значение % сиалилирования для препарата в соответствии с настоящим изобретением (то есть долю олигосахаридных цепей, имеющих, по меньшей мере, один остаток сиаловой кислоты). Подобным же образом может быть вычислен % цепей, не содержащих сиаловой кислоты или содержащих, по меньшей мере, одну галактозу или N-ацетилглюкозамин.

Способы для получения препаратов фактора VII, имеющих заданную конфигурацию N-связанных олигосахаридов

Препараты фактора VII, вариантов фактора VII или полипептидов, родственных фактору VII, имеющих, каждый, заданную конфигурацию N-связанных олигосахаридов, могут быть получены с помощью соответствующей клетки-хозяина, которая экспрессирует фактор VII или полипептиды, родственные фактору VII.

Клетки-хозяева: В некоторых воплощениях клетки-хозяева представляют собой клетки человека, экспрессирующие эндогенный ген фактора VII. В этих клетках эндогенный ген может быть интактным или может быть модифицирован in situ, или некая последовательность вне гена фактора VII может быть модифицирована in situ, чтобы изменить экспрессию эндогенного гена фактора VII. Может быть использована клетка человека, способная экспрессировать эндогенный ген фактора VII.

В других воплощениях гетерологичные клетки-хозяева программируются для экспрессии фактора VII человека из рекомбинантного гена. Клетки-хозяева могут быть клетками позвоночных, насекомых или грибов. Предпочтительно, клетки представляют собой клетки млекопитающих, обладающих способностью ко всему спектру N-связанного гликозилирования; O-связанного гликозилирования и γ-карбоксилирования млекопитающих. См., например, патент США № 4784950. Предпочтительные линии клеток млекопитающих включают в себя линии клеток CHO (ATCC CCL 61), COS-1 (ATCC CRL 1650), почек детеныша хомячка (BHK) и HEK293 (ATCC CRL 1573; Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977). Предпочтительная линия клеток BHK представляет собой линию клеток BHK tk^- ts13 (Waechter and Baserga, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:1106-1110, 1982), далее упоминаемые как клетки BHK 570. Линия клеток BHK 570 является доступной от Американской коллекции типовых культур, 12301 Parklawn Dr., Rockville, MD 20852, под номером доступа ATCC CRL 10314. Линия клеток BHK tk^- ts13 является также доступной от ATCC под номером доступа CRL 1632. Кроме того, может быть использован ряд других линий клеток, включая Rat Hep I (гепатома крысы; ATCC CRL 1600), Rat Hep II (гепатома крысы; ATCC CRL 1548), TCMK (ATCC CCL 139), легкие человека (ATCC HB 8065), NCTC 1469 (ATCC CCL 9.1) и клетки DUKX (линия клеток CHO) (Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, 1980), (клетки DUKX также упоминаются, как клетки CXB11) и DG44 (линия клеток CHO) (Cell, 33:405, 1983, and Somatic Cell and Molecular Genetics 12:555, 1986). Также пригодными для использования являются клетки 3T3, клетки Namalwa, миеломы и продукты слияния миелом с другими клетками. В особенно предпочтительном воплощении клетки-хозяева представляют собой клетки BHK 21, которые адаптированы для роста в отсутствие сыворотки и запрограммированы для экспрессии фактора VII. В некоторых воплощениях клетки могут представлять собой мутантные или рекомбинантные клетки, которые экспрессируют качественно или количественно иной спектр ферментов гликозилирования (таких, например, как гликозилтрансферазы и/или гликозидазы), чем тип клеток, из которых они получены. Клетки также могут быть запрограммированы для экспрессии других гетерологичных пептидов или белков, включая, например, процессированные формы фактора VII.

В одном из воплощений клетки-хозяева представляют собой клетки CHO, которые запрограммированы для коэкспрессии как представляющего интерес полипептида фактора VII (то есть фактора VII или полипептида, родственного фактору VII), так и другого гетерологичного пептида или полипептида, такого, например, как модифицующий фермент или фрагмент фактора VII.

Способы: Настоящее изобретение охватывает способы для получения препарата, содержащего любую из конфигураций гликоформ, описанных выше как (i)-(vi), и в дополнительном воплощении способы для оптимизации распределения гликоформ фактора VII и полипептидов, родственных фактору VII. Эти способы осуществляются с помощью стадий:

(a) культивирования клетки, экспрессирующей фактор VII или полипептиды, родственные фактору VII, при первом наборе заданных условий культивирования;

(b) извлечения фактора VII или полипептидов, родственных фактору VII, из культуры, для получения препарата, содержащего полипептиды; и

(c) анализа конфигурации олигосахаридов, связанных с полипептидами, для определения конфигурации гликоформ.

Способы могут, кроме того, включать в себя:

(d1) изменение условий культивирования на стадии (a) для получения второго набора заданных условий культивирования;

(e1) повторение стадий (b)-(d1) до тех пор, пока не будет получена желаемая конфигурация гликоформ.

Альтернативно, способы могут, кроме того, включать в себя:

(d2) химическую и/или ферментативную обработку препарата для изменения конфигурации олигосахаридов; и

(e2) повторение стадий (b)-(d2) до тех пор, пока не будет получена желаемая конфигурация гликоформ.

Эти способы могут дополнительно включать в себя стадию, на которой препараты, имеющие заданные конфигурации гликоформ, подвергаются, по меньшей мере, одному исследованию биологической активности (включая, например, свертывание, протеолиз фактора X или связывание TF) или другой функциональности (такой, например, как фармакокинетический профиль или стабильность) и установлению корреляций конкретных конфигураций гликоформ с конкретными профилями биологической активности или функциональности в соответствии с идентификацией желаемой конфигурации гликоформ.

Параметры условий культивирования, которые могут быть изменены на стадии (d1), включают в себя, без ограничения: клетку происхождения, такую, например, как клетка, полученная от видов, иных, чем использовались исходно; или мутантная или рекомбинантная клетка, имеющая изменения в одной или нескольких гликозилтрансферазах или гликозидазах, или в других компонентах аппарата гликозилирования (см. Grabenhorst et al., Glycoconjugate J. 16:81, 1999; Bragonzi et al., Biochem. Biophys. Acta 1474:273, 2000; Weikert, Nature Biotechnol. 17:1116, 1999); уровень экспрессии полипептида; условия метаболизма, такие, например, как концентрация глюкозы или глутамина; отсутствие или присутствие сыворотки; концентрация витамина K; гидролизаты белков, гормонов, следы металлов, солей, а также параметры процесса, подобные температуре, уровню растворенного кислорода и значению pH.

Ферментативные обработки, которые могут быть использованы на стадии (d2) для модификации кон