Конъюгаты грелин-носитель

Конъюгаты грелин-носитель

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к областям молекулярной биологии, вирусологии, иммунологии и медицины. Изобретение относится к композиции, содержащей массив упорядоченных и повторяющихся антигенов или антигенных детерминант, а в частности массив грелина или полученных из грелина пептидов. Более конкретно изобретение относится к композиции, содержащей вирусоподобную частицу и связанный с ней, по меньшей мере, один грелин или полученный из грелина пептид.

Изобретение также относится к способу получения конъюгатов и упорядоченных и повторяющихся массивов соответственно. Композиции по изобретению пригодны для получения вакцин для лечения ожирения и других заболеваний, ассоциированных с увеличенным потреблением пищи или увеличенной массой тела, и для эффективной индукции иммунных ответов, в частности ответов антителами. Кроме того, композиции по изобретению особенно пригодны для эффективной индукции аутоспецифичного иммунного ответа в рамках указанного контекста.

Связанная область

Ожирение представляет собой заболевание, поражающее миллионы людей по всему миру. Хотя лежащие в основе ожирения причины могут являться различными, общей причиной почти для всех форм ожирения является повышенное потребление пищи. Чувство голода и пищевое поведение регулируют многие факторы, включающие в себя лептин, гормон роста, нейропептид Y (NPY), родственный агути-белок (AGRP) и другие. Недавно идентифицированным ключевым регулятором пищевого поведения является грелин, ацилированный пептид, продуцируемый в желудке, а также в некоторых отделах головного мозга (гипоталамус) (Kojima et al. Nature 402: 656-660 (1999)). Грелин образуется при ферментативном расщеплении из формы предшественника пробелка, состоящей из 117 аминокислот, с образованием пептида из 28 аминокислот с н-октаноилированием по серину 3. н-Октаноилирование по данному положению необходимо для биологической активности грелина. Идентифицирована вторая изоформа грелина из 27 а.к. (грелин-desQ14) с отсутствующим в положении 14 глутамином (Q), однако данная изоформа представляет собой только незначительную составляющую циркулирующего грелина. Подобно полноразмерному грелину биологическая активность грелина-desQ14 зависит от н-октаноильной группы на серине 3. Однако наибольшая функциональная активность достигается за счет изоформы грелина из 28 а.к. (Hosoda et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 279 (3): 909-913 (2000)). Грелин высококонсервативен, так как человеческий и крысиный грелин отличаются только на 2 аминокислоты (GSSFLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR (SEQ ID № 31) в сравнении с GSSFLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPR (SEQ ID № 32)) (Kojima et al. Nature 402: 656-660 (1999)).

Рецепторы для грелина (GHS-R) экспрессированы в различных областях головного мозга, включающих в себя дугообразное ядро (Arc) и вентромедиальное ядро гипоталамуса и гипофиза (Howard etal. Science 273: 974-977 (1996)); McKee et al. Mol Endokrin. 11: 415-423 (1997); Guan et al., Mol Brain Research 48: 23-29 (1997)), указывая на то, что грелин преимущественно действует в головном мозге. В дополнение к стимуляции грелином высвобождения GH из гипофиза (Kojima et al. Nature 402: 656-660 (1999)) недавно его идентифицировали как ключевой центральный регулятор питания (Nakazato et al., Nature 409: 194-198 (2001)). Конкретно показано, что после интрацеребровентрикулярного введения грелин стимулирует потребление пищи. Кроме того, интрацеребровентрикулярное введение антител против грелина подавляет потребление пищи. Инъекция грелина индуцировала повышенное высвобождение NPY, а антитела против NPY совместно с антагонистами AGRP блокировали индуцированное грелином потребление пищи, указывая на то, что грелин модулирует потребление пищи посредством усиления экспрессии NPY и AGRP (Nakazato et al., Nature 409: 194-198 (2001)). Кроме того, периферийное ежедневное введение грелина индуцировало увеличение массы тела мышей и крыс, а сывороточные концентрации грелина увеличивались у голодающих крыс и уменьшались при кормлении, дополнительно указывая на то, что грелин играет ключевую роль в регуляции потребления пищи (Tschop et al, Nature 407: 908-912). Для трансгенных крыс, экспрессирующих в Arc антисмысловую к GHS-R РНК, показана меньшая масса тела и меньшее количество адипозной ткани, что поддерживает точку зрения о том, что грелин регулирует массу тела (Shuto et al., JCI 109: 14291436 (2002)). Также существуют доказательства того, что грелин играет ключевую роль в пищевом поведении людей. Периферическое введение грелина людям усиливало аппетит и увеличивало потребление пищи у людей (Wren et al., J Clin Endocrinol Metab 86: 5992-5998 (2001)). У людей с синдромом Прадера-Вилли с наиболее общей формой человеческого синдромного ожирения выявляют чрезвычайно высокие уровни грелина (Cummings et al. Nat Med 8: 643-644 (2002)). Кроме того, у людей уровни грелина в плазме сильно увеличены после вызванной диетой потери массы, коррелируя с быстрым восстановлением массы после прекращения людьми диеты. Напротив, у пациентов с операцией обходного желудочного анастомоза уровни грелина оставались низкими и после диеты, и у пациентов в данных условиях их масса обычно не восстанавливалась (Cummings et al., N Engl J Med 21: 1623-1630 (2002)). Следовательно, по-видимому, грелин представляет собой ключевой регулятор потребления пищи и массы тела у людей.

Так как периферическое введение грелина могло увеличивать потребление пищи, ведя к увеличению массы тела (Tschop et al, Nature 407: 908-912), вероятно, что грелин, продуцируемый в желудке, достигает головного мозга через кровоток и переключает пищевое поведение. Таким образом, возможно, что блокирование поступления грелина из крови в головной мозг остановит потребление пищи у животных и людей. Так как показано, что специфические антитела могут блокировать действие грелина в головном мозге (Nakazato et al., Nature 409: 194-198 (2001)), вероятно, что периферические антитела также будут способны блокировать действие периферического грелина. Кроме того, так как антитела неэффективно проходят через гематоэнцефалический барьер, специфичные к грелину антитела, вероятно, смогут изолировать грелин от головного мозга, но не будут действовать на грелин в головном мозге. Это могло бы являться особенно притягательной возможностью, так как грелин также продуцируется в головном мозге, где он, вероятно, выполняет отличные от регулирования потребления пищи функции (Nakazato et al., Nature 409: 194-198 (2001)). Следовательно, потенциальной терапией ожирения могла бы являться индукция специфичных к грелину антител у хозяина, ведущая к долговременной блокаде грелина, приводящей к уменьшению потребления пищи, подобно той, которую наблюдают у пациентов с обходным желудочным анастомозом.

В WО98/42840 описано влияние грелина и полученных из грелина фрагментов на желудочно-кишечный тракт и, таким образом, в частности, их эффекты на перистальтику желудка и опорожнение желудка. Кроме того, в US 6420521 описано применение коротких пептидов грелина для воздействия на функцию желудка, включая опорожнение желудка, сократительную способность желудка и всасывание глюкозы.

Однако, как правило, трудно индуцировать антитело, отвечающее против пептидов, в особенности против собственных пептидов. Один из способов увеличить эффективность вакцинации представляет собой увеличение степени повторяемости применяемого антигена. В отличие от отдельных белков вирусы индуцируют быстрые и эффективные иммунные ответы в отсутствие каких-либо адъювантов и при помощи и без помощи T-клеток (Bachmann and Zinkernagel, Ann. Rev. Immunol: 15: 235-270 (1991)). Хотя вирусы часто состоят из немногих белков, они способны инициировать значительно более сильные иммунные ответы, чем их отдельные компоненты. Для B-клеточных ответов известно, что одним из ключевых факторов для иммуногенности вирусов является повторяемость и порядок поверхностных эпитопов. Многие вирусы обладают квазикристаллической поверхностью, обнаруживающей регулярный набор эпитопов, эффективно связывающих специфичные к эпитопам иммуноглобулины на B-клетках (Bachmann and Zinkernagel, Immunol. Today 17: 553-558 (1996)). Данное связывание поверхностных иммуноглобулинов на B-клетках представляет собой сильный активационный сигнал, прямо индуцирующий продвижение по клеточному циклу и продукцию антител IgM. Далее, такие инициированные B-клетки способны активировать хелперные T-клетки, в свою очередь индуцирующие в B-клетках переключение продукции антител с IgM на IgG и образование долгоживущих B-клеток памяти - цель любой вакцинации (Bachmann and Zinkernagel, Ann. Rev. Immunol. 15: 235-270 (1997)). Структура вируса даже связана с образованием анти-антител при аутоиммунном заболевании и как часть естественного ответа на патогены (см. Fehr, T., et al., J Exp. Med. 185: 1785-1792 (1997)). Таким образом, антитела, представляемые высокоорганизованной вирусной поверхностью, способны индуцировать сильные ответы против антител.

Однако, как указано, иммунная система, как правило, не может образовывать антитела против собственных структур. Для растворимых антигенов, представленных в низких концентрациях, это происходит вследствие толерантности на уровни Th-клеток. В данных условиях связывание собственного антигена с носителем, который способен обеспечивать помощь T-клеток, может нарушить толерантность. Для растворимых белков, присутствующих в высоких концентрациях, или мембранных белков в низких концентрациях B- и Th-клетки могут являться толерантными. Однако толерантность B-клеток может являться обратимой (анэргия), и ее можно разрушить введением антигена в высокоорганизованной форме, связанным с чужеродным носителем (Bachmann and Zinkernagel, Ann. Rev. Immunol. 15: 235-270 (1997)).

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторы обнаружили, что грелин или пептиды грелина, связанные с коровой частицей, обладающей структурой с собственной повторяющейся организацией и, в частности, для данного случая с вирусоподобными частицами (VLP) и субъединицами VLP соответственно приводят к высокоорганизованным и повторяющимся конъюгатам, представляющим собой сильные иммуногены для индукции специфических антител. Настоящее изобретение относится к профилактическому и терапевтическому средству для лечения ожирения и связанных заболеваний, основанному на упорядоченном и повторяющемся массиве коровых частиц с грелином или полученными из грелина пептидами и, в частности, на конъюгате и массиве VLP-грелин/пептид грелина соответственно. Данная профилактическая и терапевтическая композиция способна индуцировать высокие титры антител против грелина у вакцинированного животного или человека. Следовательно, настоящее изобретение относится к грелину и его имеющим отношение к головному мозгу свойствам. Кроме того, настоящее изобретение относится к центральным эффектам грелина на головной мозг, что более важно, к регуляции аппетита, секреции гормона роста и энергетическому гомеостазу. Следовательно, предпочтительно, чтобы антитела, индуцированные посредством стратегии вакцинации авторов настоящего изобретения, являлись способными связываться с н-октаноилированной формой(ами) грелина. Как указано, грелин или более короткие пептидные фрагменты грелина можно применять, когда они связаны с коровой частицей, и альтернативно или предпочтительно вводить в адъюванте для индукции специфичных к грелину антител у людей или животных.

Следовательно, короткие пептидные фрагменты грелина, особенно более короткие пептиды из остатков 24-33, 42-51, 31-41 и 28-37, связанные или C- или N-концом с коровой частицей или вирусоподобной частицей соответственно, способны индуцировать высокоспецифичные антитела против грелина, способные нейтрализовать периферически циркулирующий грелин до его проникновения в ЦНС и воздействия на гормон роста и, следовательно, на потребление пищи.

Таким образом, в предпочтительном осуществлении настоящего изобретения антиген или антигенную детерминанту выбирают из группы пептидов грелина, соответствующих остаткам 24-33, 42-51, 31-41 и 28-37 любой из указанных последовательностей с SEQ ID № 144 по 146, где указанные предпочтительные пептидные фрагменты грелина выбирают из группы, состоящей из (a) человеческого грелина; (b) коровьего грелина; (c) овечьего грелина; (d) собачьего грелина; (e) кошачьего грелина; (f) мышиного грелина; (g) свиного грелина; и (h) лошадиного грелина.

Более конкретно в настоящем изобретении авторы смогли индуцировать высокие уровни антител, неожиданно распознающих н-октаноилированную форму грелина, как показано здесь, а в частности, в примере 17. Кроме того, полученные антитела также распознавали альтернативную изоформу грелин-desQ14. Как результат, антитела, полученные при вакцинации грелином и пептидом грелина соответственно, связанными C- или N-концом с коровой частицей или предпочтительно с VLP, являлись способными блокировать проникновение н-октаноилированного грелина в головной мозг и модулировали потребление пищи у мышей. Следовательно, настоящее изобретение относится к стратегиям вакцинации против активного грелина, как лечению от ожирения и других связанных заболеваний.

Как показано здесь, а в частности в примере 18, вакцинация грелином и пептидом грелина соответственно, связанными C- или N-концом с коровой частицей или предпочтительно с VLP ведет к уменьшению потребления пиши у мышей, что позволяет предположить, что грелин и пептид грелина соответственно представляют собой ключевой регулятор потребления пищи, и полагают, что антитела, направленные соответственно к грелину и пептиду грелина, представляют собой возможное терапевтическое средство против ожирения и других связанных заболеваний.

Таким образом, настоящее изобретение относится к композиции содержащей: (a) коровую частицу, по меньшей мере, с одним первым участком прикрепления и (b) по меньшей мере, один антиген или антигенную детерминанту, по меньшей мере, с одним вторым участком прикрепления, где указанный антиген или антигенная детерминанта представляет собой грелин или полученный из грелина пептид и где указанный второй участок прикрепления выбран из группы, состоящей из (i) участка прикрепления, не встречающегося в природе с указанным антигеном или антигенной детерминантой, и (ii) участка прикрепления, встречающегося в природе с указанным антигеном или антигенной детерминантой, где указанный второй участок прикрепления способен к ассоциации с указанным первым участком прикрепления и где указанный антиген или антигенная детерминанта и указанная коровая частица взаимодействуют посредством указанной ассоциации для формирования упорядоченного и повторяющегося массива антигенов. Предпочтительные осуществления коровых частиц, пригодных для применения по настоящему изобретению, представляют собой вирусы, вирусоподобные частицы, бактериофаг, вирусоподобную частицу РНК-фага, бактериальный пиль или жгутик или любую другую коровую частицу с собственной повторяющейся структурой, способной к формированию упорядоченного и повторяющегося массива антигенов по настоящему изобретению.

Более конкретно изобретение относится к композиции, содержащей упорядоченный и повторяющийся массив антигенов или антигенных детерминант и, в частности для данного случая, конъюгаты грелина или полученных из грелина пептидов с VLP. Более конкретно изобретение относится к композиции, содержащей вирусоподобную частицу и, по меньшей мере, один связанный с ней грелин или полученный из грелина пептид. Также изобретение относится к способу получения конъюгатов и упорядоченных и повторяющихся массивов соответственно. Композиции по изобретению пригодны для получения вакцин для лечения ожирения и связанных заболеваний и в качестве фармакцины для профилактики или лечения ожирения и связанных заболеваний и для эффективной индукции иммунных ответов, в особенности ответов антителами. Кроме того, композиции по изобретению особенно пригодны для эффективной индукции аутоспецифичных иммунных ответов в указанном контексте.

В настоящем изобретении грелин или полученный из грелина пептид связан с коровой частицей и VLP соответственно, как правило, ориентированным образом с получением упорядоченного и повторяющегося массива антигенов грелина или полученного из грелина пептида. Кроме того, высокоповторяющаяся и организованная структура коровых частиц и VLP соответственно опосредует представление грелина или полученного из грелина пептида в высокоупорядоченном и повторяющемся виде, приводя к высокоорганизованному и повторяющемуся массиву антигенов. Кроме того, связывание грелина или полученного из грелина пептида с коровой частицей и VLP соответственно обеспечивает эпитопы хелперных T-клеток, так как коровая частица и VLP являются чужеродными для хозяина, иммунизированного массивом коровая частица-грелин или полученный из грелина пептид и массивом VLP-грелин или полученный из грелина пептид соответственно. Данные массивы отличаются от ранее известных в данной области конъюгатов, в частности их высокоорганизованной структурой, размерами и повторяемостью антигена на поверхности массива.

В одном аспекте изобретения грелин или полученный из грелина пептид экспрессируют в подходящем экспрессирующем хозяине или синтезируют, тогда как коровую частицу и VLP соответственно экспрессируют и очищают из экспрессирующего хозяина, подходящего для укладки и сборки коровой частицы и VLP соответственно. Грелин или полученные из грелина пептиды можно синтезировать химически. Так как биологически активный грелин включает в себя н-октаноилированный серин в третьем положении, химический синтез представляет собой предпочтительный путь получения грелина для содержащего биологически активные формы грелина вакцинного препарата. Затем массив грелина или полученного из грелина пептида собирают посредством связывания грелина или полученного из грелина пептида с коровой частицей или VLP соответственно.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к композиции, содержащей (a) вирусоподобную частицу и (b) по меньшей мере, один антиген или антигенную детерминанту, где указанный антиген или указанная антигенная детерминанта представляет собой грелин или полученный из грелина пептид и где, по меньшей мере, один указанный антиген или антигенная детерминанта связаны с указанной вирусоподобной частицей.

В дополнительном аспекте изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей (a) композицию по настоящему изобретению и (b) приемлемый фармацевтический носитель.

В еще одном дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к вакцинной композиции, содержащей композицию, содержащую (a) коровую частицу, по меньшей мере, с одним первым участком прикрепления и (b) по меньшей мере, один антиген или антигенную детерминанту, по меньшей мере, с одним вторым участком прикрепления, где указанный антиген или антигенная детерминанта представляет собой грелин или полученный из грелина пептид и где указанный второй участок прикрепления выбран из группы, состоящей из (i) участка прикрепления, не встречающегося в природе с указанным антигеном или антигенной детерминантой, и (ii) участка прикрепления, встречающегося в природе с указанным антигеном или антигенной детерминантой, где указанный второй участок прикрепления способен к ассоциации с указанным первым участком прикрепления и где указанный антиген или антигенная детерминанта и указанная коровая частица взаимодействуют посредством указанной ассоциации для формирования упорядоченного и повторяющегося массива антигенов.

В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к вакцинной композиции, содержащей композицию, где указанная композиция содержит (a) вирусоподобную частицу и (b) по меньшей мере, один антиген или антигенную детерминанту, где указанный антиген или указанная антигенная детерминанта представляет собой грелин или полученный из грелина пептид и где, по меньшей мере, один указанный антиген или антигенная детерминанта связаны с указанной вирусоподобной частицей.

В еще одном дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к способу получения композиции по п. 1 формулы изобретения, включающему в себя: (a) получение вирусоподобной частицы и (b) получение, по меньшей мере, одного антигена и антигенной детерминанты, где указанный антиген или указанная антигенная детерминанта представляет собой грелин или полученный из грелина пептид; (c) объединение указанной вирусоподобной частицы и, по меньшей мере, одного указанного антигена или антигенной детерминанты так, чтобы, по меньшей мере, один указанный антиген или антигенная детерминанта являлись связанными с указанной вирусоподобной частицей.

Аналогично настоящее изобретение относится к процессу для получения композиции по изобретению, включающему в себя: (a) получение коровой частицы, по меньшей мере, с одним первым участком прикрепления; (b) получение, по меньшей мере, одного антигена или антигенной детерминанты, по меньшей мере, с одним вторым участком прикрепления, где указанный антиген или антигенная детерминанта представляет собой грелин или полученный из грелина пептид, и где указанный второй участок прикрепления выбран из группы, состоящей из (i) участка прикрепления, не встречающегося в природе с указанным антигеном или антигенной детерминантой, и (ii) участка прикрепления, встречающегося в природе с указанным антигеном или антигенной детерминантой, и где указанный второй участок прикрепления способен к ассоциации с указанным первым участком прикрепления; и (c) объединение указанной коровой частицы и, по меньшей мере, одного указанного антигена или антигенной детерминанты, где указанный антиген или антигенная детерминанта и указанная коровая частица взаимодействуют посредством указанной ассоциации для формирования упорядоченного и повторяющегося массива антигенов.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу иммунизации, включающему в себя введение композиции по п. 1 формулы изобретения животному или человеку.

В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к применению композиции по п. 1 формулы изобретения для получения лекарственного средства для лечения ожирения или связанного заболевания.

В еще одном дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к применению композиции по п. 1 формулы изобретения для получения лекарственного средства для терапевтического или профилактического лечения ожирения или связанного заболевания. Кроме того, в еще одном дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к применению композиции по п. 1 формулы изобретения или отдельно, или в сочетании с другими средствами для получения композиции, вакцины или лекарственного средства для лечения или профилактики ожирения или связанного заболевания и/или для стимуляции иммунной системы млекопитающего.

Следовательно, изобретение, в частности, относится к вакцинным композициям, подходящим для профилактики и/или уменьшения или лечения ожирения или связанных с ним состояний. Изобретение дополнительно относится к способам иммунизации и вакцинации соответственно для предотвращения и/или уменьшения или лечения ожирения или связанных с ним состояний у животных и особенно у домашних животных, таких как кошки или собаки, а также у людей. Композиции по изобретению можно применять профилактически или терапевтически.

В конкретных осуществлениях изобретение относится к способам профилактики, лечения и/или уменьшения ожирения или связанных с ним состояний, вызываемых или усиливаемых "собственными" генными продуктами, т.е. "аутоантигенами", как применяют здесь. В связанных осуществлениях изобретение относится к способам индукции иммунологических ответов у животных и индивидуумов соответственно, ведущих к образованию антител, что предотвращает, лечит и/или уменьшает ожирение или связанные с ним состояния, вызываемые или усиливаемые "собственными" генными продуктами.

Как может понять специалист в данной области, когда композиции по изобретению вводят животному или человеку, они могут находиться в композиции, содержащей соли, буферы, адъюванты или другие вещества, желательные для увеличения эффективности композиции. Примеры пригодных для применения в получении фармацевтических композиций веществ предоставлены в многочисленных источниках, включающих в себя Remington's Pharmaceutical Sciences (Osol, A, ed., Mack Publishing Co. (1990)).

Указано, что композиции по изобретению являются "фармакологически приемлемыми" если получающий их индивид может переносить их введение. Кроме того, композиции по изобретению вводят в "терапевтически эффективном количестве" (т.е. в количестве, вызывающем желательный физиологический эффект).

Композиции по настоящему изобретению можно вводить различными известными в данной области способами, но обычно их вводят посредством инъекции, инфузии, ингаляции, орального введения или других физических способов. Композиции альтернативно можно вводить внутримышечно, внутривенно или подкожно. Компоненты композиций для введения включают в себя стерильные водные (например, физиологический раствор) или неводные растворы и суспензии. Примеры неводных растворителей представляют собой пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, такие как оливковое масло, и инъецируемые органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Для увеличения проницаемости через кожу и увеличения всасывания антигена можно применять носители или непроницаемое покрытие.

Специалисту в данной области в свете того, что известно в данной области, следующего ниже описания изобретения и формулы изобретения станут очевидны другие осуществления настоящего изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ/ФИГУР

На фигуре 1 представлены продукты связывания реакции мышиного C-грелина (SEQ ID: № 77) или мышиного грелина-GC (SEQ ID: № 105) с капсидным белком Qβ. Полоса M представляет собой маркер, полоса 1 представляет собой дериватизированный VLP Qβ, полоса 2 представляет собой Qβ-C-грелин в растворимой фракции, полоса 3 представляет собой Qβ-C-грелин в нерастворимой фракции, полоса 4 представляет собой грелин-GC-Qβ в растворимой фракции, полоса 5 представляет собой грелин-GC-Qβ в нерастворимой фракции. В нерастворимой фракции находится очень мало продукта.

На фигуре 2 представлены средние титры специфичных к грелину антител IgG, обнаруженные в общей сыворотке мышей, иммунизированных мышиным Qβ-C-грелином (Qb-cGhr), мышиным грелином-GC-Qβ (Qb-GhrC) или PBS на 0, 14, 21 и 42 сутки. Титры ELISA представлены как разведения сыворотки, приводящие к половине максимальной OD при анализе ELISA. Планшеты для ELISA покрывали мышиным грелином с октаноилированным серином (Bachem, Product № H-4862) в концентрации 20 мкг/мл. Планшеты блокировали, а затем инкубировали с серийно разведенными мышиными сыворотками от 14, 21 и 42 суток. Связавшиеся антитела выявляли с применением ферментативно меченного антитела против мышиных IgG. В качестве контроля также тестировали сыворотку от тех же мышей перед иммунизацией.

На фигуре 3 представлено общее потребление пищи мышами, иммунизированными мышиным Qβ-C-грелином (Qb-cGhr), мышиным грелином-GC-Qβ (Qb-GhrC) или PBS. В качестве контроля мышей иммунизировали PBS. Всех мышей от 0 до 14 суток содержали на нормальной диете. Впоследствии всех мышей содержали на диете с высоким содержанием жира (45%) для облегчения развития вызванного диетой ожирения. Пищу и воду давали без ограничений. Через регулярные интервалы после иммунизации (на 5, 11, 14, 21, 28, 35, 40, 49 и 55 сутки после иммунизации) у каждой мыши контролировали изменения массы тела, а также контролировали расход пищи и воды на клетку (т.е. группу).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Если не определено иначе, все применяемые здесь технические и научные термины обладают теми же значениями, как и обычно понимаемые специалистом в данной области, к которой принадлежит данное изобретение. Хотя в практическом осуществлении или для тестирования настоящего изобретения можно применять любые способы и вещества, подобные или эквивалентные тем, которые описаны здесь, ниже описаны предпочтительные способы и вещества.

1. Определения:

Адъювант: Как применяют здесь, термин "адъювант" относится к неспецифическим стимуляторам иммунного ответа или веществам, позволяющим образование у хозяина депо, которое в сочетании с вакциной или фармацевтической композицией по настоящему изобретению соответственно может обеспечить даже более сильный иммунный ответ. Можно применять множество адъювантов. Примеры включают в себя полный и неполный адъювант Фрейнда, гидроксид алюминия и модифицированный мурамилдипептид. Дополнительными адъювантами являются минеральные гели, такие как гидроксид алюминия, поверхностно-активные вещества, такие как лизолецитин, плюрониловые полиолы, полианионы, пептиды, масляные эмульсии, гемоцианины морского блюдца, динитрофенол и потенциально пригодные человеческие адъюванты, такие как BCG (бацилла Кальмета-Герена) и Corynebacterium parvum. Такие адъюванты также хорошо известны в данной области. Дополнительные адъюванты, которые можно вводить с композициями по настоящему изобретению, включают в себя в качестве неограничивающих примеров монофосфорильный липидный иммуномодулятор, AdjuVax 100a, QS-21, QS-18, CRL1005, соли алюминия (квасцы), MF-59, OM-174, OM-197, OM-294 и виросомальную адъювантную технологию. Адъюванты также могут содержать смесь данных веществ.

В данной области известны иммунологически активные сапониновые фракции, полученные из обладающей активностью адъюванта, коры южноамериканского дерева Quillaja Saponaria Molina. Например, QS21, также известный как QA21, представляет собой очищенную при помощи ВЭЖХ фракцию из дерева Quillaja Saponaria Molina, а способ его получения (как QA21) описан в патенте США № 5057540. Также как адъюванты у Scott et al, Int. Archs. Allergy Appl. Immun., 1985, 77, 409 описаны сапонины килайи. В данной области известен монофосфориллипид A и его производные. Предпочтительное производное представляет собой 3-де-O-ацилированный монофосфориллипид A, и оно известно из патента Великобритании № 2220211. Дополнительные предпочтительные адъюванты описаны в WO00/00462, описание которого включено сюда в качестве ссылки.

Однако выгодной особенностью настоящего изобретения является высокая иммуногенность композиций по изобретению. Как уже указывали здесь и станет очевидным по ходу данной спецификации, в дополнительных альтернативных или предпочтительных осуществлениях предоставлены вакцины и фармацевтические композиции без адъювантов, что приводит к вакцинам и фармацевтическим композициям для лечения AD без адъювантов и, таким образом, обладающих более высоким профилем безопасности, так как адъюванты могут вызывать побочные эффекты. Как применяют здесь в контексте вакцин и фармацевтических композиций для лечения AD, термин "без" относится к вакцинам и фармацевтическим композициям, применяемым без адъювантов.

Аминокислотный линкер: Как применяют здесь, "аминокислотный линкер", или также просто обозначаемый в пределах данной спецификации как "линкер", или ассоциирует антиген или антигенную детерминанту со вторым участком прикрепления или более предпочтительно уже включает в себя или содержит второй участок прикрепления, как правило, но не обязательно, в виде одного аминокислотного остатка, предпочтительно в виде цистеинового остатка. Однако, как применяют здесь, термин "аминокислотный линкер" не подразумевает, что такой аминокислотный линкер состоит исключительно из аминокислотных остатков, даже если аминокислотный линкер, состоящий из аминокислотных остатков, представляет собой предпочтительное осуществление настоящего изобретения. Аминокислотные остатки аминокислотного линкера предпочтительно состоят из встречающихся в природе аминокислот или неприродных аминокислот, известных в данной области, всех L или всех D или их смесей. Однако изобретение также включает в себя аминокислотный линкер, содержащий молекулу с сульфгидрильной группой или цистеиновый остаток. Такая молекула предпочтительно содержит C1-C6-алкильную, циклоалкильную (C5, C6), арильную или гетероарильную функциональную группу. Однако кроме аминокислотного линкера в область изобретения также необходимо включить линкер, предпочтительно содержащий C1-C6-алкильную, циклоалкильную (C5, C6), арильную или гетероарильную функциональную группу и не содержащий аминокислот(ы). Ассоциация между антигеном или антигенной детерминантой или, необязательно, вторым участком прикрепления и аминокислотным линкером предпочтительно осуществляется, по меньшей мере, посредством одной ковалентной связи, более предпочтительно - по меньшей мере, посредством одной пептидной связи.

Животное: Как применяют здесь, термин "животное" предназначен для включения в себя, например, людей, овец, лосей, оленя, чернохвостого оленя, норок, млекопитающих, обезьян, лошадей, крупного рогатого скота, свиней, коз, собак, кошек, крыс, мышей, птиц, цыплят, рептилий, рыб, насекомых и паукообразных.

Антитело: Как применяют здесь, термин "антитело" относится к молекулам, способным к связыванию эпитопов или антигенных детерминант. Термин предназначен для включения в себя полных антител и их антигенсвязывающих фрагментов, включая одноцепочечные антитела. Наиболее предпочтительные антитела представляют собой антигенсвязывающие фрагменты человеческих антител и включают в себя в качестве неограничивающих примеров Fab, Fab' и F(ab')2, Fd, одноцепочечные Fvs (scFv),одноцепочечные антитела, связанные дисульфидными связями Fvs (sdFv) и фрагменты, содержащие или V_L- или V_H-домен. Антитела могут происходить от любого животного, включая птиц и млекопитающих. Предпочтительно антитела являются человеческими, мышиными, кроличьими, козьими, антителами морских свинок, верблюжьими, лошадиными или куриными. Как применяют здесь, термин "человеческие" антитела включает в себя антитела с аминокислотной последовательностью человеческого иммуноглобулина и включает в себя антитела, выделенные из библиотек человеческих иммуноглобулинов или из животных, трансгенных по одному или нескольким человеческим иммуноглобулинами и не экспрессирующих эндогенные иммуноглобулины, как описано, например, в патенте США № 5939598, выданному Kucherlapati et al.

Антиген: Как применяют здесь, термин "антиген" относится к молекуле, которую способно связывать антитело или T-клеточный рецептор (TCR), если она представлена молекулами MHC. Как применяют здесь, термин "антиген" также охватывает T-клеточные эпитопы. Антиген дополнительно способен распознаваться иммунной системой и/или способен индуцировать гуморальный иммунный ответ и/или клеточный иммунный ответ, приводя к активации B- и/или T-лимфоцитов. Это, однако, может потребовать, чтобы, по меньшей мере, в некоторых случаях антиген содержал эпитоп Th-клеток или являлся связанным с ним и чтобы его вводили в адъюванте. Антиген может обладать одним или несколькими эпитопами (B- и T-эпитопы). Как предполагают, указанная выше конкретная реакция указывает на то, что антиген предпочтительно реагирует, как правило, высокоизбирательно с соответствующим антителом или TCR, а не с множеством антител или TCR индуцируемых другими антигенами. Как применяют здесь, антигены могут представлять собой смеси нескольких отдельных антигенов.

Антигенная детерминанта: Как применяют здесь, термин "антигенная детерминанта" предназначен для обозначения той части антигена, которая специфически распознается B- или T-лимфоцитами. B-лимфоциты, реагирующие на антигенные детерминанты, образуют антитела, тогда как T-лимфоциты отвечают на антигенные детерминанты пролиферацией и развитием эффекторных функций, важных для опосредования клеточного и/или гуморального иммунитета.

Ассоциация: Как применяют здесь, термин "ассоциация", как его применяют к первому и второму участкам прикрепления, относится к связыванию первого и второго участка прикрепления, предпочтительно посредством, по меньшей мере, одной непептидной связи. Связь может являться ковалентной, ионной, гидрофобной, полярной или любым их сочетанием, предпочтительно тип связи является ковалентным.

Участок прикрепления, первый: Как применяют здесь, фраза "первый участок прикрепления" относится к элементу неприродного или природного происхождения, с которым может ассоциироваться второй участок прикрепления, расположенный на антигене или антигенной детерминанте. Первый участок прикрепления может представлять собой белок, полипептид, аминокислоту, пептид сахар, полинуклеотид, природный или синтетический полимер, вторичный метаболит или соединени