Полипептид фактора коагуляции vii человека, его получение и применение

Полипептид фактора коагуляции vii человека, его получение и применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Настоящее изобретение относится к новым полипептидам фактора коагуляции VIIa, имеющим коагуляционную активность, а также к полинуклеотидным конструкциям, кодирующим такие пептиды, векторам и клеткам-хозяевам, включающим и экспрессирующим полинуклеотид, фармацевтическим композициям, применению и способам лечения.

Известный уровень техники

Свертывание крови представляет собой процесс, включающий сложное взаимодействие различных компонентов (или факторов) крови, который в конечном итоге ведет к формированию сгустка фибрина. Обычно компоненты крови, которые участвуют в процессе, который обозначается как «каскад» свертывания, являются ферментативно неактивными белками (проферментами или зимогенами), которые превращаются в протеолитические ферменты под действием активатора (который сам является активированным фактором свертывания). Факторы коагуляции, которые подверглись такому превращению, обычно обозначаются как «активные факторы» и обозначаются с помощью добавления буквы «а» к названию фактора коагуляции (например, фактор VIIa).

Инициация процесса гемостаза опосредуется образованием комплекса между тканевым фактором, экспонированным на сосудистой стенке в результате повреждения, и фактором VIIa. Данный комплекс затем индуцирует превращение факторов IX и Х в их активные формы. Фактор Ха индуцирует превращение ограниченных количеств протромбина в тромбин на клетке, несущей тканевой фактор. Тромбин активирует тромбоциты и факторы V и VIII в факторы Va и VIIIa, оба являющиеся кофакторами в дальнейшем процессе, ведущем к полному выбросу тромбина. Данный процесс включает образование фактора Ха под действием фактора IXa (в комплексе с фактором VIIIa) и осуществляется на поверхности активированных тромбоцитов. Тромбин на конечном этапе превращает фибриноген в фибрин, что ведет к образованию сгустка фибрина. В последнее время обнаружено, что фактор VII и тканевой фактор являются главными инициаторами свертывания крови.

Фактор VII является гликопротеином плазмы, присутствующим в следовых количествах, который циркулирует в крови в виде одноцепочечного зимогена. Зимоген каталитически неактивен. Одноцепочечный фактор VII может быть превращен в двухцепочечный фактор VIIa под действием фактора Ха, фактора XIIa, фактора IXa, фактора VIIa или тромбина in vitro. Считается, что фактор Ха является главным физиологическим активатором фактора VII. Как и в случае некоторых других белков плазмы, вовлеченных в гемостаз, активность фактора VII зависит от витамина К, который требуется для гамма-карбоксилирования множественных остатков глутаминовой кислоты, которые кластеризуются в непосредственной близости от аминоконца белка. Данные гамма-карбоксилированные глутаминовые кислоты требуются для индуцируемого ионами металла взаимодействия фактора VII с фосфолипидами. Превращение зимогена фактора VII в активированную двухцепочечную молекулу осуществляется в результате разрыва внутренней пептидной связи Arg₁₅₂-Ile₁₅₃. В присутствии тканевого фактора, фосфолипидов и ионов кальция двухцепочечный фактор VIIa быстро активирует фактор Х или фактор IX в результате ограниченного протеолиза.

Часто является желательным стимулировать или улучшить каскад свертывания у субъекта. Фактор VIIa применяли для контролирования нарушений свертывания, которые обусловлены несколькими причинами, такими как недостаточность факторов свертывания (например, гемофилия А и В или недостаточность факторов коагуляции факторов XI или VII) или ингибиторов факторов свертывания. Фактор VIIa применяли также для контролирования избыточного кровотечения, наступающего у субъектов с нормально функционирующим каскадом свертывания крови (в отсутствие недостаточности факторов свертывания или ингибиторов любого из факторов коагуляции). Такое кровотечение может быть вызвано, например, нарушением функции тромбоцитов, тромбоцитопенией или болезнью фон Виллебранда. Кровотечение является также основной проблемой в связи с хирургическими вмешательствами и другими формами повреждения тканей.

Европейский патент No. 200421 (ZymoGenetics) относится к нуклеотидной последовательности, кодирующей фактор VII человека, и к рекомбинантной экспрессии фактора VII в клетках млекопитающих.

Работа Dickinson et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996) 93, 14379-14384) относится к варианту фактора VII, в котором Leu305 заменен на Ala (FVII(Ala305)).

Работа Iwanaga et al. (Thromb. Haemost. (supplement August 1999), 466, abstract 1474) относится к вариантам фактора VIIa, в которых остатки 316-320 удалены или остатки 311-322 заменены на соответствующие остатки трипсина.

Существует потребность в вариантах фактора VIIa, обладающих коагуляторной активностью, в вариантах с высокой активностью, которые могут быть введены в относительно низких дозах, и в вариантах, которые не вызывают нежелательных побочных эффектов, таких как системная активация системы свертывания и кровотечения, соответственно, связанных с общепринятыми способами лечения.

Описание изобретения

В настоящее время обнаружено, что полипептидные варианты фактора коагуляции VIIa человека, в которых аминокислота Leu305 и, по меньшей мере, одна аминокислота, независимо выбранная из группы, состоящей из Lys157, Lys337, Asp334, Ser336, Va1158, Glu296 и Met298 SEQ ID NO:1, заменены отличными аминокислотами, обладают повышенной коагуляторной активностью по сравнению с диким типом фактора коагуляции VIIa человека.

Применяемый здесь термин «отличная аминокислота» обозначает одну аминокислоту, которая отличается от той аминокислоты, которая присутствует в данном положении в природном белке. Это охватывает, но не ограничивается этим, аминокислоты, которые могут кодироваться полинуклеотидом. Предпочтительно отличная аминокислота является природной L-формой и может кодироваться полинуклеотидом. Конкретным примером является L-цистеин (Cys).

Применяемый здесь термин «активность» обозначает способность полипептида фактора VII превращать свой субстрат, фактор X, в активный фактор Ха. Активность полипептида фактора VII может быть измерена с помощью «Анализа протеолиза in vitro» (смотри пример 6).

Термин «собственная активность» также включает способность образовывать тромбин на поверхности активированных тромбоцитов в отсутствие тканевого фактора.

Leu305 расположен на конце α-спирали, найденной в форме фактора VIIa, связанной с тканевым фактором, которая, как считается, важна для его активности. В факторе VIIa в свободном состоянии (факторе VIIa, не связанном с тканевым фактором) спираль деформирована и в результате этого, очевидно, нестабильна. Полипептидные варианты в соответствии с настоящим изобретением достигают активной конформации, которая обычно должна быть индуцирована тканевым фактором. Увеличенная активность полипептидных вариантов по сравнению с диким типом фактора VIIa может быть обусловлена стабилизацией α-спирали, переориентацией спирали или каким-то другим изменением конформации. Замена Leu305 должна индуцировать переориентацию и/или стабилизацию спирали.

Аминокислоты, включая Lys157, Lys337, Asp334, Ser336, Val158, Glu296 и Met298, расположены в области, которая, как считается, влияет на вставку аминоконца протеазного домена и тем самым на образование каталитически активной конформации фактора VIIa, которая зависит от солевого мостика между концевой аминогруппой Ilе153 и боковой цепью Asp343. Замены могут устранять электростатическое отталкивание, добавлять водородные связи или другим способом облегчать вставку аминоконца.

Благодаря более высокой собственной активности описанных полипептидных вариантов фактора VIIa по сравнению с природным VIIa, более низкая доза может быть адекватной для получения функционально адекватной концентрации в месте действия, и таким образом будет возможно вводить более низкую дозу субъекту со случаями кровотечений или нуждающемуся в увеличении активности нормальной системы гемостаза.

Авторами настоящего изобретения было обнаружено, что в результате замены аминокислоты Leu305 в сочетании с одним или более Lys в положении 157, и Lys в положении 337, и Val в положении 158, и Glu в положении 296, и Met в положении 298, и Asp в положении 334, и Ser в положении 336, фактор VIIa будет спонтанно достигать более активной конформации, которая обычно должна индуцироваться тканевым фактором. Такие полипептидные варианты фактора VIIa проявляют собственную активность, которая может быть терапевтически применимой в ситуациях, когда прокоагуляторная активность независима от тканевого фактора (образование фактора Ха на поверхности тромбоцитов), таких как при введении высоких доз, например, NovoSeven®.

В другом осуществлении дополнительная замена аминокислот в протеазном домене дополнительно облегчает образование активной конформации молекулы. Предполагается, однако, что наиболее выраженные эффекты должны быть выявлены, когда указанные выше мутации индуцируются в непосредственной близости (по последовательности или по трехмерной структуре) от данных последних семи аминокислот.

Изобретение дополнительно охватывает замену нескольких аминокислот в N-конце домена Gla (аминокислоты в положении, соответствующем 1-37 SEQ ID NO:1) фактора VIIa, что может придать белку существенно более высокое сродство к фосфолипидам мембран, таким как фосфолипиды мембран клеток, несущих тканевой фактор, или тромбоцитов, в результате чего создаются полипептидные варианты фактора VII, которые обладают усиленным прокоагуляторным действием.

Таким образом, указанные выше полипептидные варианты фактора VIIa, в дополнение к уже произведенной замене аминокислоты в положении 305 в сочетании с заменами в положениях 157, 158, 296, 298, 334, 336 или 337 и необязательными заменами аминокислот в других участках протеазного домена, могут также иметь, по меньшей мере, одну замену аминокислоты в N-концевом домене Gla, в результате чего получают белок, имеющий увеличенную активность, а также увеличенное сродство к фосфолипидам мембран по сравнению с природным фактором VII. Предпочтительно аминокислоты в положениях 10 и 32 (относительно SEQ ID NO:1) фактора VII могут быть заменены отличной аминокислотой. Примерами предпочтительных аминокислот для включения в указанные выше положения являются: аминокислоту Pro в положении 10 заменяют на Gln, Arg, His, Gln, Asn или Lys; и/или аминокислоту Lys в положении 32 заменяют на Glu, Gln или Asn.

Для замены могут быть также рассмотрены другие аминокислоты в домене Gla, исходя из различий в сродстве к фосфолипидам и из последовательностей зависимых от витамина К белков плазмы.

Термин «N-концевой домен Gla» обозначает аминокислотную последовательность 1-37 фактора VII.

Трехбуквенное обозначение «GLA» означает 4-карбоксиглутаминовую кислоту (γ-карбоксиглутамат).

Термин «протеазный домен» обозначает аминокислотную последовательность 153-406 фактора VII (тяжелую цепь фактора VIIa).

Применяемый здесь термин «полипептид фактора VII» обозначает любой белок, включающий аминокислотную последовательность 1-406 природного фактора VII человека (SEQ ID NO:1), или его варианты. Он включает, но не ограничивается этим, фактор VII человека, фактор VIIa человека и их варианты.

Применяемый здесь термин «фактор VII» предназначен для включения молекулы неактивного одноцепочечного зимогенного фактора VII, а также молекулы активного двухцепочечного фактора VII (фактора VIIa). Он включает белки, которые имеют аминокислотную последовательность 1-406 природного фактора VII или фактора VIIa человека. Он также включает белки со слегка модифицированной аминокислотной последовательностью, например, с модифицированным N-концом, включая делеции N-концевых аминокислот или добавки такой длины, чтобы данные белки по существу сохраняли активность фактора VIIa. Применяемый здесь термин «фактор VIIa» или «FVIIa» обозначает продукт, состоящий из активированной формы (фактора VIIa). «Фактор VII» или «фактор VIIa» в пределах указанного выше определения также включает природные аллельные варианты, которые могут существовать и встречаются то у одного, то у другого индивидуума. Кроме того, степень и участки гликозилирования или других посттрансляционных модификаций могут варьироваться в зависимости от выбранных клеток-хозяев и природы клеточного окружения хозяина.

Применяемые здесь термины «вариант» или «варианты» предназначены для обозначения фактора VII, имеющего последовательность SEQ ID NO:1, где одна или более аминокислот родительского белка заменена другой аминокислотой, и/или где одна или более аминокислот родительского белка удалена, и/или где одна или более аминокислот вставлены в белок, и/или где одна или более аминокислот добавлены к родительскому белку. Такое добавление может иметь место либо на N-концевом участке, либо на С-концевом участке родительского белка, или на обоих концевых участках. «Вариант» или «варианты» в пределах данного определения все еще имеют активность FVII в их активированной форме. В одном осуществлении вариант на 70% идентичен последовательности SEQ ID NO:1. В одном осуществлении вариант на 80% идентичен последовательности SEQ ID NO:1. В другом осуществлении вариант на 90% идентичен последовательности SEQ ID NO:1. В дополнительном осуществлении вариант на 95% идентичен последовательности SEQ ID NO:1.

В первом аспекте изобретение относится к полипептиду фактора VII, включающему, по меньшей мере, две замены по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1, где указанные замены представляют собой (i) замену L305 любой другой аминокислотой и (ii) замену любой другой аминокислотой одной или более из аминокислот, выбранных из группы, состоящей из К157, К337, D334, S336, V158, Е296 и М298.

Во втором аспекте изобретение относится к полипептиду фактора VII с двумя заменами по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1, где указанные замены представляют собой (i) замену L305 любой другой аминокислотой и (ii) замену любой другой аминокислотой одной аминокислоты, выбранной из группы, состоящей из К157, К337, D334, S336, V158, Е296 и М298.

В третьем аспекте изобретение относится к полипептиду фактора VII с тремя заменами по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1, где указанные замены представляют собой (i) замену L305 любой другой аминокислотой, и (ii) замену любой другой аминокислотой двух аминокислот, выбранных из группы, состоящей из К157, К337, D334, S336, V158, Е296 и М298.

В дополнительном аспекте изобретение относится к полипептиду фактора VII с четырьмя заменами по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1, где указанные замены представляют собой (i) замену L305 любой другой аминокислотой, и (ii) замену любой другой аминокислотой трех аминокислот, выбранных из группы, состоящей из К157, К337, D334, S336, V158, Е296 и М298.

В другом аспекте изобретение относится к полипептиду фактора VII с пятью заменами по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1, где указанные замены представляют собой (i) замену L305 любой другой аминокислотой, и (ii) замену любой другой аминокислотой четырех аминокислот, выбранных из группы, состоящей из К157, К337, D334, S336, V158, Е296 и М298.

В дополнительном аспекте изобретение относится к полипептиду фактора VII с шестью заменами по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1, где указанные замены представляют собой (i) замену L305 любой другой аминокислотой, и (ii) замену любой другой аминокислотой пяти аминокислот, выбранных из группы, состоящей из К157, К337, D334, S336, V158, Е296 и М298.

В другом аспекте изобретение относится к полипептиду фактора VII с семью заменами по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1, где указанные замены представляют собой (i) замену L305 любой другой аминокислотой, и (ii) замену любой другой аминокислотой шести аминокислот, выбранных из группы, состоящей из К157, К337, D334, S336, V158, Е296 и М298.

В другом аспекте изобретение относится к полипептиду фактора VII с восемью заменами по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1, где указанные замены представляют собой (i) замену L305 любой другой аминокислотой, и (ii) замену любой другой аминокислотой аминокислот К157, К337, D334, S336, V158, Е296 и М298.

В другом аспекте изобретение относится к полинуклеотидной конструкции, кодирующей полипептид фактора VII, включающий, по меньшей мере, две замены по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1, где указанные замены представляют собой (i) замену L305 любой другой аминокислотой, и (ii) замену любой другой аминокислотой одной или более аминокислот, выбранных из группы, состоящей из К157, К337, D334, S336, V158, Е296 и М298.

Термин «конструкция» предназначен для обозначения полинуклеотидного сегмента, который может быть основан на полностью или частично существующей в природе нуклеотидной последовательности, кодирующей интересующий полипептид. Конструкция может необязательно содержать другие полинуклеотидные сегменты. Сходным образом, термин «аминокислоты, которые могут кодироваться полинуклеотидными конструкциями» покрывает аминокислоты, которые могут кодироваться полинуклеотидными конструкциями, определенными выше, т.е. такие аминокислоты как Ala, Val, Leu, lle, Met, Phe, Trp, Pro, Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Glu, Lys, Arg, His, Asp и Gln.

В другом аспекте в изобретении предлагается рекомбинантный вектор, включающий полинуклеотидную конструкцию, кодирующую полипептид фактора VII.

Применяемый здесь термин «вектор» обозначает объект из любой нуклеиновой кислоты, способный амплифицироваться в клетке-хозяине. Таким образом, вектор может представлять собой автономно реплицирующийся вектор, т.е. вектор, который существует как внехромосомный объект, репликация которого является независимой от репликации хромосом, например, плазмида. Альтернативно, вектор может быть таким, что после введения в клетку-хозяина он интегрируется в геном клетки-хозяина и реплицируется совместно с хромосомой (мами), в которую он был интегрирован. Выбор вектора часто зависит от клетки-хозяина, в которую он вводится. Векторы включают, но не ограничиваются этим, плазмидные векторы, векторы-фаги, вирусы или космидные векторы. Векторы обычно содержат начало репликации и, по меньшей мере, один ген для селекции, т.е. ген, кодирующий продукт, который легко определять или присутствие которого существенно для клеточного роста.

В другом аспекте в изобретении предлагается рекомбинантная клетка-хозяин, включающая полинуклеотидную конструкцию или вектор. В одном осуществлении рекомбинантная клетка-хозяин представляет собой клетку эукариот. В другом осуществлении рекомбинантная клетка-хозяин происходит от млекопитающих. В дополнительном осуществлении рекомбинантная клетка-хозяин выбрана из группы, состоящей из клеток СНО, клеток НЕК и клеток ВНК.

Применяемый здесь термин «клетка-хозяин» представляет любую клетку, включая гибридные клетки, в которой может экспрессироваться гетерологичная ДНК. Типичные клетки-хозяева включают, но не ограничиваются этим, клетки насекомых, клетки дрожжей, клетки млекопитающих, включая клетки человека, такие как клетки ВНК, СНО, НЕК и COS. В экспериментах настоящего изобретения клетки-хозяева, предназначенные для культивирования, предпочтительно представляют собой клетки млекопитающих, более предпочтительно признанную линию клеток млекопитающих, включая без ограничения клеточные линии СНО (например, АТСС CCL 61), COS-1 (например, АТСС CRL 1650), клеток почек детенышей хомячка (ВНК) и НЕК293 (например, АТСС CRL 1573; Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977). Предпочтительной клеточной линией ВНК является клеточная линия tk^-tsl3 ВНК (Waechter and Baserga, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:1106-1110, 1982), обозначаемая здесь далее как клетки ВНК 570. Клеточная линия ВНК 570 имеется в распоряжении американской коллекции типов культур, 12301 Parklawn Dr., Rockville, MD 20852, под номером поступления АТСС CRL 10314. Клеточная линия tk^-tsl3 ВНК имеется в распоряжении АТСС, под номером поступления CRL 1632. Другие подходящие клеточные линии включают без ограничения Rat Hep I (гепатома крысы; АТСС CRL 1600), Rat Hep II (гепатома крысы; АТСС CRL 1548), ТСМК (АТСС CCL 139), клетки легких человека (АТСС НВ 8065), NCTC 1469 (АТСС CCL 9.1) и клетки DUKX (Uriaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, 1980). Пригодными также являются клетки 3Т3, клетки Namalwa, миеломы и гибриды клеток миеломы с другими клетками.

В другом аспекте в изобретении предлагается трансгенное животное, содержащее и экспрессирующее полинуклеотидную конструкцию.

В другом аспекте в изобретении предлагается трансгенное растение, содержащее и экспрессирующее полинуклеотидную конструкцию.

В другом аспекте изобретение относится к способу получения полипептида фактора VII изобретения, причем способ включает культивирование клетки, включающей полинуклеотидную конструкцию, в подходящей ростовой среде в условиях, позволяющих экспрессироваться полинуклеотидной конструкции, и выделение полученного в результате полипептида из культуральной среды.

Применяемый здесь термин «подходящая ростовая среда» обозначает среду, содержащую питательные вещества и другие компоненты, требуемые для роста клеток и экспрессии последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид фактора VII изобретения.

В другом аспекте изобретение относится к способу получения полипептида фактора VII, причем способ включает выделение полипептида из молока, продуцируемого трансгенным животным.

В другом аспекте изобретение относится к способу получения полипептида фактора VII, причем способ включает культивирование клетки трансгенного растения, включающей полинуклеотидную конструкцию, и выделение полипептида из полученного в результате растения.

В другом аспекте изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей полипептид фактора VII, имеющий, по меньшей мере, две замены по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1, где указанные замены представляют собой (i) замену L305 любой другой аминокислотой и (ii) замену любой другой аминокислотой одной или более аминокислот, выбранных из группы, состоящей из К157, КЗ 37, D334, S336, V158, Е296 и М298; и, необязательно, фармацевтически приемлемый носитель.

В другом аспекте изобретение относится к применению полипептида фактора VII, имеющего, по меньшей мере, две замены по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1, где указанные замены представляют собой (i) замену L305 любой другой аминокислотой и (ii) замену любой другой аминокислотой одной или более аминокислот, выбранных из группы, состоящей из К157, К337, D334, S336, V158, Е296 и М298; для получения лекарственного средства. В одном осуществлении лекарственное средство применяется для лечения нарушений кровотечения или эпизодов кровотечения или для увеличения активности нормальной системы гемостаза. В одном осуществлении лекарственное средство применяется для лечения гемофилии А или В.

В контексте настоящего изобретения термин «лечение» предназначен для включения как предотвращения ожидаемого кровотечения, как в случае хирургических вмешательств, так и регуляции уже наступившего кровотечения, такого как при травме, с целью ингибирования кровотечения или сведения его к минимуму. Профилактическое введение полипептида фактора VIIa в соответствии с изобретением, таким образом, включается в термин «лечение».

Термин «эпизоды кровотечения» предназначен для включения неконтролируемого и избыточного кровотечения. Эпизоды кровотечения могут быть существенной проблемой как в связи с хирургическим вмешательством, так и при других формах повреждения ткани. Неконтролируемое и избыточное кровотечение может наступить у субъектов, имеющих нормальную систему свертывания, и у субъектов с расстройствами свертывания или в виде кровотечения. Применяемый здесь термин «расстройство в виде кровотечения» отражает любой дефект, врожденный, острый или индуцированный, клеточного или молекулярного происхождения, который проявляется в виде кровотечений. Примерами является недостаточность факторов свертывания (например, гемофилия А и В или недостаточность факторов свертывания XI или VII), ингибирование факторов свертывания, нарушение функций тромбоцитов, тромбоцитопения или болезнь фон Виллебранда.

Избыточные кровотечения также наступают у субъектов с нормальным функционированием каскада свертывания крови (в отсутствие недостаточности факторов свертывания или ингибиторов любого из факторов свертывания) и могут быть вызваны нарушением функции тромбоцитов, тромбоцитопенией или болезнью фон Виллебранда. В таких случаях кровотечения могут быть похожи на те кровотечения, которые вызываются гемофилией, поскольку в системе гемостаза, как и при гемофилии, отсутствуют или являются нетипичными главные «компоненты» свертывания (такие как тромбоциты или белковый фактор фон Виллебранда), что является основной причиной кровотечений. У субъектов, которые испытали обширное повреждение ткани в связи с хирургическим вмешательством или тяжелой травмой, нормальный механизм гемостаза может быть нарушен в связи с необходимостью немедленного гемостаза, и у них может развиться кровотечение, несмотря на нормальный механизм гемостаза. Достижение удовлетворительного гемостаза также является проблемой при кровотечениях, наступающих в органах, таких как мозг, область внутреннего уха и глаза, характеризующихся ограниченной возможностью для хирургического гемостаза. Такая же проблема может возникнуть в процессе взятия биопсий из различных органов (печени, легких, опухолевой ткани, желудочно-кишечного тракта), а также при лапароскопической хирургии. Обычно для всех данных ситуаций трудностью является обеспечение гемостаза с помощью хирургических процедур (швов, зажимов и т.д.), куда также входят случаи, когда кровотечение является диффузным (геморрагический гастрит и профузное маточное кровотечение). Острое и профузное кровотечения могут также наступать у субъектов при антикоагуляторной терапии, у которых нарушения гемостаза индуцировались получаемым лечением. Такие субъекты могут нуждаться в хирургических вмешательствах в случае, если надо быстро противодействовать антикоагуляторному эффекту. Радикальная залобковая простатэктомия представляет собой обычно проводимую процедуру у субъектов с локализованным раком простаты. Операция часто осложняется существенной и иногда массивной потерей крови. Значительная потеря крови при простатэктомии связана главным образом с осложненной анатомической ситуацией с различающимися по плотности местами васкуляризации, которые не являются легко доступными для хирургического гемостаза, что может приводить к диффузному кровотечению из большой области. Другой ситуацией, которая может вызвать проблемы в случае неудовлетворительного гемостаза, является такая, при которой субъекты с нормальным механизмом гемостаза получают антикоагуляторную терапию для предотвращения тромбоэмболического заболевания. Такая терапия может включать гепарин, другие формы протеогликанов, варфарин или другие формы антагонистов витамина К, а также аспирин и другие ингибиторы агрегации тромбоцитов.

В одном осуществлении изобретения кровотечение связано с гемофилией. В другом осуществлении кровотечение связано с гемофилией с приобретенными ингибиторами. В другом осуществлении кровотечение связано с тромбоцитопенией. В другом осуществлении кровотечение связано с болезнью фон Виллебранда. В другом осуществлении кровотечение связано с тяжелым повреждением ткани. В другом осуществлении кровотечение связано с тяжелой травмой. В другом осуществлении кровотечение связано с хирургическим вмешательством. В другом осуществлении кровотечение связано с лапароскопической хирургией. В другом осуществлении кровотечение связано с геморрагическим гастритом. В другом осуществлении кровотечение представляет собой профузное маточное кровотечение. В другом осуществлении кровотечение наступает в органах с ограниченной осуществимостью механического гемостаза. В другом осуществлении кровотечение наступает в мозге, области внутреннего уха или глазах. В другом осуществлении кровотечение связано с процессом взятия биопсийного материала. В другом осуществлении кровотечение связано с антикоагуляторной терапией.

Применяемый здесь термин «субъект» предназначен для обозначения любого животного, в частности млекопитающих, таких как человек, и может, где это подходит, применяться взаимозаменяемо с термином «пациент».

Термин «усиление нормальной системы гемостаза» обозначает усиление способности генерировать тромбин.

В другом аспекте изобретение относится к способу лечения расстройств кровотечения или эпизодов кровотечения у субъекта или к усилению нормальной системы гемостаза, причем способ включает введение терапевтически или профилактически эффективного количества полипептида фактора VII, включающего, по меньшей мере, две замены по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1, где указанные замены представляют собой (i) замену L305 любой другой аминокислотой и (ii) замену любой другой аминокислотой одной или более из аминокислот, выбранных из группы, состоящей из К157, К337, D334, S336, VI58, Е296 и М298, нуждающемуся в этом субъекту.

В другом аспекте изобретение относится к полипептиду фактора VII изобретения для применения в качестве лекарственного средства.

В одном осуществлении изобретения полипептид фактора VII представляет собой полипептид, в котором L305 заменена любой другой аминокислотой и К157 заменена любой другой аминокислотой.

В другом осуществлении изобретения полипептид фактора VII представляет собой полипептид, в котором L305 заменена любой другой аминокислотой и К337 заменена любой другой аминокислотой.

В другом осуществлении изобретения полипептид фактора VII представляет собой полипептид, в котором L305 заменена любой другой аминокислотой и D334 заменена любой другой аминокислотой.

В другом осуществлении изобретения полипептид фактора VII представляет собой полипептид, в котором L305 заменена любой другой аминокислотой и S336 заменена любой другой аминокислотой.

В другом осуществлении изобретения полипептид фактора VII представляет собой полипептид, в котором L305 заменена любой другой аминокислотой и VI58 заменена любой другой аминокислотой.

В другом осуществлении изобретения полипептид фактора VII представляет собой полипептид, в котором L305 заменена любой другой аминокислотой и Е296 заменена любой другой аминокислотой.

В другом осуществлении изобретения полипептид фактора VII представляет собой полипептид, в котором L305 заменена любой другой аминокислотой и М298 заменена любой другой аминокислотой.

В другом осуществлении изобретения полипептид фактора VII представляет собой полипептид, в котором, по меньшей мере, одна аминокислота в оставшихся положениях протеазного домена заменена любой другой аминокислотой.

В другом осуществлении изобретения полипептид фактора VII представляет собой полипептид, в котором, по меньшей мере, одна аминокислота в оставшихся положениях протеазного домена заменена любой другой аминокислотой.

В другом осуществлении изобретения полипептид фактора VII представляет собой полипептид, в котором самое большее 20 дополнительных аминокислот в оставшихся положениях протеазного домена заменены любыми другими аминокислотами.

В другом осуществлении изобретения полипептид фактора VII представляет собой полипептид, в котором, по меньшей мере, одна аминокислота, соответствующая аминокислоте в положении, выбранном из 159-170 SEQ ID NO:1, заменена любой другой аминокислотой.

В другом осуществлении изобретения полипептид фактора VII представляет собой полипептид, в котором, по меньшей мере, одна аминокислота, соответствующая аминокислоте в положении, выбранном из 290-304 SEQ ID NO:1, заменена любой другой аминокислотой.

В другом осуществлении изобретения полипептид фактора V-II представляет собой полипептид, в котором R304 заменена аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из Туг, Phe, Leu и Met.

В другом осуществлении изобретения полипептид фактора VII представляет собой полипептид, в котором, по меньшей мере, одна аминокислота, соответствующая аминокислоте в положении, выбранном из 306-312 SEQ ID NO:1, заменена любой другой аминокислотой.

В другом осуществлении изобретения полипептид фактора VII представляет собой полипептид, в котором М306 заменена аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из Asp и Asn.

В другом осуществлении изобретения полипептид фактора VII представляет собой полипептид, в котором D309 заменена аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из Ser и Thr.

В другом осуществлении изобретения полипептид фактора VII представляет собой полипептид, в котором, по меньшей мере, одна аминокислота, соответствующая аминокислоте в положении, выбранном из 330-339 SEQ ID NO:1, заменена любой другой аминокислотой.

В другом осуществлении изобретения полипептид фактора VII представляет собой полипептид, в котором А274 заменена любой другой аминокислотой.

В другом осуществлении изобретения полипептид фактора VII представляет собой полипептид, в котором А274 заменена аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из Met, Leu, Lys и Arg.

В другом осуществлении изобретения полипептид фактора VII представляет собой полипептид, в котором К157 заменена аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из Gly, Val, Ser, Thr, Asn, Gln, Asp и Glu.

В другом осуществлении изобретения полипептид фактора VII представляет собой полипептид, в котором указанная К337 заменена аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из Ala, Gly, Val, Ser, Thr, Asn, Gln, Asp и Glu.

В другом осуществлении изобретения полипептид фактора VII представляет собой полипептид, в котором указанная D334 заменена аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из Gly и Glu.

В другом осуществлении изобретения полипептид фактора VII представляет собой полипептид, в котором указанная S336 заменена аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из Gly и Glu.

В другом осуществлении изобретения полипептид фактора VII представляет собой полипептид, в котором указанная V158 заменена аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из Ser, Thr, Asn, Gln, Asp и Glu.

В другом осуществлении изобретения полипептид фактора VII представляет собой полипептид, в котором указанная Е296 заменена аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из Arg, Lys и Val.

В другом осуществлении изобретения полипептид фактора VII представляет собой полипептид, в котором указанная М298 заменена аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из Lys, Arg, Gln и Asn.

В другом осуществлении изобретения полипептид фактора VII представляет собой полипептид, в котором указанная L305 заменена аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из Val, Tyr и Ile.

В другом осуществлении изобретения полипептид фактора VII представляет собой полипептид, в котором указанная L305 заменена Val.

В другом осуществлении изобретения полипептид фактора VII представляет собой полипептид, в котором аминокислота заменена отличной аминокислотой, которая может кодироваться полинуклеотидными конструкциями.

В другом осуществлении изобретения полипептид фактора VII представляет собой полипептид, в котором указанный полипептид является полипептидом фактора VII человека.

В другом осуществлении изобретения полипептид фактора VII представляет собой полипептид, в котором указанный полипептид является полипептидом фактора VIIa человека.

В другом осуществлении изобретения полипептид фактора VII представляет собой полипептид, в котором отношение активности указанного полипептида фактора VII к активности природного полипептида фактора VIIa, представленного в SEQ ID NO:1, составляет, по меньшей мере, приблизительно 1,25. В одном осуществлении отношение активности указанного полипептида фактора VII к активности природного полипептида фактора VIIa, представленного в SEQ ID NO:1, составляет, по меньшей мере, приблизительно 2,0. В другом осуществлении отношение активности указанного полипептида фактора VII к активности природного полипептида фактора VIIa, представленного в SEQ ID NO:1, составляет, по меньшей мере, приблизительно 4,0.

В другом осуществлении изобретения полипептид фактора VII представляет собой полипептид, в котором отношение активности указанного полипептида фактора VII к активности природного полипептида фактора VIIa, представленного в SEQ ID NO:1, составляет, по меньшей мере, приблизительно 1,25 при тестировании в тесте определения активности фактора VIIa. В одном осуществлении отношение активности указанного полипептида фактора VII к активности природного полипептида фактора VIIa, представленного в SEQ ID NO:1, составляет, по меньшей мере, приблизительно 2,0 при те