Способ проведения клинического и биохимического анализа биологических жидкостей

Способ проведения клинического и биохимического анализа биологических жидкостей

Реферат

Изобретение относится к биологии, медицине, ветеринарии и предназначено, в частности, для медицинских, санитарно-эпидемиологических и других аналитических лабораторий, проводящих иммунологические анализы биологических жидкостей, образцов окружающей среды и других образцов методами на основе агглютинации частиц латекса.

Изобретение может быть использовано для медицинской и ветеринарной диагностики, в частности для повышения эффективности проведения анализов биологических жидкостей, а именно крови, сыворотки, мочи и лимфатической жидкости, основанных на методах латекс-агглютинации.

Известен способ проведения иммунологического анализа биологических жидкостей на основе метода латексной агглютинации, состоящий в смешивании на поверхности плоского носителя одной или нескольких капель исследуемого образца с суспензией латексных частиц, сенсибилизированных антителами или антигенами, с последующим визуальным наблюдением формирования агрегатов («крупинок») латекса, агглютинирующего в присутствии определенных концентраций определяемого вещества (N. Engl. J. Med. 1958; 258 (15): 731-735).

Для традиционного метода («макровариант») в качестве носителя применяют специальные черные непрозрачные пластиковые карты, на которые латексная суспензия наносится капельницей в объеме около 50 мкл, а затем смешивается с таким же количеством образца (Инструкция для определения С-реактивного белка OOO фирмы ИМТЕК, Москва, Россия). На карты аналогично образцам также наносятся положительный и отрицательный контроли. Карты с образцами инкубируют в течение 2-3 мин при комнатной температуре, а затем результаты регистрируют визуальным наблюдением. Исследуемые образцы считаются положительными, если оператор видит формирование агглютината. Для того чтобы белые крупинки латексного агглютината были лучше заметны при визуальной регистрации, зоны нанесения образов и суспензии окрашиваются в черный цвет. Метод считается полуколичественным и предполагает получение информации о концентрации определяемого вещества путем приготовления серии разведений образца (титрования) и определения, в каком максимальном разведении образец регистрируется как положительный в данной реакции.

Для «микроварианта» метода в качестве носителя используют крышки от стандартных 96-ти луночных микропланшетов для иммуноферментного анализа или предметные стекла (Инструкция для определения ревматоидного фактора OOO фирмы ИМТЕК, Москав, Россия). Все остальные этапы проводятся также, как и в «макроварианте». В этом случае для одного анализа используется 10-20 мкл латекса и такое же количество образца и контролей. Этот способ выбран в качестве прототипа.

Недостатки существующего способа заключаются в следующем:

- используется визуальная регистрация результатов реакции, что приводит к субъективной оценке результатов. Данный способ регистрации может приводить к ошибкам, особенно для проб, содержащих определяемое вещество в концентрациях, близких к порогу чувствительности метода;

- отсутствует документирование результатов анализа, что не позволяет в сомнительных случаях или в случаях, связанных с необходимостью уточнения результатов из-за ошибок оператора, провести повторную регистрацию результатов постановки анализа;

- плохая приспособленность к серийным постановкам, так как образцы и контроля наносятся последовательно один за другим и на момент регистрации результатов при значительном количестве одновременно анализируемых образцов для разных образцов время инкубации существенно различается;

- относительно большой объем необходимой латексной суспензии (особенно в «макроварианте»), что приводит к значительной цене одного анализа.

В изобретении поставлена задача создать способ проведения и регистрации результатов агглютинационных анализов, который бы позволил уменьшить трудоемкость проведения анализа, снизить стоимость одного анализа, снизить количество необходимой для анализа биологической жидкости, обеспечить документирование и объективную регистрацию результатов анализа, обеспечить возможность высокопроизводительного серийного анализа.

Для достижения указанного выше результата в предложенном способе, используя блок распределения-смешивания реагентов и образцов, несколько микрокапель латексной суспензии и исследуемых образцов объемом менее 1 мкл помещают, а затем смешивают в геометрически определенных местах носителя в виде упорядоченной матрицы, а результат реакции регистрируют с помощью видеоцифрового устройства (сканер или анализатор на основе видеоцифровой камеры) и оценивают с помощью специализированной программы. Блок распределения-смешивания реагента и образцов состоит из микропланшета хранения и распределения латексной суспензии, микропланшета для хранения и распределения образцов и системы нанесения микрокапель с расположением их в виде матрицы с фиксацией геометрического положения на носителе. Система нанесения микрокапель представляет собой аппликатор с несколькими микростержнями (пинами), расположенными в определенном порядке, и позиционер носителя, обеспечивающий фиксированные относительные позиции носителя и аппликатора в момент переноса микрокапель с пинов на носитель.

Предлагаемый способ проведения агглютинационных иммунологических анализов биологических жидкостей осуществляют следующим образом.

Из микропланшета хранения и распределения латексной суспензии, погружая пины аппликатора в лунки с образцами, производят взятие капель латексной суспензии (объем капли зависит от площади поперечного сечения пина и составляет менее 1,0 мкл) и наносят капли на носитель с помощью позиционера. Из микропланшета для хранения и распределения образцов, погружая пины аппликатора в лунки с образцами, производят взятие капель образца (объем капли менее 1,0 мкл). Затем наносят с помощью позиционера капли образца на носитель так, чтобы каждая наносимая капля образца смешалась с каплей латексной суспензии, уже находящейся на носителе.

Носитель с располагающимися на нем в виде упорядоченной матрицы микрокаплями, содержащими смесь образца и латексной суспензии, инкубируют 2-3 мин и помещают в анализатор изображения. В анализаторе получают изображение носителя, а изображение каждой капли анализируется отдельно с помощью программы, которая фиксирует наличие или отсутствие агглютинации и дает возможность автоматической дискриминации положительных и отрицательных образцов.

Пример.

Серийное определение концентрации С-реактивного белка в образцах сыворотки крови.

Блок для сбора и хранения латексной суспензии и блок для сбора и хранения анализируемых образцов представляют собой 30-луночные планшеты с неглубокими круглыми лунками (глубина до 2 мм). В лунках одного планшета находится суспензия латексных частиц, сенсибилизированных антителами к С-реактивному белку. В другом планшете находятся индивидуальные образы сыворотки крови, в которых необходимо определить содержание С-реактивного белка, и контроли. Анализируемые образцы сыворотки крови и контроли заливают в лунки планшета с помощью стандартных микропипеток.

Аппликатор для распределения реагентов и образцов представляет собой матрицу из 30 пинов, расположенных в 5 рядов по 6 пинов в ряду. Расстояние между пинами составляет 4,5 мм.

Сначала пины аппликатора погружают в лунки планшета, содержащего латексную суспензию (чертеж, а). При извлечении их из лунок на каждом пине остается капля латексной суспензии объемом менее 1 мкл (чертеж, б). Затем пины приводят в соприкосновение с носителем (чертеж, в), в результате чего на носителе формируется геометрически фиксированная матрица микрокапель латексной суспензии с периодом расположения элементов 4,5 мм (чертеж, г).

Затем ту же операцию проводят, погружая пины другого аппликатора в лунки планшета с исследуемыми образцами и контролями (чертеж, д, е), и после соприкосновения с поверхностью носителя (чертеж, ж) в местах расположения микрокапель латексной суспензии производят несколько вращательных движений, смешивая оба реагента. Причем расположение образцов и контролей на носителе сохраняется точно таким же, как и в планшете, из которого они забирались (чертеж, з).

Через 2 минуты оценивают результаты реакции с помощью видеоцифрового устройства и специализированной программы.

Предлагаемый способ имеет следующие преимущества:

- с использованием видеоцифровой регистрации и компьютерной оценки результатов анализа повышается объективность метода;

- появляется возможность документирования и хранения результатов анализа в компьютере и в распечатанном виде;

- использование многопинового аппликатора позволяет проводить серийное определение, что существенно сокращает время проведения анализа;

- значительное уменьшение объема используемого латексного реагента существенно удешевляет анализ.

Способ проведения иммунологического анализа биологических жидкостей, характеризующийся тем, что аппликатор с микростержнями погружают в латексную суспензию, сенсибилизированную антителами, с взятием микрокапель латексной суспензии, эти микрокапли наносят на носитель в геометрически определенных местах в виде упорядоченной матрицы, затем другим аппликатором берут образцы биологической жидкости и наносят на тот же носитель так, чтобы образцы смешались с латексной суспензией, перемешивают и инкубируют 2-3 мин и помещают в видеоцифровое устройство для регистрации агглютинации.