Конъюгаты гаптен-носитель и их применение

Конъюгаты гаптен-носитель и их применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Предпосылки изобретения

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к областям медицины, здравоохранения, иммунологии, молекулярной биологии и вирусологии.

Область техники

Расстройства, связанные со злоупотреблением наркотиков, влекут за собой большое число специфических, хорошо известных последствий как криминальной, так и экономической значимости. К ним относятся смерть, различные заболевания, насилие, преступность, потеря работы, снижение производительности, разрушение дружеских и семейных отношений и распространение ВИЧ и других заболеваний, передаваемых половым путем. Экономические издержки в Соединенных Штатах от злоупотребления наркотиками (исключая табак) оценивались в 98 миллиардов долларов в 1992 году, это последний год, для которого имеются достоверные данные («The economic costs of alcohol and drug abuse in the United States-1992», National Institute on Drug Abuse). Эти издержки включают в себя преступления (59,1 миллиардов долларов), раннюю смертность (14,6 миллиардов долларов), ухудшение производительности/аварии на производстве (14,2 миллиарда долларов), социальное обеспечение (10,4 миллиардов долларов), здравоохранение (5,5 миллиардов долларов) и автомобильные аварии. Эти затраты прежде всего затрагивают правительство (46%), наркоманов и их семьи (44%). Очевидно, что злоупотребление наркотиками остается серьезной проблемой в обществе. Через три года после исследования, проведенного в 1992 году, в 1995, расходы, связанные со злоупотреблением наркотиками, были оценены NIDA в 110 миллиардов долларов.

По существу, злоупотребление наркотиками может оказывать пагубное влияние на человека, который их употребляет. Тем не менее, понятно, что свойство этих препаратов вызывать привыкание, является не только главной проблемой, связанной с применением таких препаратов, но и лежит в основе несостоятельности как лечения больных с лекарственной зависимостью, так и снижения распространения злоупотребления наркотиками в обществе.

Самым широко используемым препаратом в мире, вызывающим привыкание, является табак. Никотин, алкалоид, получаемый из листьев табака, является основным компонентом табака, вызывающим привыкание. В 1999 году количество курильщиков составляло 46,5 миллионов взрослого населения Соединенных Штатов. Курение сигарет является единственной основной причиной ранней смертности в Соединенных Штатах. По данным Centers for Disease Control and Prevention (CDC) в Соединенных Штатах ежегодно от курения умирает 430000 человек. Рак легких, сердечно-сосудистые заболевания, хроническое легочное заболевание и инсульт являются основными причинами смерти. Курение не только вредит самому курильщику, но также приводит к огромным социальным затратам. Предполагаемая медицинская помощь курильщикам в 1993 году составляла более 50 миллиардов долларов, а расходы, связанные со снижением производительности и уменьшением заработной платы вследствие нетрудоспособности, связанной с курением, оценивалась в 47 миллиардов долларов в год. Таким образом, суммарные экономические расходы, связанные со злоупотреблением никотина, больше, чем все расходы, связанные со злоупотребление всех типов наркотиков.

Несмотря на новейшие достижения в поведенческом лечении и фармакологической терапии, огромное количество курильщиков, пытающихся бросить курить, не смогут этого сделать (в качестве обзора смотри Fiore et al. (2000) Treating tobacco use and dependence, clinical practice guideline, US Department of Health and Human Services, Public Health Service). Препараты никотин-замещающей терапии являются одними из современных применяемых лекарственных средств либо в форме никотиновой жевательной резинки, ингалятора, назального спрея, либо в форме трансдермальных пластырей. Эффективность применения только трансдермальных пластырей была поставлена под сомнение при проведении клинических испытаний с плацебо-контролем и двойным контрольным испытанием (Joseph et al., N. Engl. J. Med. (1999), 340:1157-1158; Jorenby et al., N. Engl. J. Med. (1999) 340:685-691). Более того, побочные действия никотиновой жевательной резинки, такие как раздражение слизистой оболочки полости рта, боли в жевательных мышцах, расстройство пищеварения, тошнота, икота, парестезия и зуд, эритема, нарушения сна, желудочно-кишечные расстройства, сонливость, нервозность, головокружение и потливость, наблюдались и при использовании никотинового пластыря. Лечение антидепрессантом бупропионом может увеличивать 12-месячные уровни абстиненции приблизительно на 30% (Jorenby et al., supra).

Очевидно, что необходимы новые подходы к лечению и профилактике пристрастия к никотину и к другим наркотическим средствам. Стратегии иммунизации для изменения влияния наркотиков на поведенческие реакции являются целью исследований с 1974. И активная иммунизация с помощью морфина-6-гемисукцината-BSA, и пассивная иммунизация полученными антителами снижали самовведение героина у резус-обезьян (Bonese, et al. Nature 252:708-710 (1974); Killian, et al Pharmacol. Biochem. Behav. 9:347-352 (1978).) Было доказано, что иммунизация также эффективна при пристрастии к кокаину. Активная иммунизация снижала последующее введение кокаина у крыс (Carrera et al Nature 379:727-730 (1995), и было показано, что и активная, и пассивная иммунизации прекращают самостоятельное введение препарата (Fox et al. Nature Med 2:1129-1132 (1996)). В последнее время иммунизация конъюгатом GNC-KLH прекращала самовведение у крыс с пристрастием к кокаину (Carrera et al Proc. Nat. Acad Sci USA 97:6202-62061992 (2000)) и как иммунизация конъюгатом GND-KLH, так и введение моноклональных антител против кокаина блокировали эффекты кокаина (Carrera et al. Proc. Nat. Acad Sci USA 98:1988-1992 (2001).

Против фенциклидина (PCP) возникали антитела, и они демонстрируют эффективность в отношении снижения уровней PCP в мозге, уменьшая поведенческие реакции, и показывают подобную способность блокировать физиологические эффекты аналогов PCP (Hardin et al. J Pharmacol Exp Ther 285:1113-1122 (1998); Proksch et al. J. Pharmacol Exp Ther. 292:831-837 (2000)). У крыс также успешно возникали антитела против метамфетамина (Byrnes-Blake et al. Int Immunopharmacol 1:329-338 (2001)). В патенте США № 5256409 описана вакцина, содержащая белковый носитель, присоединенный к одному гаптену из класса препаратов десипрамина/имипрамина и другому гаптену из класса препаратов нортриптилина/амитриптилина.

Следовательно, в отношении наркотических препаратов могут возникать иммунные ответы, антитела могут блокировать действие наркотического средства, и на животных моделях было показано, что вакцинация эффективна в качестве общего подхода к лечению наркотической зависимости и пристрастия к наркотикам. Полагают, что возникновение иммунного ответа может блокировать действие лекарственного препарата путем предотвращения его проникновения в центральную нервную систему (Carrera et al. Nature 379:727-730 (1995). Уменьшая эйфорию, связанную с применением наркотического препарата, человек с пристрастием к наркотику больше не мотивирован на его употребление.

Так как эффект привыкания к наркотическим препаратам вызван их действием на головной мозг, антитела в сыворотке должны быть способны снижать поступление препарата в мозг. Cerny (WO 92/03163) была описана вакцина и иммуносыворотка для использования при злоупотреблении наркотиками. Вакцина состояла из гаптена, присоединенного к белковому носителю. Также было описано получение антител против наркотических средств и применение этих антител при детоксикации наркоманов.

Никотин, кокаин, героин и большинство препаратов, вызывающих наркозависимость, представляют собой гаптены, которые не являются иммуногенными. Присоединение гаптенов к белковым носителям обычно увеличивает их иммуногенность.

Было описано несколько различных никотиновых гаптенов, носителей и способов присоединения. Matsushita et al. (Biochem. Biophys. Res. Comm. (1974) 57, 1006-1010) и Castro et al. (Eur. J. Biochem. (1980) 104, 331-340) получили никотиновые гаптены, конъюгированные с альбумином бычьей сыворотки (БСА) через линкер в 6-положении никотина. С другой стороны, Castro et al. (Biochem. Biophys. Res. Commun. (1975) 67, 583-589) описали два никотин-альбуминовых конъюгата: N-сукцинил-6-амино-(+/-)-никотин-БСА и 6-(сигма-аминокапрамидо)-(+/-)-никотин-БСА. Noguchi et al. (Biochem. Biophys. Res. Comm. (1975) 83, 83-86) был получен никотин-БСА конъюгат с никотином, конъюгированным в 1-положении никотина. Langone et al. (Biochemistry (1973) 12, 5025-5030 и Meth. Enzymol. (1982) 84, 628-635) получили производное гаптена, O-сукцинил-3'-гидроксиметил-никотин, и конъюгировали его с альбумином бычьей сыворотки и гемоцианином лимфы моллюска. В соответствии с этими способами Langone et al. (supra), Abad et al, (Anal. Chem. (1993) 65, 3227-3231) синтезировали никотиновый гаптен, 3'-(гидроксиметил)никотин гемисукцинат, и присоединяли его к альбумину бычьей сыворотки для иммунизации мышей с получением моноклональных антител к никотину. Isomura et al. (J. Org. Chem. (2001) 66, 4115-4121) предложили способы синтеза никотиновых конъюгатов, присоединенных в 1'-положении никотина, которые связывали с гемоцианином лимфы моллюсков (KLH) и БСА. Конъюгат с KLH использовали для иммунизации мышей и для получения моноклональных антител против никотина. Svensson et al. (WO 99/61054) описали никотин-гаптены, конъюгированные посредством пиридинового кольца, и дополнительно описали никотин-гаптен, конъюгированный с KLH, и индукцию никотин-специфических IgG антител, используя такие конъюгаты. Если введение проводили в присутствии полного адъюванта Фрейнда, то измеренные никотин-специфические ELISA титры составляли от 1:3000 до 1:15500, тогда как в отсутствии адъюванта Фрейнда измеренные титры были от 1:500 до 1:3000. Ennifar et al. (патент США № 6232082) описали никотиновые гаптены, присоединенные посредством пирролидинового кольца, и описали никотин-гаптен, конъюгированный с рекомбинантным экзотоксином A Psuedomonas aeruginosa (rEPA), и индукцию никотин-специфических IgG антител при введении конъюгатов в присутствии полного адъюванта Фрейнда. Swain et al. (патент США № 5876727) описали присоединение никотинового гаптена к БСА и индукцию никотин-специфических IgG антител у мышей при введение конъюгатов в смеси с полным адъювантом Фрейнда.

Осуществление вакцинации против никотина было показано в принципе (Hieda et al., J. Pharm. Exp. Ther. (1997) 288, 1076-1081; Hieda et al., Psychopharm. (1999), 143, 150-157; Hieda et al., Int. J. Immunopharm. (2000) 22, 809-819; Pentel et al., Pharm. Biochem. Behav. (2000), 65, 191-198, Malin et al., Pharm. Biochem. Behav. (2001), 68, 87-92). Ковалентные конъюгаты никотина и KLH или rEPA получали и вводили мышам или крысам в присутствии полного адъюванта Фрейнда, и индуцировали никотин-специфические IgG антитела. Эффективность вакцинации была показана несколькими различными путями. После введения никотина наибольшее количество никотина оставалось связанным в сыворотке, и концентрации никотина были ниже в мозге крыс из групп, иммунизированных никотином-KLH или никотином-rEPA, по сравнению с контрольной группой, иммунизированной только носителем. Иммунизация также снижала психофармакологическую активность, связанную с никотином, поскольку иммунизированные животные также были менее восприимчивы к действию никотина на локомоторную активность, высвобождение допамина (Svensson et al. WO 99/61054) и наблюдалось уменьшение симптомов отмены никотина.

Вышеописанный уровень техники демонстрирует эффективность композиций вакцин, содержащих полный адъювант Фрейнда, для индукции иммунных ответов против никотина. Полный адъювант Фрейнда является одним из наиболее сильных доступных адъювантов, однако из-за своих побочных эффектов он не разрешен к применению у человека. Таким образом, существует необходимость в создании композиций вакцин, способных вызывать устойчивые иммунные ответы против никотина без применения полного адъюванта Фрейнда. Более того, так как БСА успешно использовался в качестве носителя на животных моделях, он может не подходить для применения в композициях вакцин человека из-за риска возникновения побочных эффектов, таких как риск передачи прионного заболевания (вариантом является болезнь Крейтцфельда-Якоба). Другой проблемой разработки эффективной вакцины против никотина является необходимость в иммунном ответе, способном быстро снизить доступность никотина для абсорбирования мозгом. Никотин сигарет поглощается на поверхности слизистой оболочки, особенно рта и легких и переносится кровью в мозг. Если никотин-специфические антитела успешно снижают передачу никотина в мозг, они должны будут компенсировать очень высокую артериальную концентрацию никотина, которая передается в мозг в течение нескольких секунд при вдохе (Hieda et al., 1999, supra). Следовательно, необходимы высокие концентрации никотин-специфических антител в крови, которые, главным образом, представляют собой подтип IgG. На поверхности слизистой оболочки в основном находятся антитела подтипа IgA. Таким образом, кроме антител в крови, никотин-специфические антитела подтипа IgA в легких могли бы быть эффективными для нейтрализации никотина, вдыхаемого во время курения до начала его циркулирования в крови.

Холерный токсин, известный в данной области как белковый носитель, может индуцировать антитела IgA, в частности, после интраназального введения. Холерный токсин также может действовать как адъювант, устраняя необходимость в полном адъюванте Фрейнда в композиции вакцины. Однако при введении холерного токсина в качестве адъюванта слизистой он преимущественно стимулирует иммунный ответ T_H2-типа, увеличивая уровни интерлейкина-4 и объединяя увеличения до уровней общих и специфических IgE антител (Yamamoto et al., (1997) Proc. Natl. Acad. Sci USA 94, 5267-5272). После назальной иммунизации в присутствии холерного токсина в легких мышей развиваются IgE-связанные воспалительные реакции (Simecka et al., (2000) Infect. Immunol. 68, 672-679, Hodge et al., (2001) Infect. Immunol., 69, 2328-2338). Несмотря на перспективу назальной иммунизации в присутствии холерного токсина, также существует возможность развития побочных иммунопатологических реакций, характеризующихся воспалением дыхательных путей (Hodge et al., (2001) Infect. Immunol., 69, 2328-2338).

Следовательно, существует необходимость в системе носителей, способной стимулировать иммунные ответы против гаптена, не используя токсические адъюванты, не используя недостаточно толерантные белковые носители и, в определенных ситуациях, не стимулируя потенциально патологические T_H2 иммунные ответы. Новые системы носителей, удовлетворяющие этим требованиям, могут применяться для создания новых конъюгатов и композиций, подходящих для лечения наркомании, наряду с другими состояниями, крайняя необходимость в которых существует в настоящее время.

Краткое описание изобретения

Заявителями было обнаружено, что гаптены, присоединенные к коровым частицам, что ведет к образованию высокоупорядоченных и повторяющихся гаптеновых матриц, неожиданно являются эффективными для индукции иммунных ответов, в частности антител против гаптенов. Коровые частицы, содержащие первый сайт присоединения, и гаптены, содержащие второй сайт присоединения, связаны посредством указанного первого и второго сайтов присоединения с образованием указанных упорядоченных и повторяющихся гаптеновых матриц. Взаимодействие между первым и вторым сайтами может быть непосредственным или может вовлекать, по крайней мере, одну другую молекулу, например линкер.

В первом варианте осуществления первый сайт присоединения коровых частиц является природным. Альтернативно, первый сайт присоединения вводят путем химической реакцией присоединения или с помощью рекомбинантных способов. Предпочтительные первые сайты присоединения включают в себя аминогруппы, карбоксильные группы или сульфгидрильные группы. Предпочтительные аминокислотые, составляющие первый сайт присоединения, выбраны из лизина, аргинина, цистеина, аспартата, глутамата, тирозина и гистидина. Особенно предпочтительными являются лизиновые остатки.

Подходящие вторые сайты присоединения на гаптенах представляют собой амины, амиды, карбоксильные и сульфгидрильные группы. Существует большое разнообразие соединений, которые были разработаны для создания перекрестных связей пептидов/белков или конъюгации белка для модификации молекул путем образования ковалентной связи с реакционно-способной группой белковой молекулы коровой частицы.

Коровые частицы с первым сайтом присоединения по данному изобретению включают в себя любую частицу, подходящую для образования упорядочных повторяющихся матриц. В некоторых вариантах осуществления такие коровые частицы включают в себя вирусоподобные частицы (VLP), бактериофаги, вирусоподобные частицы бактериофагов, фимбрии и тому подобное. В конкретных вариантах осуществления ими являются VLP HbcAg, VLP бактериофага и фимбрии типа I. Данное изобретение также относится к различным формам коровых частиц, которые сохраняют способность образовывать упорядоченные повторяющиеся структуры. Различные формы включают в себя рекомбинантные, и природные формы, и мутантные формы коровых частиц. В определенных вариантах осуществления мутантные формы коровых частиц включают в себя такие формы, у которых тип первого сайта присоединения или число указанных сайтов отличается от родительского. Особенно предпочтительным является изменение числа лизиновых остатков на коровой частице.

В определенных вариантах осуществления конъюгаты по данному изобретению включают в себя гаптены, способные индуцировать иммунный ответ против различных молекул, включая, но ими не ограничиваясь, токсины, гормоны и препараты. Более предпочтительными являются препараты, и еще более предпочтительным являются препараты, вызывающие привыкание, или наркотики. Гаптены по данному изобретению содержат второй сайт присоединения для присоединения к первому сайту присоединения коровой частицы либо непосредственно, либо посредством, по крайней мере, одной связывающей молекулы. В одном из вариантов осуществления гаптен способен индуцировать иммунные ответы против кокаина, например сукцинилированного норкокаина.

Предпочтительными вариантами осуществления данного изобретения являются никотин-гаптеновые конъюгаты. Никотиновые гаптены, которые могут применяться в конъюгатах по настоящему изобретению, могут иметь, по крайней мере, одну и предпочтительно одну боковую цепь, присоединенную к любому положению либо на пиридиновом, либо на пирролидиновом кольце никотина. Специалисту в данной области известно, как получить подходящие производные никотиновых гаптенов. Например, никотин может быть химически модифицирован с получением гидроксильной группы в 3'-положении, которая подходит для взаимодействия с агентами, такими как ангидрид янтарной кислоты с получением O-сукцинил-3'-гидроксиметилникотина. Это производное никотина можно присоединить к аминокислотам коровых частиц, таким как лизин, используя активирующий агент EDC. В дополнительном предпочтительном варианте осуществления, О-сукцинил-3'-гидроксиметилникотин может быть активирован с помощью EDC, и полученная активированная карбоксильная группа стабилизирована с помощью N-гидроксисукцинимида. В других вариантах воплощения гаптены получают путем ацилирования норникотина с помощью ангидрида янтарной кислоты в метиленхлориде в присутствии двух эквивалентов диизопропилэтиламина. Такой никотиновый гаптен затем присоединяют к коровым частицам по настоящему изобретению с помощью активирующего агента, например HATU. В данном изобретении представлены другие способы и методы синтеза гаптенов, применяемых в конъюгатах и композициях по данному изобретению.

Настоящее изобретение относится к композициям, содержащим коровую частицу и гаптен, которые могут применяться для индукции иммунных ответов. Композиции по данному изобретению включают в себя композиции вакцин, вместе или в отсутствие дополнительных фармацевтически приемлемых наполнителей или адъювантов. Также представлены способы иммунизации. Более предпочтительно способы интраназальной иммунизации.

Композиции по данному изобретению индуцируют иммунные ответы, включая продукцию антител. Следовательно, в еще одном варианте осуществления данное изобретение относится к способу получения указанных антител против таких гаптенов. Такие антитела по данному изобретению могут быть эффективны при лечении или профилактике заболеваний и для определения гаптенов, например, в способах диагностики заболеваний или заболеваний, связанных с присутствием одного или несколько гаптенов в тканях или в циркулирующих жидкостях у животных.

В связанном варианте осуществления данное изобретение может использоваться для профилактики или лечения заболеваний, расстройств или состояний, которые включают в себя, но ими не ограничиваются, отравление токсинами, патологическое нарушение уровней гормонов, интоксикацию лекарственными средствами или наркоманию и тому подобное. Иммунизация конъюгатами гаптен-носитель по данному изобретению приводит к иммунному ответу против гаптена, так что иммунные молекулы, в частности антитела, связывают гаптены. Пассивный перенос антител также может использоваться для лечения и профилактики заболеваний. Лечение наркомании также может использоваться для лечения других заболеваний и состояний, связанных с наркоманией.

Заявителями было обнаружено, что конъюгаты никотин-гаптен, присоединенные к вирусоподобным частицам, индуцируют высокие титры никотин-специфических антител IgG. Настоящее изобретение, следовательно, относится к терапии никотинозависимости, основанной на упорядоченном и повторяющемся конъюгате VLP-никотин. При этом лечении способны индуцироваться высокие титры антител против никотина у вакцинированных животных. Высокие титры антител индуцируются даже в отсутствие адъювантов и содержат не только IgG, но также подтипы IgA. Более того, это лечение неожиданно не связано с индукцией потенциально патологических иммунных ответов, таких как воспаление. Терапевтические композиции по данному изобретению включают в себя, по крайней мере, одну молекулу никотинового гаптена и VLP, или, по крайней мере, один никотиновый гаптен и другую коровую частицу, такую как HbcAg или фимбрию.

Таким образом, данное изобретение относится к способам лечения и профилактики, которые заключаются в применении конъюгатов и композиций по данному изобретению. Такие способы могут использоваться для лечения и профилактики заболеваний, расстройств и состояний, связанных с препаратами, гормонами и токсинами.

В дополнительном варианте осуществления данного изобретения фармацевтическая композиция предназначена для лечения никотиновой зависимости, уменьшения симптомов отмены никотина, облегчения отвыкание от курения или препятствует рецидиву и включает терапевтически эффективное сочетание композиции вакцины по данному изобретению и дополнительного агента. В одном из вариантов осуществления дополнительный агент выбран из группы, состоящей из: антидепрессанта; модулятора рецептора никотина; антагониста каннабиноидного рецептора; антагониста опиоидного рецептора; ингибитора моноаминоксидазы; анксиолитика или любого сочетания этих агентов.

Другими вариантами осуществления данного изобретения являются наборы, которые могут использоваться для диагностики и скрининга, в которых применяются конъюгаты, композиции и способы по настоящему изобретению. Другие варианты осуществления настоящего изобретения будут понятны специалисту в свете знаний в данной области, нижеследующих рисунков и описания данного изобретения и формулы изобретения.

Краткое описание рисунков

На фиг.1 изображена картина электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия и анализ Вестернблот конъюгатов Nic-Qβ. Производное никотина Suc-Nic присоединяли к Qβ при различных концентрациях (1x, 5x, 50x, 100x и 500x молярный избыток). Аликвоты реакционных растворов помещали на 16% полиакриламидный гель с додецилсульфатом натрия и окрашивали Кумасси синим (A). Из параллельных дорожек геля белки переносили на нитроцеллюлозу и определяли, используя антисыворотку против никотин-холерного токсина и затем козлиные антитела, конъюгированные с HRPO, направленные против мышиных IgG, регистрацию ECL (B). Маркеры молекулярной массы даны на левом крае.

На фиг.2 показан титр никотин-специфических IgG. Сыворотку вакцинированных мышей исследовали на реакционную способность против никотина, присоединенного к БСА, с помощью ELISA. Оптическую плотность при 450 нм получали для каждой серии разведений. Титры были рассчитаны из разведений, которые давали половину максимальной оптической плотности. Показано среднее значение для трех мышей в каждой группе.

На фиг.3 показаны никотин-специфические IgG подтипы. Сыворотку вакцинированных мышей исследовали на реакционную способность против никотина, присоединенного к БСА, с помощью ELISA и обнаруживали с помощью вторичных антител, специфичных для IgG подтипов IgG1 (A), IgG2a (B), IgG2b (C) и IgG3 (D). Показана оптическая плотность при 450 нм, полученная для каждой серии разведений. Показано среднее значение для трех мышей в каждой группе.

На фиг.4 показаны никотин-специфические IgE антитела. Сыворотку вакцинированных мышей исследовали на реакционную способность против никотина, присоединенного к БСА, с помощью ELISA и обнаруживали с помощью вторичных антител, специфичных для подтипа IgE. Показана оптическая плотность при 450 нм, полученная для каждой серии разведений. Показано среднее значение для трех мышей в каждой группе.

На фиг.5 показаны никотин-специфические антитела IgA. Сыворотку вакцинированных мышей исследовали на реакционную способность против никотина, присоединенного к БСА, с помощью ELISA и обнаруживали с помощью вторичных антител, специфичных для подтипа IgA. Показана оптическая плотность при 450 нм, полученная для каждой серии разведений. Показано среднее значение для трех мышей в каждой группе.

На фиг.6 A и B показана эффективность никотин-VLP вакцинации. Мышей иммунизировали никотин-VLP и концентрации никотина в сыворотке и мозге измеряли после инъекции 3H-никотина. Показано среднее значение для трех мышей в каждой группе.

Подробное описание изобретения

Следует учесть, что как вышеуказанное общее описание, так и нижеследующее подробное описание приведены только в качестве примера и пояснения и предназначены для дополнительного объяснения заявленного изобретения.

Определения

Следующие определения представлены в виде понятий, хорошо известных специалисту в данной области, и предназначены для полного понимания следующего изобретения, но не служат для ограничения данного изобретения.

Адъювант: Используемый здесь термин «адъювант» относится к неспецифическим стимуляторам иммунного ответа или веществам, которые создают депо у хозяина, которые при объединении с вакциной и фармацевтической композицией, соответственно, по настоящему изобретению могут давать более сильный иммунный ответ. Может использоваться большое разнообразие адъювантов. Примеры включают в себя полный и неполный адъювант Фрейнда, гидроксид алюминия и модифицированный мурамилдипептид. Другими адъювантами являются неорганические гели, такие как гидроксид алюминия, поверхностно-активные вещества, такие как лизолецитин, плюрониловые полиоли, полианионы, пептиды, масляные эмульсии, гемоцианины лимфы молюсков, динитрофенол и потенциально эффективные адъюванты человека, такие как BCG (бацилла Кальмета-Герена) и Corynebacterium parvum. Такие адъюванты также хорошо известны в данной области. Кроме того, адъюванты, которые могут вводиться вместе с композициями по данному изобретению, включают в себя, но ими не ограничиваются, иммуномодулятор монофосфорил липид, AdjuVax 100a, QS-21, QS-18, CRL1005, соли алюминия (Alum), MF-59, OM-174, OM-197, OM-294 и виросомальные адъювантные технологии. Адъюванты также могут содержать смеси этих веществ.

Иммунологически активные сапониновые фракции, обладающие адъювантной активностью, получали из коры дерева Quillaja Saponaria Molina родом из Южной Америки, хорошо известного в данной области. Например, QS21, также известный как QA21, является очищенной с помощью ВЭЖХ фракцией, полученной из дерева Quillaja Saponaria Molina, и способ ее получения описан (как QA21) в патенте США № 5057540. Сапонины Quillaja также были описаны в качестве адъюванта Scott et al., Int. Archs. Allergy Appl. Immun., 1985, 77, 409. Моносфорил липид A и его производные хорошо известны в данной области. Предпочтительным производным является 3 де-o-ацилированный монофосфорил липид A. Более предпочтительные адъюванты описаны в WO 00/00462, описание которого приводится здесь в качестве ссылки.

Тем не менее, преимуществом настоящего изобретения является высокая иммуногенность композиций по данному изобретению. Как уже отмечалось здесь или станет очевидно из данного подробного описания, в дополнительных альтернативных или предпочтительных воплощениях представлены вакцины и фармацевтические композиции, лишенные адъювантов, что ведет к вакцинам и фармацевтическим композициям для лечения наркомании, предпочтительно зависимости от никотина, свободным от адъювантов и, таким образом, обладающим большими свойствами безопасности, так как адъюванты могут вызывать побочное действие. Использующийся здесь термин «свободные» в контексте вакцин и фармацевтических композиций для лечения наркомании предпочтительно зависимости от никотина, относятся к вакцинам и фармацевтическим композициям, которое применяются без адъювантов.

Животные: Как используется здесь, к термину «животное» относятся, например, люди, овцы, лоси, олени, чернохвостый олень, норки, млекопитающие, обезьяны, лошади, крупный рогатый скот, свиньи, козы, собаки, кошки, крысы, мыши, птицы, куры, рептилии, рыбы, насекомые и пауки.

Антитела: Как используется здесь, термин «антитела» относится к молекулам, которые способы связывать эпитоп или детерминант антигена. К этому термину относятся целые антитела и их антиген-связывающие фрагменты, включая антитела с одной цепью. Наиболее предпочтительно антителами являются антиген-связывающие фрагменты антител человека и включают в себя, но ими не ограничиваются, Fab, Fab' и F(ab')₂, Fd, Fvs (scFv) с одной цепью, антитела с одной цепью, Fvs (sdFv), связанные дисульфидным мостиком, и фрагменты, содержащие либо V_L, либо V_Н домен. Антитела могут быть от любого животного, включая птиц и млекопитающих. Предпочтительно антитела являются антителами млекопитающих, например человека, мыши или крысы, кролика, козла, морской свинки, верблюда, лошади и тому подобное, или других подходящих животных, например цыпленка. Как используется здесь, антитела «человека» включают в себя антитела, содержащие аминокислотную последовательность человеческого иммуноглобулина, и к ним относятся антитела, выделенные из библиотек иммуноглобулинов человека или из животных, трансгенных по одному или нескольким иммуноглобулинам человека, и которые не экспрессируют эндогенные иммуноглобулины, как описано, например, в патенте США № 5939598, описание которого приведено здесь в качестве ссылки в полном объеме.

Активная иммунизация: Как используется здесь, термин «активная иммунизация» относится к индукции иммунного ответа у субъекта, обычно у животного, вызываемой путем введения иммуногена, вакцины, антигена или конъюгата гаптен-носитель. Наоборот, пассивная иммунизация относится к предоставлению иммунитета субъекту путем введения иммунных молекул или клеток указанному субъекту.

Альфавирус: Как используется здесь, термин «альфавирус» относится к любым РНК-содержащим вирусам, относящимся к роду Alphavirus. Описание членов этого рода содержится в Strauss and Strauss, Microbiol Rev., 55:491-562 (1994). Примеры альфавирусов включают в себя вирус Aura, вирус Bebaru, вирус Cabassou, вирус Чукунгунской лихорадки, вирус восточного лошадиного энцефаломиелита, вирус Fort morgan, вирус Гета, вирус Kyzylagach, вирус Mayoaro, вирус Middleburg, Mucambo вирус, вирус Ndumu, вирус Pixuna, вирус Tonate, вирус Triniti, вирус Una, вирус западного лошадиного энцефаломиелита, вирус Whataroa virus, вирус Синдбис (SIN), вирус лихорадки Семлики (SFV), вирус венесуэльского лошадиного энцефаломиелита (VEE) и вирус Ross River.

Антиген: Как используется здесь, термин «антиген» относится к молекуле, способной связываться антителом или рецептором T-клетки (TCR), если он презентирован молекулами MHC. Антиген, кроме того, способен распознаваться иммунной системой и/или способен индуцировать гуморальный иммунный ответ и/или клеточный иммунный ответ, что приводит к активации B- и/или T-лимфоцитов. Однако, по крайней мере, в некоторых случаях, может потребоваться, чтобы антиген содержал или был связан с эпитопом Т_х-клетки и предоставлялся в адъюванте. Антиген может иметь один или несколько эпитопов (эпитопы B- и/или T-клеток). Под вышеуказанными специфическими реакциями понимают, что антиген будет предпочтительно взаимодействовать, обычно высокоселективно, с соответствующим ему антителом или TCR, а не с множеством других антител или TCR, которые могут быть вызваны другими антителами. Антигены, как используется здесь, также могут быть смесями нескольких отдельных антигенов.

Детерминант антигена: Как используется здесь, под термином «детерминант антигена» понимают часть антигена, которая специфически распознается либо B-, либо T-лимфоцитами. B-лмфоциты, отвечающие на антигенные детерминанты, продуцируют антитела, тогда как T-лимфоциты отвечают на антигенные детерминанты путем пролиферации и обеспечивают эффекторную функцию, опосредуя клеточный и/или гуморальный иммунитет.

Ассоциация: Как используется здесь, термин «ассоциация», применяемый к первому и второму сайтам присоединения, относится к соединению первого и второго сайтов присоединения, которое, предпочтительно, происходит с помощью, по крайней мере, одной непептидной связи. Природа ассоциации может быть ковалентной, ионной, гидрофобной, полярной или любым их сочетанием, предпочтительно природа ассоциации является ковалентной.

Сайт присоединения, первый: Как используется здесь, фраза «первый сайт присоединения» относится к элементу коровой частицы, с которым может ассоциироваться второй сайт присоединения, расположенный на антигене или детерминанте антигена. Первый сайт присоединения может быть белком, полипептидом, аминокислотой, пептидом, сахаром, полинуклеотидом, природным или синтетическим полимером, вторичным метаболитом или соединением (биотин, флуоресцеин, ретинол, дигоксигенин, ионы металла, фенилметилсульфонилфторид) или их сочетанием, или их химически активной группой. Разнообразные первые сайты присоединения присутствуют на поверхности неприродного молекулярного каркаса в повторяющейся конфигурации.

(a) Сайт присоединения, второй: Как используется здесь, фраза «второй сайт присоединения» относится к элементу, ассоциированному с гаптеном, с которым может ассоциировать первый сайт присоединения на поверхности неприродного молекулярного каркаса. Второй сайт присоединения гаптена включает в себя любую химическую группу, предпочтительно амин, амид, карбоксил, сульфгидрил, гидроксил, альдегид, ацилгалогенид, гидразин, диазоний или гидразид, или, кроме того, химические группы способны специфически взаимодействовать с первым сайтом присоединения. Более того, второй сайт присоединения может включать в себя полипептид, пептид, сахар, полинуклеотид, природный или синтетический полимер, вторичный метаболит или соединение (биотин, флуоресцеин, ретинол, дигоксигенин, ионы металла, фенилметилсульфонилфторид), их сочетание или их химически активную группу. На гаптене присутствует, по крайней мере, один второй сайт присоединения. Следовательно, термин «гаптен с, по крайней мере, одним вторым сайтом присоединения» относится к гаптеновой конструкции, содержащей, по крайней мере, гаптен и второй сайт присоединения. Однако, в частности, в случае, когда второй сайт присоединения гаптена не является природным, тогда такие гаптены содержат линкер, который связывает гаптен со вторым сайтом присоединения, или более предпочтительно уже содержит или имеет в своем составе второй сайт присоединения.

Связь: Как используется здесь, термин «связь» относится к связыванию или присоединению, которое может быть ковалентным, например, путем химического присоединения, или нековалентным, например ионные взаимодействия, гидрофобные взаимодействия, водородные связи и тому подобное. Ковалентные связи могут быть, например, сложноэфирной связью, эфирной, фосфоэфирной, амидной, пептидной, имидной связями, связями углерод-сера, углерод-фосфор и тому подобное. Термин «связь» шире и включает в себя термины, такие как «соединение», «конденсирование» и «присоединение».

Коровая частица: Как исполь