Молочная питательная среда для получения биомассы бактерий-пробиотиков

Молочная питательная среда для получения биомассы бактерий-пробиотиков

Реферат

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в микробиологической, пищевой промышленности и касается приготовления питательных сред для культивирования бифидо- и лактобактерий с целью получения биомассы микроорганизмов и дальнейшего ее использования в производстве заквасок для лечебно-профилактических продуктов, а также для производства биологически активных добавок (БАД).

В настоящее время продукты и биологически активные добавки с пробиотическими микроорганизмами занимают ведущее место в комплексе мер, направленных на профилактику и коррекцию нарушений микрофлоры. Значимость пробиотических препаратов и продуктов диктует необходимость разработки новых эффективных недорогих производственных питательных сред для наработки микробной массы. В производстве биологически активных добавок с пробиотиками, а также лечебно-профилактических продуктов и заквасок для них важной является разработка питательной основы для пробиотических микроорганизмов. Такая основа должна включать все основные компоненты, соответствующие потребностям бактерий. Культивирование в такой среде должно способствовать, как минимум, сохранению пробиотических свойств микроорганизмов. Производственная питательная среда должна обеспечивать высокую скорость размножения: для лактобактерий до 5-7 часов и для бифидобактерий до 18 часов, высокую концентрацию жизнеспособных микробных клеток в единице объема среды - не менее 1·10¹⁰ КОЕ/мл, высокую сохранность жизнеспособных микробных клеток - не менее 70-90 суток.

Питательные потребности молочнокислых бактерий весьма разнообразны и связаны с биохимической активностью микроорганизмов. По мере обогащения среды белком повышается способность бактерий сбраживать лактозу, добавление пептонов и пептидов (продукты гидролиза белка) усиливает рост молочнокислых бактерий в значительно большей степени, чем аминокислоты. Следует отметить, что количество аминокислот, требуемое различными молочнокислыми бактериями, непостоянно и зависит от потребностей штаммов. Бифидобактериям больше всего требуются аминокислоты: пролин, серин, аланин, аспарагиновая и глутаминовая кислоты. Обладая некоторой протеолитической активностью, бифидобактерии могут в небольшой степени дополнительно обеспечить свои потребности в азотистых веществах.

Все питательные вещества в среде должны находиться в легкоусвояемой форме, белки, в частности, в форме гидролизатов, автолизатов. В ряде случаев несовершенная технология получения белковых гидролизатов и автолизатов может привести к появлению в их составе значительного количества пептидов высокой молекулярной массы, аммиака, а также окрашенных примесей, образовавшихся за счет деструкции лабильных аминокислот и взаимодействия с альдегидами. Наличие этих компонентов в среде существенно уменьшает питательную эффективность. Качество белковых гидролизатов в значительной степени обусловливается выбранным способом проведения гидролиза, обеспечивающим требуемую глубину гидролиза, и степенью последующей очистки получаемого гидролизата.

Для наращивания биомассы используются питательные среды различного состава. Известен состав питательной среды для роста бифидо- и лактобактерий, представляющий собой гидролизат молока, в который введены в качестве добавок пептон, хлорид натрия, агар-агар, лактоза, цистеин солянокислый, при следующем соотношении компонентов (Инструкция по приготовлению кисломолочного бифидумбактерина на молочных кухнях. - М.: МЗ РСФСР, 1987, - 11 с.), г/л:

Пептон	2,0
Хлорид натрия	5,00
Агар-агар	0,75
Лактоза	10,00
Цистеин солянокислый	0,10
Гидролизат молока	остальное.

Данный состав находит применение в практике для роста бифидо- и лактобактерий.

Однако наряду с дорогой основой - гидролизатом молока он содержит и дорогие добавки, такие как пептон, цистеин солянокислый. Кроме того, данный состав является недостаточно эффективной питательной средой для выращивания бифидо- и лактобактерий.

Известна питательная среда для наращивания биомассы бифидобактерий и лактобактерий на основе гидролизата гороха при следующем соотношении компонентов (Патент РФ №2061037, МПК С12N 1/20, опубл. 27.05.96 г), мас.%:

Пептон	0,15-0,25
Натрий хлористый	0,2-0,4
Агар-агар	0,075-0,1
Лактоза	0,5-2,0
Гидролизат гороха, разведенный водой до
содержания аминного азота 130-150 мг %	остальное до 100%.

Приведенный состав имеет низкое содержание низкомолекулярных пептидов и аминокислот (Аминный азот 130-150 мг%), поэтому не обеспечивает наработку биомассы высокой концентрации - не более 10⁸ КОЕ/мл. При этом время наращивания микробной массы (не менее 24 часов), титруемая кислотность и сроки сохранности не соответствуют предъявляемым требованиям.

Известна также питательная среда для накопления биомассы бактерий на основе молочной сыворотки при следующем соотношении компонентов (Патент РФ №2087532, МПК С12N 1/20, опубл. 20.08.97 г), мас.%:

Молочная сыворотка осветленная	7,5-10,0
Лактоза	0,3-0,5
Дрожжевой автолизат	2,0-3,0
D, L-цистеин	0,05-0,1
NaH2PO4·2Н2O	0,7-0,8
NH4Cl	0,1-0,15
MgSO4·7H2O	0,015-0,020
Агар-агар	0,75-0,080
Вода	остальное
рН	7,2-7,4

Среда подобного состава, хотя и дает высокую скорость роста, не имеет достаточного количества питательных веществ (белков, пептидов, аминокислот) для длительной сохранности микробных клеток, что очень важно для препаратов и БАД-пробиотиков. Дополнительным эффектом высоких ростовых показателей является значительное повышение титруемой кислотности, негативно отражающееся на органолептических свойствах конечного продукта. Наличие дорогостоящих компонентов (агар-агар, цистеин) в производстве препаратов и БАД-пробиотиков приводит к повышению себестоимости конечного продукта.

Широко известна кукурузно-лактозная среда (КЛС) для культивирования бифидобактерий и молочнокислых бактерий (ТУ 10-02-02-789-192-95):

Агар-агар	2,5 г
Пептон	10 г
Кукурузный экстракт	40 мл
Натрий лимоннокислый	6,6 г
Магний сернокислый	0,12 г
Калий фосфорнокислый двузамещенный	2,0
Лактоза	10 г
Цистин солянокислый	0,15 г

Однако КЛС не содержит гидролизованных белковых компонентов молока или дрожжевых клеток, что не обеспечивает при культивировании длительных сроков сохранности конечного продукта. Наличие в составе среды нестандартного компонента - кукурузного экстракта обусловливает нестандартность самой среды, а также неудовлетворительные органолептические свойства получаемых БАД и заквасок.

Наиболее близким аналогом (прототипом) к заявляемой является молочная питательная среда для получения жидкого концентрата бифидобактерий, содержащая основу цистеин солянокислый (L-цистин), D(-)-лактозу, гидролизат молочных белков и аутолизат дрожжей и натрий хлористый. В качестве гидролизата молочных белков используют панкреатический гидролизат обрата молока, в качестве аутолизата дрожжей используют ферментативный аутолизат дрожжей, а в качестве основы используют нормализованный по сухому остатку обрат молока при суммарном содержании аминного азота в питательной среде 260-300 мг% при следующем соотношении ее компонентов, мас.% (патент РФ №2169763, МПК C12N 1/20, А61К 35/74, А23С 9/12, опубл. 27.06.2001 г.):

Панкреатический гидролизат обрата молока	5,0-7,0
Цистеин солянокислый (L-цистин)	0,001-0,003
D(-)-лактоза	0,03-0,09
Натрий хлористый	0,01-0,05
Ферментативный аутолизат дрожжей	1,0-2,0
Обрат молока (основа), нормализованный
по сухому остатку	Остальное до 100%.

В качестве ферментативного аутолизата дрожжей используют аутолизат с показателем аминного азота 350-400 мг%. Обрат молока нормализован по сухому остатку до значения 13,0-14%. Кроме того, в питательную среду дополнительно вносят соевый изолят в количестве по массе 0,2-0,3%. Для активизации соевого изолята в питательную среду дополнительно вводят цитрат натрия в количестве по массе 0,1-0,2%.

Однако панкреатический гидролизат белков обрата молока содержит наряду с высокомолекулярными и низкомолекулярными пептидами частично гидролизованный казеин и другие компоненты, которые плохо усваиваются бактериями, а ферментативный аутолизат дрожжей наряду с витаминами и стимулирующими факторами роста бактерий содержит токсические вещества - продукты ферментативного автолиза, которые не благоприятствуют условиям роста бактерий (Т.М.Эрвольдер, А.В.Гудков и Л.П.Семенова. Воздействие ферментативных гидролизатов на накопление биомассы бифидобактерий. Журн. "Молочная промышленность", N 12, 1980, - с.15-17), вследствие чего снижаются сроки и титр биомассы бифидо- и лактобактерий в процессе хранения.

Техническим результатом заявляемого изобретения является создание такой питательной среды, которая обеспечивала бы возможность культивирования как бифидобактерий, так и лактобактерий при более длительных сроках хранения и более высоких титрах биомассы бактерий в процессе хранения.

Указанный технический результат достигается тем, что в молочной питательной среде для получения биомассы бактерий-пробиотиков, содержащей основу в виде нормализованного по сухому остатку обрата молока, цистеин солянокислый (L-цистин) или аскорбиновую кислоту, гидролизат молочных белков и ростовые факторы из дрожжевых клеток, натрий хлористый, согласно изобретения среда дополнительно содержит марганец сернокислый MnSO₄·4H₂O и магний сернокислый MgSO₄·7Н₂О, в качестве гидролизата молочных белков используют ферментативный гидролизат сывороточных белков молока, в качестве ростовых факторов из дрожжевых клеток используют очищенный дрожжевой экстракт при следующем соотношении ее компонентов, мас.%:

ферментативный гидролизат сывороточных
белков молока	5,0-7,0
цистеин солянокислый (Ĺ-цистин)
или аскорбиновая кислота	0,001-0,002
натрий хлористый	0,03-0,05
марганец сернокислый MnSO4·4Н2О	0,001-0,005
магний сернокислый MgSO4·7H2O	0,01-0,02
очищенный дрожжевой экстракт	1,5-2,0
Обрат молока (основа), нормализованный
по сухому остатку	Остальное до 100%

Молочная питательная среда содержит очищенный дрожжевой экстракт с показателем аминного азота 2,1-2,8%, общего белка не менее 3-4%, ферментативный гидролизат сывороточных белков молока (лактопептон) с показателем общего белка не менее 11%, аминного азота не менее 4%, а обрат молока содержит лактозу в количестве не более 15% и нормализован по сухому остатку до значения 13,0-14,0%.

Суммарный аминный азот в питательной среде содержится в количестве не менее 300 мг.%.

Введение в основу среды ферментативного гидролизата (лактопептон) сывороточных белков молока (лактальбумин и лактоглобулин) обеспечивает обогащение ее смесью высокомолекулярными и низкомолекулярными пептидами, которые являются более эффективными стимуляторами роста бифидо- и лактобактерий, чем, например, панкреатический гидролизат белков (основной компонент - казеин) обрата молока. Сывороточные белки молока по аминокислотному составу близки к белкам женского молока. В сравнении с казеином они более легко подвергаются полному гидролизу, содержат незаменимые серусодержащие кислоты в количестве, соответствующем потребностям человека, в 4 раза больше содержат цистеина и в 19 раз больше триптофана и их использование более предпочтительно в производстве пробиотиков для детей.

Очищенный экстракт дрожжей содержит витамины группы В и стимулирующие факторы роста бифидобактерий, а также оптимальное содержание аминного азота, обеспечивающего наиболее благоприятные условия роста для бифидо- и лактобактерий, и по сравнению с ферментативным аутолизатом дрожжей не содержит токсичные продукты метаболизма дрожжей, угнетающие рост бактерий.

Ощутимое повышение качества дрожжевого экстракта достигается за счет совершенствования технологии его получения - происходит перевод в растворимое состояние 30-50% дрожжевого белка, повышение перевариваемости клеточного белка на 8-10% за счет разрыхления всех слоев клеточной стенки.

Дрожжевой экстракт содержит:

- незаменимые аминокислоты - лизин, метионин, глицин, аланин, гистидин, аспарагиновую кислоту, треонин, глутаминовую кислоту, валин и др.;

- витамины - рибофлавин (В₂), тиамин (В₁), пиридоксин (B₆), цианкобаламин (В₁₂), ниацин (РР);

- протекторные пептиды.

Компонентами, обеспечивающими редуцирующие свойства заявляемой среды, являются, в основном, цистеин или аскорбиновая кислота, а также аминокислоты глутамин и аспарагин, которыми богат очищенный экстракт дрожжей, входящий в состав среды.

Для обеспечения роста и развития молочнокислые бактерии нуждаются в неорганических соединениях, особенно в ионах марганца и ионах магния. Марганец препятствует аутолизу клеток и необходим для нормальных процессов жирового обмена. Mn⁺⁺ и Mg⁺⁺ снимают токсическое действие Zn⁺⁺ при наличии его в среде.

Изобретение позволяет получить высокий начальный титр и увеличить срок хранения без угнетения роста и повышения активной кислотности пробиотических препаратов, полученных с использованием предложенной питательной среды.

Недостаток готовых азотистых веществ в заявляемой питательной среде возмещается добавлением в обезжиренное молоко лактопептона (ферментативный гидролизат сывороточных белков молока) и дрожжевого экстракта. Сывороточные белки молока играют важную роль в наращивании биомассы пробиотических бактерий и формировании качества конечного продукта, поскольку имеют высокое содержание незаменимых и серосодержащих аминокислот. Белки молочной основы (в основном, казеин) характеризуются высокой биологической ценностью и уникальным набором аминокислот, что позволяет улучшить общую сбалансированность аминокислотного состава конечного продукта. Молоко содержит уникальный дисахарид - лактозу, которая оказывает благотворное влияние на состав нормофлоры кишечника. При нагревании молока, например при его стерилизации, лактоза превращается в лактулозу, которая является мощным бифидогенным фактором. В молоке содержится значительное количество макро- и микроэлементов, витаминов. Особенно важен легкоусвояемый кальций молока, витамины A, B₁, В₂, Д, С, каротин.

Ниже приведены примеры составов заявляемой питательной среды.

Пример 1. Минимальное содержание компонентов среды (мас.%):

ферментативный гидролизат
сывороточных белков молока	5,0
цистеин солянокислый (Ĺ-цистин)	0,001
натрий хлористый	0,03
марганец сернокислый MnSO4·4Н2О	0,001
магний сернокислый MgSO4·7H2O	0,01
очищенный дрожжевой экстракт	1,5
Обрат молока (основа), нормализованный
по сухому остатку	Остальное до 100%

Пример 2. Среднее содержание компонентов среды (мас.%):

ферментативный гидролизат сывороточных
белков молока	6,0
аскорбиновая кислота	0,0015
натрий хлористый	0,04
марганец сернокислый MnSO4·4Н2О	0,003
магний сернокислый MgSO4·7H2O	0,015
очищенный дрожжевой экстракт	1,7
Обрат молока (основа), нормализованный
по сухому остатку	Остальное до 100%

Пример 3. Максимальное содержание компонентов среды (мас.%):

ферментативный гидролизат сывороточных
белков молока	7,0
цистеин солянокислый (Ĺ-цистин)	0,002
натрий хлористый	0,05
марганец сернокислый MnSO4·4Н2О	0,005
магний сернокислый MgSO4·7H2O	0,02
очищенный дрожжевой экстракт	2,0
Обрат молока (основа), нормализованный
по сухому остатку	Остальное до 100%

Ниже приведены данные (таблицы 1 и 2) по культивированию бифидобактерий (штамм Bifidobacterium bifidum 791 БАГ) и лактобактерий (штамм лактобактерий Lactobacillus acidophilus 57S) с использованием заявляемой питательной среды и среды-прототипа. Из указанных таблиц видно, что титр как бифидобактерий, так и лактобактерий после культивирования с использованием заявляемой питательной среды в несколько раз выше, чем с использованием среды-прототипа, а время культивирования соответственно меньше.

Таблица 1
Титр лактобактерий и активность кислотообразования при культивировании в заявляемой питательной среде
№ п/п	Состав среды	Начальный титр, КОЕ/мл	Кислотность, °T	Время сквашивания, час
1	Пример 1	1,2·1010	115	4,0
2	Пример 2	2,5·1010	120	3,5
3	Пример 3	1,5·1010	126	4,0
4	Среда-прототип	7,0·109	107	5,0
Таблица 2
Титр бифидобактерий и активность кислотообразования при культивировании в заявляемой питательной среде
№ п/п	Состав среды	Начальный титр, КОЕ/мл	Кислотность, °T	Время сквашивания, час
1	Пример 1	4·1010	130	16
2	Пример 2	1·1010	145	18
3	Пример 3	1·1010	155	>18
4	Среда-прототип	2·109	124	24-30

Пример 4. Исследование длительности хранения консорциума штаммов лактобактерий в жидком концентрате лактобактерий

Исследована длительность хранения консорциума штаммов лактобактерий в жидком концентрате (таблица 3). В качестве посевной дозы используется консорциум штаммов лактобактерий Lactobacillus acidophilus 57S (депонирован во ВНИИгенетика в ВКПМ под №В 5863), Lactobacillus plantarum П-75 (депонирован во ВНИИгенетика в ВКПМ под №В 3962); Lactobacillus casei Сб (депонирован во ВНИИгенетика в ВКПМ под №В 5724) в соотношении 2:0,5:0,5. Сквашивание производят при температуре (39-40)°С в течение 4-5 часов до достижения кислотности готового продукта не менее 100°Т.

Значительный срок (до 72 дней) хранения с титром не ниже 10 КОЕ/мл связан с обеспечением начальной кислотности препарата консорциума лактобактерий не более (120-140)°Т, получением исходного титра лактобактерий (не ниже 10¹⁰ КОЕ/мл) за счет использования заявляемой молочной питательной среды с добавлением лактопептона и дрожжевого экстракта.

Таблица 3
Данные по культивированию консорциума бифидобактерий с использованием заявляемой питательной среды и хранению его биомассы
Производственная закваска	Биомасса лактобактерий на основе консорциума
Виды штаммов лактобактерий в консорциуме 0,5:0,5:2	Питательная среда	Время культивирования, часы	Кислотность, Т°	Титр (КОЕ/мл) ЖКБ в процессе хранения	Сгусток
1 сут	72 сут	1 сут	60 сут	72 сут
В-5724	Заявляемая среда	4,0.	140	160				Нормальный
В-3962	1·1010	6·109	2·109
В-5863
То же	Среда - прототип	5,0	170	320	2,5·109	9,0·107	2,5·107	Нормальный

Пример 5. Исследование длительности хранения биомассы консорциума штаммов бифидобактерий в жидком концентрате бифидобактерий, полученном с использованием заявляемой питательной среды

Исследована длительность хранения консорциума штаммов бифидобактерий в жидком концентрате бифидобактерий (таблица 4). В качестве посевной дозы бифидобактерий используют консорциум штаммов бифидобактерий: Bifidobacterium bifidum 8-3, Bifidobacterium longum Я-3, Bifidobacterium adolescentis B-1 в соотношении 3:1:1.

Посевную дозу бифидобактерий вносят в объеме 5,0-7,0% от объема питательной среды с титром бифидобактерий не менее 10⁹ КОЕ/мл, культивирование осуществляют в течение времени, достаточного для получения концентрата бифидобактерий с биологическим титром не менее (0,8-1,0)10¹¹ КОЕ/мл.

Значительный срок (до 72-х дней) хранения жидкого концентрата бифидобактерий с титром не ниже 10¹⁰ КОЕ/мл связан с обеспечением начальной кислотности препарата консорциума бифидобактерий не более (140-145)°Т, получением исходного титра бифидобактерий (не ниже 10¹¹ КОЕ/мл).

Таблица 4Данные по культивированию консорциума бифидобактерий с использованием заявляемой питательной среды и хранению его биомассы
Производственная закваска	Жидкий концентрат бифидобактерий (ЖКБ) на основе консорциума
Состав заявляемого консорциума	Соотношение штаммов	Время культивирования, час	Кислотность, T°	Титр (КОЕ/мл) ЖКБ в процессе хранения	Сгусток
1 сут	72 сут	1 сут	60 сут	72 сут
l)B.bifidum 8-3	60	22	146	150	3·1011	1·1010	1·1010	Нормальный
2)B.longum (Я-3)	20
3)B.adolescentis.В-1	20
То же	Среда - прототип	29	137	152	5·109	1·108	9·107	Нормальный

Таким образом, технический результат заявляемого изобретения подтверждает создание такой питательной среды, которая обеспечивает возможность культивирования как бифидобактерий, так и лактобактерий при более длительных сроках хранения (до 72 суток и более) и более высоких титрах биомассы бактерий в процессе хранения.

1. Молочная питательная среда для получения биомассы бактерий-пробиотиков, содержащая основу в виде обезжиренного молока с содержанием сухого остатка 13-14%, цистеин соляно-кислый или аскорбиновую кислоту, гидролизат молочных белков, ростовые факторы из дрожжевых клеток и натрий хлористый, отличающаяся тем, что среда дополнительно содержит марганец серно-кислый четырехводный и магний серно-кислый семиводный, в качестве гидролизата белков молока содержит лактопептон, а в качестве ростовых факторов из дрожжевых клеток - очищенный дрожжевой экстракт с показателем аминного азота 2,1-2,8%, общего белка не менее 3-4% при следующем соотношении компонентов питательной среды, мас.%:

лактопептон	5,0-7,0
цистеин соляно-кислый
или аскорбиновая кислота	0,001-0,002
натрий хлористый	0,03-0,05
марганец серно-кислый четырехводный	0,001-0,005
магний серно-кислый семиводный	0,01-0,02

очищенный дрожжевой экстракт с

показателем
аминного азота	2,1-2,8%
общего белка не менее 3-4%	1,5-2,0
обезжиренное молоко с содержанием
сухого остатка 13-14%	остальное до 100%

2. Молочная питательная среда по п.1, отличающаяся тем, что обезжиренное молоко содержит лактозу в количестве не более 15%.