Способ определения проницаемости аэрозольных фильтров в отношении микроорганизмов

Способ определения проницаемости аэрозольных фильтров в отношении микроорганизмов

Реферат

Изобретение относится к способам определения коэффициентов проницаемости аэрозольных фильтров в отношении бактериальных токсинов белковой природы и может быть использовано для контроля эффективности фильтров тонкой очистки воздуха и средств индивидуальной защиты в биотехнологии, санитарной, медицинской и прикладной микробиологии при работах с микроорганизмами и их токсинами в целях обеспечения безопасности условий труда.

Основной характеристикой фильтров является коэффициент проскока (или проницаемость), равный процентному отношению концентрации частиц в воздухе после фильтра к концентрации частиц в воздухе до фильтра (ГОСТ Р 51251-99. Фильтры очистки воздуха. Классификация. Маркировка: Государственный стандарт Российской Федерации. - М.: ИПК Издательство стандартов, 1999).

Известен способ оценки задерживающей способности аэрозольных фильтров в отношении аэрозолей турбинного масла или диоктилфталата (ГОСТ 10189-62). В нем турбинное масло или диоктилфталат диспергируются в аэрозоль до фильтра с образованием в воздухе частиц размером от 0,17 до 0,36 мкм. Концентрация частиц до и после фильтра определяется без отбора проб нефелометрически.

Недостатками метода являются:

необходимость создания значительных концентраций турбинного масла или диоктилфталата до фильтра для обеспечения чувствительности метода;

диоктилфталат считается потенциально опасным веществом (Carlon H.R., Guelta M.A., Gerber B.V. Some candidate replacement materials for dioctil phthalate in "hot smoke" aerosol penetrometer machines / Aerso) Sci. and Technol. - 1991. - Vol.14, №2. - P.233-246);

загрязнение фильтра маслом;

несоответствие гигроскопических, поверхностных, электростатических и иных значимых физико-химических свойств частиц флуоресцеина натрия, существенных для процессов их задержки фильтрующими материалами, соответствующими свойствам белковых частиц, формируемых бактериальными токсинами.

В практике проверки фильтрующих систем нашло применение аэрозолей флуоресцеина натрия (уранина) (ОСТ Д-504-91ССБТ: Фильтры тонкой очистки воздуха. Методы определения проницаемости: Отраслевой стандарт), диспергируемых пневматическими распылителями до частиц размером менее 1 мкм. Количественная регистрация уранина в пробах аэрозоля, отбираемых до и после фильтра, осуществляется флуориметрически.

Недостатком метода является:

несоответствие гигроскопических, поверхностных, электростатических и иных значимых физико-химических свойств частиц турбинного масла или диоктилфталата, существенных для процессов их задержки фильтрующими материалами, соответствующими свойствам белковых частиц, формируемых бактериальными токсинами;

загрязнение фильтра красителем, его накопление в помещениях, что приводит к постепенному нарастанию уровню фона в коммуникациях вентиляционных систем и помещениях и необходимости корректировки результатов по уровню фона.

Наиболее близким является способ определения коэффициента проскока аэрозольных фильтров в отношении тест-аэрозолей микроорганизма Serratia marcescens (Основы техники безопасности в микробиологических и вирусологических лабораториях / С.Г.Дроздов, Н.С.Гарин, Л.С.Джиндоян, В.М.Тарасенко. - М.: Медицина, 1987, СП 1.2.731-99. Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности: Санитарные правила. - М.: Информ. - изд. центр Госкомсанэпиднадзора Минздрава России, 1999); СП 1.3.1285-03 Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности): Санитарные правила. - М.: Информ. - изд. центр Госкомсанэпиднадзора Минздрава России, 2003).

Сущность метода состоит в отборе пробоотборниками проб аэрозоля до и после фильтра во время диспергирования суспензии Serratia marcescens перед фильтром при заданных условиях испытаний, определении в пробах концентраций аэрозоля Serratia marcescens и расчете по ним коэффициента проницаемости фильтра (ОСТ Д-504-91ССБТ: Фильтры тонкой очистки воздуха. Методы определения проницаемости: Отраслевой стандарт).

К недостаткам данного метода следует отнести:

невозможность характеристики проникания через фильтрующие материалы белковых веществ, характеризующихся значительно меньшими размерами, чем клетки Serratia marcescens;

длительность определения, связанная с бактериологическим методом определения количества жизнеспособных клеток;

значительная инактивация клеток при прохождении коммуникаций вентиляционных систем и фильтров, влияющая на достоверность определения коэффициента проскока;

необходимость использования дорогостоящих питательных сред;

необходимость осуществления организационных и технических мероприятий по обеспечению биологической безопасности в связи с тем, что микроорганизм Serratia marcescens относится к IV группе патогенности (СП 1.2.731-99. Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности: Санитарные правила. - М.: Информ. - изд. центр Госкомсанэпиднадзора Минздрава России, 1999).

Общими с заявленным способом являются

приготовление жидкого тест-препарата;

диспергирование тест-препарата в аэрозоль до фильтра;

отбор проб аэрозоля до фильтра и после него в процессе диспергирования тест-препарата;

определение в пробах аэрозоля содержания биологического маркера (трассера) - жизнеспособных бактериальных клеток или активных ЦН;

расчет коэффициента проскока фильтра.

Задачей изобретения является разработка способа определения проницаемости аэрозольных фильтров в отношении бактериальных токсинов, представляющих собой глобулярные белковые комплексы, сформированные из нескольких субъединиц и имеющие размеры, существенно меньшие, чем микробные клетки.

Поставленная задача решается благодаря тому, что в способе определения проницаемости аэрозольных фильтров предусмотрено использование:

препаратов бактериальных белков, инициирующих льдообразование (БИЛ), в качестве маркера, регистрация льдообразующей активности которых проводится по наличию в пробе центров нуклеации (ЦП) переохлажденной воды, формируемых белками этого типа;

микрокапельной криоскопической методики для количественного обнаружения ЦН в пробах, суть которой заключается в подсчете относительного числа кристаллизующихся микрокапель серийных разведений исследуемых проб при определенной температуре переохлаждения и использовании известной зависимости концентрации ЦН от доли замерзающих микрокапель, подчиняющейся распределению Пуассона;

рациональной температуры анализа, находящейся в интервале от минус 7°С до минус 11°С, т.к. при этой температуре чистая вода и разбавленные растворы солей, не содержащие гетерогенных ядер нуклеации, в микрокаплях сохраняются в переохлажденном состоянии продолжительное время;

мини-криостата с регулируемой температурой, сконструированного на основе элементов Пельтье, обеспечивающего охлаждение и термостабилизацию рабочей поверхности с точностью ±0,1°С в интервале температур от минус 1°С до минус 13°С;

активных штаммов-продуцентов БИЛ, например микроорганизмов Erwinia herbicola, штаммов 1211 или 1123 (также возможно использование Pseudomonas syringae, штамм 1567 или Pseudomonas fluorescens, штамм 1475), - штаммы из Всероссийской коллекции микроорганизмов. Данные бактерии продуцируют в значительных количествах белковые комплексы класса С, инициирующие кристаллизацию переохлажденной воды при температуре от минус 7°С и ниже, представляющие собой глобулярные образования из нескольких субъединиц, имеющие молекулярную массу около 150 килодальтон и изоэлектрическую точку в кислой зоне рН, что аналогично ботулиническому нейротоксину (Виноградова И.Д., Уварова Р.Н., Иванов К.К. и др. Получение нейротоксина и гемаглютинина Cl. botulinum типа А и характеристика нейротоксина // Бихимия. - 1983. - т.48, вып.5. - С.788-795; Govindarajan A.G., Lindow S.E. Size of bacterial ice nucleation sites measured in situ by radiation inactivation analysis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1988. - Vol.85, - P.1334-1338).

Способ включает следующие этапы:

приготовление белкового тест-препарата;

диспергирование тест-препарата в аэрозоль до фильтра;

отбор проб аэрозоля до фильтра и после него в процессе диспергирования тест-препарата;

определение в пробах аэрозоля содержания активных ЦН;

расчет коэффициента проскока фильтра.

Способ выполняется следующим образом.

Для получения тест-препарата выращивают культуру продуцента, из которой выделяют БИЛ.

Выращивание микробов-продуцентов осуществляют на плотной питательной среде на основе ферментативного гидролизата мяса, содержащей аминный азот в количестве (110±10) мг% и имеющей величину рН (7,2±0,2) ед. рН. Получение микробных культур производят при температуре (24±2)°С в течение 3 суток с последующим смывом колоний физиологическим раствором хлористого натрия с добавлением стеклянных бус.

Выделение белка БИЛ осуществляют путем разрушения клеток суспензии микроорганизмов встряхиванием со стеклянными бусами или ультразвуковой обработкой. БИЛ осаждают из культуральной жидкости солевым методом в присутствии гексаметафосфата натрия или сульфата аммония при рН среды 3,5-5,0 ед. с последующим центрифугированием.

На основе полученной белковой пасты готовят тест-препарат, имеющий удельную активность не менее 5,0·10⁸ ЦН·см^-3 (при диспергировании в течение не менее 10 минут не менее 10 см³ тест-препарата при коэффициенте перевода в аэрозоль 0,3 отн.ед. данная концентрация ЦН обеспечивает получение в аэрозоле до фильтра с минимальной производительностью 750 м³/ч требуемой концентрации трассера около 1·10⁷ у.е.·м^-3 (ОСТ Д-504-91ССБТ: Фильтры тонкой очистки воздуха. Методы определения проницаемости: Отраслевой стандарт) для расчета коэффициента проскока на уровне 1·10^-4%).

Используемые генераторы аэрозоля должны обеспечивать создание перед фильтром аэрозоля с концентрацией порядка 1·10⁷ ЦН·м^-3, состоящего в основном из частиц размером менее 10 мкм.

Для регистрации ЦН в пробах проводят следующие операции.

По описанию, прилагаемому к криостату, готовят прибор к работе. Устанавливают рабочую температуру минус 7°С или ниже.

Разводящую жидкость - фосфатный буферный раствор - готовят на основе растворов солей однозамещенного и двузамещенного фосфорнокислого калия и дистиллированной воды. Концентрация водородных ионов должна находиться в пределах 7,3-7,6 ед. рН. Приготовленный фосфатный буферный раствор подвергают автоклавированию при 120°С в течение 30 минут. Стерильный фосфатный буферный раствор проверяют на наличие абиогенных центров нуклеации. Для этого его разливают в стерильные пробирки по 4-10 см³ и замораживают в криостате при температуре минус (7-9)°С в течение 5 мин. Замерзшие при этой температуре пробирки выбраковывают.

Стерильные мерные пробирки в количестве, необходимом для выполнения требуемых десятикратных разведений, заполняют 4,5 см³ фосфатным буферным раствором.

Приготовление парафинированных кювет из алюминиевой фольги, необходимых для размещения микрокапель исследуемой жидкости, осуществляют следующим образом. Кюветы готовят в виде круга диаметром 8-10 см с загнутыми краями с высотой бортов 5-10 мм. Из переплавленного парафина готовят 3% раствор в ксилоле или хлороформе. Раствор парафина наносят на рабочую поверхность кюветы с избытком. Излишек раствора сливают. Кюветы подсушивают в течение 2-3 минут над пламенем спиртовки для испарения растворителя.

В качестве сорбирующей жидкости для пробоотборников используют физиологический раствор или фосфатный буферный раствор, приготовленный вышеприведенным способом.

Диспергируют тест-препарат пневматическим распылителем, оснащенным отсекателем грубой фракции частиц генерируемого аэрозоля, в воздуховод до фильтра в течение не менее 10 минут для получения аэрозоля с преимущественным размером частиц менее 1 мкм.

Отбирают пробы аэрозоля до и после фильтра в соответствии с требованиями ОСТ Д-504-91ССБТ.

Исследуемую пробу сорбирующей жидкости из пробоотборников тщательно перемешивают и 0,5 см³ вносят в первую пробирку с фосфатным буфером. Дальнейшие разведения осуществляют десятикратным шагом. Анализу подвергают исходную пробу и все 5-8 десятикратных разведений.

Микропипеткой наносят на поверхность алюминиевой парафинированной кюветы по 20-40 капель (объемом 0,01 см³) контролей (фосфатный буферный раствор и сорбирующая жидкость) и каждого анализируемого разведения отобранной из аэрозоля пробы. Кюветы устанавливают в камеру криостата и визуально определяют количество замерзших капель на каждой кювете через три минуты с момента начала кристаллизации. Замерзание капель регистрируют по их помутнению. Изменяют температуру охлаждающей поверхности криостата и через 3 мин повторяют подсчет числа замерзших микрокапель при новой температуре.

При расчете концентрации ЦН используют кюветы, в которых отмечено замерзание части нанесенных капель. Анализ считается зачетным, если в контролях (фосфатном буферном растворе и сорбирующей жидкости) ЦН при выбранной температуре не регистрируются.

Расчет концентрации ЦН в пробе ведут следующим порядком.

Для каждого разведения пробы (i) по формулам (1) и (2) рассчитывают долю замерзших капель - эффект кристаллизации (f_i) и соответствующую этому эффекту концентрацию центров нуклеации (C_fi):

где f_i - эффект кристаллизации, доля;

С_fi - концентрация БИЛ в исследуемой жидкости, ЦН см^-3;

N_oi - общее количество зачетных капель исследуемого разведения на данной кювете;

N_3i - число замерзших капель исследуемого разведения на данной кювете;

d - степень разведения;

V - объем капли на кювете (например 0,01 см³).

На основе полученных значений методом наименьших квадратов рассчитывают концентрацию ЦН, соответствующую 50% эффекту кристаллизации.

Статистическую обработку результатов параллельных определений выполняют в соответствии с общепринятыми методами.

Наличие причинно-следственной связи между совокупностью существенных признаков заявляемого объекта и достигаемыми техническими результатами показано в табл. 1.

Таблица 1
Сведения о причинно-следственной связи между совокупностью существенных признаков заявляемого объекта и достигаемыми техническими результатами
Виды технического результата и их размерность	Показатели фактические или расчетные	Совокупность отличительных признаков, улучшающих показатели заявляемого объекта
прототипа	заявляемого объекта
Возможность генерирования аэрозолей, содержащих частицы с активным биологическим маркером размером менее 0,5 мкм, (да/нет)	нет	да	Белковые комплексы, инициирующие льдообразование, имеют размеры менее 0,1 мкм, что обеспечивает получение субмикронных частиц, загруженных активным биологическим маркером. Жизнеспособные клетки Serratia marcescens не могут присутствовать в частицах размером менее 0,5 мкм
Средняя продолжительность определения коэффициента проскока фильтра в 10 пробах, час	55	2	Использование методики капельного замораживания проб, содержащих микробные белки БИЛ, имитирующих ботулинический токсин и определяемых инструментальным методом, обеспечивает экспрессное определение коэффициента проскока. В ближайшем аналоге необходимо определение общей концентрации клеток в пробе стандартным бактериологическим методом путем высева 10-кратных серийных разведений на чашки с ППС и подсчета выросших после инкубирования в течение 48 часов колоний
Виды технического результата и их размерность	Показатели фактические или расчетные	Совокупность отличительных признаков, улучшающих показатели заявляемого объекта
прототипа	заявляемого объекта
Ошибка определения концентрации биологического маркера в пробе, процент			Использование стандартного бактериологического метода высева 10-кратных серийных разведений на чашки с ППС и подсчета выросших колоний после инкубирования не обеспечивает точность определения концентрации менее 25 % (допустимая биологическая погрешность). Инструментальный метод определения концентрации ЦН в предлагаемом способе характеризуется 10% ошибкой
>25	<10
Среднее количество анализов по определению содержания биологического маркера в пробах двумя лаборантами за рабочую смену, проб	10	30	Производительность анализов снижена у прототипа за счет продолжительного (48 часов) роста колоний для регистрации результатов, что исключает предлагаемый способ.
Устойчивость биологического маркера в аэрозоле, час	0,3-0,5	3,0	Белки, инициирующие льдообразование, более стабильны в аэрозоле, чем клетки Serratia marcescens, что обеспечивает получение адекватных данных о коэффициенте проскока фильтрующих систем при значительной протяженности воздушных коммуникаций
Виды технического результата и их размерность	Показатели фактические или расчетные	Совокупность отличительных признаков, улучшающих показатели заявляемого объекта
прототипа	заявляемого объекта
Устойчивость биологического маркера в пробах сорбирующей жидкости, отобранных из аэрозоля, час	до 3	до 24	Белки, инициирующие льдообразование, более стабильны в пробах сорбирующей жидкости, чем клетки Serratia marcescens, что обеспечивает возможность определения коэффициента проскока через длительный (24 часа) промежуток времени после отбора проб

Возможность осуществления предлагаемого способа показана на следующих примерах.

Пример 1. Генерирование аэрозоля тест-препарата БИЛ с преимущественным размером частиц менее 1 мкм.

Жидкие тест-препараты диспергированы в аэрозольную камеру объемом 1 м³ при помощи прямоструйного пневматического распылителя, оснащенного отсекателем частиц грубой фракции. Анализ дисперсного состава полученных аэрозолей проведен с использованием оптического аэрозольного счетчика ОАС-0,3. Результаты анализа дисперсного состава аэрозолей БИЛ представлены в табл. 2.

Таблица 2
Дисперсный состав аэрозолей жидких тест-препаратов БИЛ (численное распределение)
Давление сжатого воздуха при распыле, атм	Содержание частиц во фракции ... мкм, процент
0,3-0,5	0,5-1,0	1,0-2,0	2,0-5,0	5,0-10,0	более 10,0
1,5	17,2	33,6	29,4	18,2	1,8	0
2,0	18,6	31,0	27,4	19,6	3,9	0
2,7	61,5	17,2	17,1	3,9	0,2	0,01

Полученные данные свидетельствуют о возможности получения из жидких препаратов БИЛ тест-аэрозолей, содержащих преимущественно частицы размером менее 1 мкм, необходимые для оценки проницаемости аэрозолей белковых комплексов.

Пример 2. Оценка проникающей способности аэрозолей, генерированных из жидких препаратов БИЛ при помощи прямоструйных распылителей с отсекателями грубодисперсной фракции. Проверено проникание аэрозолей через фильтры (см. табл. 3). Анализ проскока БИЛ через фильтры выполнен на фильтровентиляционной системе с производительностью 1500 м³·ч^-1 в соответствии с требованиями (ОСТ Д-504-91ССБТ: Фильтры тонкой очистки воздуха. Методы определения проницаемости: Отраслевой стандарт) с использованием жидкого тест-препарата БИЛ вместо тест-препарата S. marcescens. Пробы аэрозоля отбирали с использованием микроциклонов, содержавших 10 см³ сорбирующей жидкости (физиологического раствора), с производительностью 10 дм³·мин^-1.

Таблица 3
Проникающая способность аэрозолей БИЛ через фильтры
Концентрация БИЛ в препарате, ЦН·см-3	Концентрация БИЛ в аэрозоле, ... ЦН·дм-3	Коэффициент проницаемости, процент
до фильтра	после фильтра
3,2·109	4,3·103	0,56	1,3·10-2
2,9·109	7,0·103	0,81	1,2·10-2
6,9·109	1,0·104	1,00	9,0·10-3
Средние значения
(4,3±2,2)·109	(7,1±2,9)·103	0,79±0,22	(1,1±0,2)·10-2

Данные табл. 3 свидетельствуют о том, что коэффициент проскока БИЛ через фильтры составил (1,1±0,2)·10^-2% и оказался в среднем на три порядка выше, чем коэффициент проскока тест-аэрозоля S. marcescens, составивший в контрольных опытах на данной ФВС (1,6-25,0)·10^-6%.

Пример 3. Оценка проникающей способности аэрозолей, генерированных из жидких препаратов БИЛ при помощи прямоструйных распылителей с отсекателями грубодисперсной фракции. Проверено проникание аэрозолей через фильтр противогазовых коробок (см. табл. 4). При проверке противогазовых коробок аэрозоль БИЛ создавали в статической аэрозольной камере. Аэрозоль отбирали через коробки в течение 10 мин с производительностью 10 дм³·мин^-1. Пробы аэрозоля отбирали микроциклонами с сорбирующей жидкостью (см. пример 2).

Таблица 4
Проникающая способность аэрозолей БИЛ через фильтр противогазовых коробок
Концентрация БИЛ в препарате, ЦН·см-3	Концентрация БИЛ в аэрозоле, ... ЦН·дм-3	Коэффициент проницаемости, процент
до фильтра	после фильтра
6,9·109	3,9·104	1,10	3,7·10-3
5,1·104	1,20	2,6·10-3
2,0·104	0,70	4,7·10-3
Среднее значение	(3,7±1,6)·104	2,3±1,5	(3,7±1,1)·10-3

Способ определения проницаемости аэрозольных фильтров в отношении микроорганизмов, включающий приготовление жидкого тест-препарата, диспергирование его в аэрозоль до фильтра, отбор проб аэрозоля до и после фильтра, определение в пробах аэрозоля содержания биологического маркера, отличающийся тем, что в качестве маркера используют тест-препарат белков, инициирующих льдообразование, регистрацию льдообразующей активности которых проводят по наличию в пробе центров нуклеации; белки, инициирующие льдообразование, выделяют путем разрушения клеток штамма-продуцента механической или ультразвуковой обработкой с последующим солевым осаждением и центрифугированием; из полученной белковой пасты готовят тест-препарат, имеющий удельную активность не менее 5,0·10⁸ центров нуклеации в см³; полученный тест-препарат диспергируют в аэрозоль с концентрацией 1·10⁷ центров нуклеации в см³; концентрацию центров нуклеации рассчитывают согласно микрокапельной криоскопической методике, основанной на использовании закона Пуассона для описания вероятности обнаружения центров нуклеации в микрокаплях и расчета концентрации, соответствующей 50% эффекту кристаллизации в группах микрокапель при температуре от минус 7 до минус 11°С, с использованием метода наименьших квадратов; коэффициент проницаемости рассчитывают путем деления концентрации центров нуклеации в пробах после фильтра на концентрацию центров нуклеации в пробах перед фильтром.