Выделение и идентификация т-клеток

Выделение и идентификация т-клеток

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится в основном к области диагностики и лечения аутоиммунного заболевания, такого как рассеянный склероз (PC). В частности, оно относится к выделению антигенспецифичных Т-клеток. Кроме того, настоящее изобретение относится к использованию антигенспецифичных Т-клеток для лечения аутоиммунного заболевания, такого как PC.

Предпосылки создания изобретения

Межклеточные комплексы распознавания, образованные Т-клеточными рецепторами (ТкР) на цитотоксических Т-лимфоцитах или хелперных Т-клетках, и комплексы МНС/пептид на антигенпрезентирующих клетках (АПК), представляют собой распространенный компонент распознавания в многообразной группе взаимодействий типа клетка-клетка, которые активируют Т-клетки как в период развития спектра Т-клеток в индивидуальном организме (положительная селекция, отрицательная селекция, периферическое выживание), так и в период контрольной (Т-хелпер) и эффекторной (Т-киллер) стадий адаптивного иммунного ответа.

В адаптивном иммунном ответе антигены распознаются гипервариабельными молекулами, такими как антитела или ТкР, которые экспрессируются с достаточно разнообразными структурами для того, чтобы иметь возможность распознать любой антиген. Антитела могут связываться с любой частью поверхности антигена. Однако ТкР ограничены связыванием с короткими пептидами, связанными с молекулами класса I или класса II главного комплекса гистосовместимости (МНС) на поверхности АПК. Распознавание ТкР комплексов пептид/МНС инициирует активацию (клональную экспансию) Т-клетки.

ТкР представляют собой гетеродимеры, состоящие из двух цепей, которые могут быть αβ (альфа-бета) или γδ (гамма-дельта). Структура ТкР очень близка структуре иммуноглобулинов (Ig). Каждая цепь имеет два экстрацеллюларных домена, которые имеют характерную для иммуноглобулинов укладку цепи. Аминоконцевой домен является высоковариабельным и называется вариабельным (V) доменом. Ближайший к мембране домен представляет собой константный (С) домен. Два данных домена аналогичны таковым доменам иммуноглобулинов и напоминают фрагменты Fab. V-домен каждой цепи имеет три участка, определяющих комплементарность (или гипервариабельных участка) (CDR). Проксимально к мембране каждая цепь ТкР содержит короткую связывающую последовательность с остатком цистеина, который образует дисульфидную связь между обеими цепями.

Гены, кодирующие гетеродимеры αβ и γδ, экспрессируются только в Т-клеточной линии. Четыре локуса ТкР (α, β, γ и δ) имеют организацию зародышевой линии, очень близкую их организации в Ig. α- и γ-цепи получают путем реаранжировки сегментов V и J, тогда как β- и δ-цепи получают путем реаранжировки D и J. Сегменты гена цепей ТкР находятся на разных хромосомах за исключением сегментов δ-цепи, которые находятся между сегментами гена V и J α-цепи. Положение сегментов гена δ-цепи имеет большое значение: продуктивная реаранжировка сегментов α-цепи приводит к делеции С-генов δ-цепи, вследствие чего в данной клетке αβ-гетеродимер не может коэкспрессироваться с γδ-рецептором.

У мышей имеется около 100 Vα- и 50 Jα-сегментов гена и только один Сα-сегмент. Семейство генов δ-цепи включает около 10 V-, 2 D-и 2 J-сегмента гена. Семейство генов β-цепи включает 20-30 V-сегментов и два идентичных повтора, содержащих 1 Dβ, 6 Jβ и 1 Сβ. Наконец, семейство генов γ-цепи включает 7 V- и 3 различных J-C-повтора. У человека организация аналогична организации у мышей, но число сегментов отличается.

Реаранжировка в сегментах гена в α- и β-цепях подобна реаранжировке Ig. α-цепь, подобно легкой цепи Ig, кодируется сегментами гена V, J и С. β-цепь, подобно тяжелой цепи Ig, кодируется сегментами гена V, D и J. Реаранжировки сегментов гена α-цепи приводят в результате к соединению VJ, и реаранжировки β-цепи приводят в результате к соединению VDJ. После транскрипции реаранжированных генов, процессинга РНК и трансляции α- и β-цепи экспрессируются связанными дисульфидной связью в мембране Т-клеток.

Сегменты гена ТкР фланкированы последовательностями распознавания сигнала (ПРС), содержащими гептамер и нонамер с промежуточной последовательностью либо из 12 нуклеотидов (один виток), либо 23 нуклеотидов (два витка). Как в Igs, ферменты, кодируемые генами активации рекомбинации (RAG-1 и RAG-2), отвечают за процессы рекомбинации. RAG1/2 распознает ПРС и соединяет сегменты V-J и V-D-J таким же образом, как при реаранжировках Ig. Вкратце, данные ферменты разрезают одну нить ДНК между сегментом гена и ПРС и катализируют образование шпильки в кодирующей последовательности. Впоследствии сигнальная последовательность вырезается.

Комбинаторное соединение сегментов V и J в α-цепях и сегментов V, D и J в β-цепи приводит к образованию большого числа возможных молекул, создавая, таким образом, разнообразие ТкР. Разнообразие в ТкР достигается также альтернативным соединением сегментов генов. В противоположность Ig, сегменты гена β и δ могут быть соединены альтернативными путями. Фланкирующие сегменты гена ПРС в сегментах гена β и δ могут генерировать VJ и VDJ в β-цепи и VJ, VDJ и VDDJ в δ-цепи. Как в случае с Ig, разнообразие получают также путем вариабельности соединения генных сегментов.

Гипервариабельные петли ТкР, известные как участки, определяющие комплементарность (CDRs), распознают сложную поверхность, образованную молекулой МНС и связанным пептидом. Петли CDR2 α и β контактируют только с молекулой МНС на поверхности АПК, тогда как петли CDR1 и CDR3 контактируют как с пептидом, так и с молекулой МНС. По сравнению с Ig ТкР имеют более ограниченное разнообразие в CDR1 и CDR2. Однако разнообразие петель CDR3 в ТкР выше, чем в таковое в Ig, поскольку ТкР могут присоединять больше одного сегмента D, что приводит к расширенному разнообразию присоединения.

Считают, что патогенез ряда аутоиммунных заболеваний вызывается ответами аутоиммунных Т-клеток на аутоантигены, присутствующие в организме. В нарушение принципов клональной селекции не все аутореактивные Т-клетки уничтожаются в тимусе. Данные Т-клетки с ТкР для широкого спектра аутоантигенов представляют часть Т-клеток нормального состава и обычно циркулируют в периферической крови. Неясно, почему допускается, чтобы аутореактивные Т-клетки в процессе их эволюции проходили дифференцировку в тимусе и находились на периферии. Хотя их физиологическая роль неясна, данные ауторективные Т-клетки, будучи активированными, представляют потенциальный риск в плане индукции аутоиммунных патологий. Аутореактивные Т-клетки могут быть также выделены у нормальных субъектов без последствий в отношении аутоиммуных заболеваний. Установлено, что антигенное распознавание аутореактивности само по себе недостаточно для опосредования аутодеструктивного процесса. Одним из предварительных условий, необходимых для того, чтобы аутореактивные Т-клетки стали патогенными, является то, что они должны быть активированы.

Аутореактивные Т-клетки участвуют в патогенезе аутоиммунных заболеваний, таких как рассеянный склероз (PC) и ревматоидный артрит (РА). Патогенез аутореактивных Т-клеток при PC, как правило, поддерживается в результате ответов Т-клеток на миелиновые антигены, в частности миелиновый основной белок (МОЕ). Обнаружено, что МОБ-реактивные Т-клетки подвергаются активации in vivo, и их предшественники встречаются с повышенной частотой в крови и спинномозговой жидкости больных PC в противоположность субъектам контрольной группы. Данные МОБ-реактивные Т-клетки продуцируют цитокины Т_H1, например IL-2, TNFα - и γ-интерферон (IFN-γ), которые облегчают миграцию воспалительных клеток в центральную нервную систему и усиливают воспалительные ответы, связанные с деструкцией миелина при PC.

Миелинреактивные Т-клетки, как было также показано, участвуют в патогенезе экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (ЭАЭ) у животных, который имеет сходство с PC. ЭАЭ можно индуцировать активно у восприимчивых животных путем инъекции белков миелина, эмульгированных в адъюванте, или пассивно путем инъекции миелинреактивных Т-клеточных линий и клонов, выделенных у сенсибилизированных миелином животных. При активации in vitro для индукции ЭАЭ требуются очень маленькие количества миелинреактивных Т-клеток, при этом в 100 раз превосходящее количество покоящихся Т-клеток с такой же реактивностью неспособно опосредовать ЭАЭ.

Было показано, что ЭАЭ можно предупредить, а также лечить посредством вакцинации инактивированными миелинреактивными Т-клетками, способом, названным Т-клеточной вакцинацией (см. статью Ben-Nun et al., Nature, 1981; 292: 60-61). Т-клеточная вакцинация индуцирует регуляторные иммунные ответы, состоящие из антиидиотипических Т-клеток и антиэрготипических Т-клеток, которые приводят к истощению миелинреактивных Т-клеток. При истощении миелинреактивных Т-клеток наблюдаются терапевтические эффекты на моделях ЭАЭ и других экспериментальных аутоиммунных заболеваний (см. статьи Lider et al., Science, 1988; 239:820-822; Lohse et al., Science, 1989; 244: 820-822).

Вследствие успеха на моделях аутоиммунных заболеваний Т-клеточная вакцина в последнее время передана на клинические испытания на пациентах с PC. Основываясь на результатах на экспериментальных моделях, таких как ЭАЭ, считают, что истощение аутореактивных Т-клеток может улучшить клиническое течение PC и других иммунных болезней.

В пилотном клиническом испытании вакцинация облученными аутологичными МОБ-реактивными Т-клеточными клонами вызывала ответы цитолитических Т-клеток CD8⁺, которые специфически распознавали и лизировали циркулирующие в крови МОБ-реактивные Т-клетки (см. статьи Zhang et al., Science, 1993; 261: 1451-1454, Medaer et al., Lancet 1995: 346: 807-808). Три подкожные инокуляции облученных МОБ-реактивных Т-клеточных клонов приводили к истощению циркулирующих в крови МОБ-реактивных Т-клеток у больных PC.

В предварительном клиническом испытании циркулирующие в крови МОБ-реактивные Т-клетки истощали у пациентов с рецидивирующим-ремиттирующим РС и пациентов с вторичным прогрессирующим PC (см. статью Zhang et al., J. Neurol., 2002; 249: 212-8) путем вакцинации пациентов тремя подкожными инъекциями облученных аутологичных МОБ-реактивных Т-клеток. Т-клеточная вакцинация оказывала положительное действие на каждую группу пациентов, как измеряют по уровню рецидивов, значению по расширенной шкале нетрудоспособности и активности поражения по данным ЯМР-томографии. Однако имелась тенденция к ускоренному прогрессированию через приблизительно двенадцать месяцев после последней инъекции. Значение явного ускоренного прогрессирования неизвестно, может быть оно связано с постепенным снижением иммунитета, вызванным Т-клеточной вакцинацией против МОБ-реактивных Т-клеток. У приблизительно 10-12% иммунизированных пациентов МОБ-реактивные Т-клетки вновь появлялись примерно в то же время, что ускоренное прогрессирование. В ряде случаев вновь появляющиеся МОБ-реактивные Т-клетки происходили из различных клональных популяций, которые не были выявлены до вакцинации, предполагая возможность того, что в МОБ-реактивных Т-клетках может проходить клональный сдвиг или распространение эпитопа. Клональный сдвиг МОБ-реактивных Т-клеток был отмечен в предшествующих исследованиях (см. статью Zhang et al. 1995) и может быть связан с текущим болезненным процессом.

Хотя было продемонстрировано, что Т-клеточная вакцинация эффективна в плане истощения миелинреактивных Т-клеток и потенциально положительно воздействует на больных PC, существует ряд проблем, связанных с лечением. Лечение Т-клеточной вакциной для каждого больного должно быть индивидуализировано, поскольку Т-клеточные рецепторы миелинреактивных Т-клеток очень разнообразны и отличаются у разных больных PC (см. статьи Vandevyver et al., Eur. J. Immunol, 1995; 25:958-968, Wucherpfennig et al., J. Immunol., 1994; 152: 5581-5592, Hong et al., J. Immunol., 1999; 163: 3530-3538).

В дополнение к индивидуализации для каждого больного для получения данной Т-клеточной вакцины с использованием имеющихся в настоящее время способов требуется 8 недель. Получение Т-клеточной вакцины начинается с выделения мононуклеарных клеток из спинномозговой жидкости (МКСМЖ) или периферической крови больного (МКПК). Затем выделенные мононуклеарные клетки культивируют с миелиновыми пептидами в течение 7-10 дней с целью активации миелинреактивных Т-клеток. Потом культуры тестируют на специфическую пролиферацию в отношении миелиновых пептидов посредством измерения включения [³Н]-тимидина в присутствии миелиновых пептидов в течение 3 дней. Тестируемые культуры, положительные в плане специфической пролиферации в отношении миелиновых пептидов, затем серийно разводят для получения клональных Т-клеточных линий или непосредственно размножают. Затем клетки культивируют до 6-8 недель для размножения Т-клеток. Когда конечный продукт Т-клеточной вакцины является клональным, Т-клетки гомогенны, имея один тип использования гена Vβ-Dβ-Jβ. Обычно комбинируют от трех до шести клональных клеточных линий для получения гетерогенного препарата с множеством типов использования гена Vβ-Dβ-Jβ. Когда конечный продукт Т-клеточной вакцины получают путем непосредственной экспансии, Т-клетки гетерогенны, имея более одного типа использования гена Vβ-Dβ-Jβ.

Индивидуализированная природа Т-клеточной вакцинации и продолжительное культивирование клеток, необходимые для получения каждой вакцины, делают лечение в рамках современных методик дорогим и трудоемким. Длительное время, требующееся для получения клеточной культуры, также создает значительный риск заражения. Наконец, вероятность клонального сдвига или распространения эпитопа миелинреактивных Т-клеток может потребовать последующего получения Т-клеточной вакцины для каждого больного с различным типом использования гена Vβ-Dβ-Jβ.

Вследствие этого существует необходимость разработки усовершенствованных способов выделения Т-клеток со специфичностью к антигенам, таким как МОБ, которые могут использоваться для получения Т-клеточных вакцин для лечения больных с заболеваниями, опосредованными Т-клетками, такими как PC. Имеется также необходимость разработки способов получения Т-клеточных вакцин с гетерогенным типом использования гена Vβ-Dβ-Jβ, чтобы принять во внимание клональный сдвиг аутореактивных Т-клеток.

Краткое описание сущности изобретения

Настоящее изобретение в основном направлено на способы выделения антигенспецифических Т-клеток и, в особенности, Т-клеток, специфичных в отношении собственных или аутоантигенов. Способы выделения одной или более Т-клеток, специфичных в отношении антигена, представляющего интерес, как правило, включают инкубирование образца, содержащего Т-клетки, полученные от больного, с данным антигеном или его модификацией; отбор одной или более Т-клеток, которые экспрессируют один или более первых маркеров, выбранных из группы, состоящей из CD69, CD4, CD25, CD36 и HLADR, и один или более вторых маркеров, выбранных из группы, состоящей из IL-2, TNFα, IFN-γ, IL-5, IL-10 и IL-13.

Способы, соответствующие изобретению, особенно эффективны для выделения аутореактивных Т-клеток, которые играют роль в патогенезе аутоиммунных заболеваний.

Способы, соответствующие изобретению, кроме того, позволяют диагностировать аутоиммунное заболевание, а также контролировать развитие заболевания и контролировать эффективность лечения заболевания.

Способы, соответствующие изобретению, обеспечивают также получение аутологичных Т-клеточных вакцин для лечения связанных с Т-клетками аутоиммунных заболеваний.

Способы получения вакцин в основном включают выделение антигенспецифических Т-клеток, как описано выше, за которыми необязательно идут последующие стадии культивирования, которые дают возможность размножения популяции выделенных антигенспецифических Т-клеток.

В числе прочего изобретение направлено также на Т-клеточные вакцины и фармацевтические композиции, включающие антигенспецифические Т-клетки, выделенные при использовании способов, соответствующих изобретению.

Способы, соответствующие изобретению, используют также для изучения свойств Т-клеточных рецепторов и кодирующих их нуклеиновых кислот.

Краткое описание чертежей

На фигуре 1 представлена идентификация с помощью FACS (клеточного сортинга с возбуждением флуоресценции) клеток, экспрессирующих CD69 и γINF (сверху) и CD69 и TFNα (внизу) у больного рассеянным склерозом перед стимуляцией (слева), после стимуляции остатками 83-99 МОБ (середина) и после стимуляции остатками 83-99 МОБ (справа).

На фигуре 2 представлена идентификация с помощью FACS клеток, экспрессирующих CD69 и IFN-γ (сверху) и CD69 и TNFα (внизу) у здорового пациента контрольной группы перед стимуляцией (слева), после стимуляции остатками 83-99 МОБ (середина) и после стимуляции остатками 83-99 МОБ (справа).

Детальное описание изобретения

1. Определения

Для помощи в понимании настоящего изобретения ниже определен ряд терминов.

Термин "аутоантиген", как используют в данном контексте, относится к антигену или эпитопу, который является нативным для млекопитающего, который является иммуногенным при указанном заболевании млекопитающего и консервативным у данного вида млекопитающих и который может быть включен в патогенез аутоиммунного процесса.

Термин "CD", "кластер дифференцировки" или "общая детерминанта", как используют в данном контексте, относится к молекулам клеточной поверхности, распознаваемым антителами. Экспрессия некоторых CD является специфичной для клеток определенной линии или пути созревания, а экспрессия других отличается в соответствии со статусом активации, положения или дифференцировки одних и тех же клеток.

Термин "полученный (выделенный) из" или "его производное (модификация)" в контексте нуклеотидных последовательностей означает, что нуклеотидная последовательность не ограничена описанной специфичной последовательностью, но также включает изменения в данной последовательности, которые могут включать добавления, делеции, замены или модификации в той степени, в которой изменения в описанной последовательности сохраняют способность гибридизоваться в умеренных или очень жестких условиях с комплементом описанной последовательности. В контексте пептидных или полипептидных последовательностей термин "полученный из" или "его производное (модификация)" означает, что пептид или полипептид не ограничен описанной специфической последовательностью, но также включает изменения в данной последовательности, которые могут включать добавления, делеции, замены или модификации в той степени, в которой изменения в указанной последовательности сохраняют способность вызывать иммунный ответ на описанную последовательность.

Термин "иммуногенный" при использовании для описания пептида или полипептида означает, что пептид или полипептид способен индуцировать иммунный ответ, опосредованный как Т-клеткой, так и антителом или обоими.

Термин "иммунное заболевание" означает заболевание, при котором иммунная система участвует в патогенезе заболевания. Аутоиммунные заболевания представляют собой подгруппу иммунных заболеваний. Аутоиммунные заболевания включают, но без ограничения перечисленным, ревматоидный артрит, злокачественную миастению, рассеянный склероз, системную красную волчанку, аутоиммунный тиреоидит (тиреоидит Хашимото), болезнь Грейвса, воспалительную болезнь кишки, аутоиммунный увеоретинит, полимиозит и некоторые типы диабета. В свете настоящего описания компетентный специалист в данной области может легко представить другие аутоиммунные заболевания, поддающиеся лечению композициями и способами, соответствующими настоящему изобретению.

Термин "ПЦР" означает полимеразную цепную реакцию, например, как в основном описано в патенте США No. 4683202 (выданном 28 июля 1987 г. Mullis), который включен в данном контексте в виде ссылки. ПЦР представляет собой методику амплификации, в которой выбранные олигонуклеотиды или праймеры можно гибридизовать с нуклеиновыми кислотами-матрицами в присутствии полимеризационного агента (такого как ДНК-или РНК-полимераза) и нуклеотидтрифосфатов, причем продукты удлинения могут быть образованы из праймеров. Затем эти продукты можно денатурировать и использовать в качестве матриц в циклической реакции, которая амплифицирует число и количество имеющихся нуклеиновых кислот, что может облегчить их последующую детекцию. Множество методик ПЦР известно в области техники и может быть использовано в связи с приведенным в данном контексте описании.

"Пептид" или "полипептид" представляет собой связанную последовательность аминокислот и может быть природным, синтетическим или модификацией либо комбинацией природного и синтетического.

Термин "праймер" означает олигонуклеотид, природный ли, синтетический или его модификацию, способный действовать как точка инициации синтеза нуклеотида, достаточно комплементарного специфичной нуклеотидной последовательности на молекуле-матрице.

Термин "зонд" означает олигонуклеотид, природный ли, синтетический или его модификацию, способный к специфичному связыванию достаточно комплементарной нуклеотидной последовательности.

Термин "заболевание, опосредованное Т-клетками" означает заболевание, возникающее в результате распознавания Т-клетками собственных антигенов.

Термин "терапия" или "лечение", когда он относится к защите животного от заболевания, означает предупреждение, супрессию, подавление или полное устранение заболевания. Предупреждение заболевания включает введение композиции, соответствующей настоящему изобретению, до начала заболевания. Супрессия заболевания включает введение композиции, соответствующей настоящему изобретению, животному после индукции заболевания, но до его клинического проявления. Подавление заболевания включает введение композиции, соответствующей настоящему изобретению, животному после клинического проявления заболевания.

2. Выделение антигенспецифических Т-клеток

а. Выделение моноклональных антигенспецифических Т-клеток

Т-клетки могут быть активированы и размножены в культуре клеток посредством инкубирования с антигеном-мишенью и антиген-презентирующими клетками. После активации в Т-клетках происходит сложный каскад передачи клеточного сигнала, который приводит к транскрипции и экспрессии продуктов многих генов. Изобретение, описанное в данном контексте, обладает преимуществом продуктов генов, специфичных для активированных Т-клеток, в плане идентификации и выделения Т-клеток с требующейся антигенной специфичностью.

В первом аспекте настоящее изобретение направлено на способ выделения Т-клетки, специфичной в отношении представляющего интерес антигена. Образец, включающий Т-клетки, инкубируют с определенным антигеном, который вызывает активацию Т-клеток, специфичных в отношении представляющего интерес антигена. Образец можно инкубировать с антигеном в течение 1-7 дней. Образец можно также инкубировать с антигеном в течение менее чем 1 дня. Образец можно также инкубировать с антигеном в течение менее чем 16 часов. Образец можно также инкубировать с антигеном в течение менее чем 12 часов. Образец можно также инкубировать с антигеном в течение менее чем 8 часов. Образец можно также инкубировать с антигеном в течение менее чем 4 часов. Образец можно также инкубировать с антигеном в течение менее чем 2 часов.

Т-клетка, специфичная в отношении представляющего интерес антигена, затем может быть выделена посредством селекции Т-клеток, которые экспрессируют продукты генов Т-клеток, активированных как описано выше.

Подгруппы активированных Т-клеток могут быть выделены посредством селекции Т-клеток с использованием специфичных для подгруппы продуктов генов или маркеров клеточной поверхности (например, CD4 относительно CD8).

Представляющий интерес антиген включает миелиновый основной белок (МОБ), белок протеолипида (ПЛБ), гликопротеин миелина олигодендроцитов (ГМО) или его фрагмент. Представляющий интерес антиген может также являться иммунодоминантным фрагментом, включающим, но не ограниченным остатками 83-99 или остатком 151-170 МОБ. Представляющий интерес антиген может также представлять собой комбинацию двух или более индивидуальных антигенов, представляющих интерес.

Антиген или его производное, используемые для активации Т-клеток, может быть любым иммуногеном, который способен вызывать иммунный ответ на антиген, представляющий интерес. Активирующий антиген может быть антигеном, представляющим интерес, или его производным. Активирующий антиген может быть МОБ, ПЛБ, ГМО или его фрагментом и/или производным. Активирующий антиген может также быть иммунодоминантным фрагментом, включающим, но не ограниченным остатками 83-99 или остатком 151-170 МОБ или их фрагментом и/или производным. Активирующий антиген может также быть комбинацией двух или более индивидуальных активирующих антигенов. Активирующий антиген может быть использован один или более раз для активации Т-клеток, специфичных в отношении антигена, представляющего интерес.

Т-клетки могут присутствовать в любом образце, содержащем мононуклеарные клетки. Образец может быть выделен из периферической крови или спинномозговой жидкости больного PC или из синовиальной жидкости больного РА. Т-клетки больных другими аутоиммунными заболеваниями можно аналогичным образом выделить из периферической крови и/или тканей, имеющих отношение к заболеванию. Можно обогатить образец мононуклеарными клетками путем использования методик с применением центрифугирования, известных специалистам в данной области, включая, но без ограничения перечисленным, градиенты Ficoll®. Образец может быть также обогащен Т-клетками при использовании положительной селекции, отрицательной селекции или их комбинации с целью экспрессии продуктов генов Т-клеток.

Продукт гена для идентификации или отрицательной селекции активированных Т-клеток может представлять собой клеточный поверхностный маркер или цитокин или их комбинацию. Клеточные поверхностные маркеры для идентификации активированных Т-клеток включают, но без ограничения перечисленным, CD69, CD4, CD8, CD25, HLA-DR, CD28 и CD134. CD69 представляет собой ранний маркер активации, обнаруженный на В- и Т-лимфоцитах, NK-клетках (натуральных киллерах) и гранулоцитах. CD25 представляет собой рецептор IL-2 и является маркером для активированных Т-клеток и В-клеток. CD4 представляет собой сорецептор ТкР и является маркером для тимоцитов, Т-клеток Т_H1- и Т_H2-типа, моноцитов и макрофагов. CD8 также представляет собой сорецептор ТкР и является маркером для цитотоксических Т-клеток. CD134 экспрессируется только в активированных Т-клетках CD4⁺.

Клеточные поверхностные маркеры для отрицательной селекции активированных Т-клеток включают, но без ограничения перечисленным, CD36, CD40 и CD44. CD28 действует как стимуляторный путь активации Т-клеток, независимый от пути Т-клеточного рецептора, и экспрессируется на клетках CD4⁺ и CD8⁺. CD36 представляет собой мембранный гликопротеин и является маркером для тромбоцитов, моноцитов и эндотелиальных клеток. CD40 является маркером для В-клеток, макрофагов и дендритных клеток. CD44 является маркером для макрофагов и других фагоцитирующих клеток. Подтипы Т-клеток могут быть выделены с использованием положительной селекции, отрицательной селекции или их комбинации для экспрессии продуктов клеточной поверхности генов хелперных Т-клеток или цитотоксических Т-клеток (например, CD4 относительно CD8).

Цитокины для идентификации активированных Т-клеток, соответствующих настоящему изобретению, включают, но без ограничения перечисленным, цитокины, продуцируемые Т-клетками Т_H1-типа (ответ, опосредованный клетками) и Т-клетками Т_H2-типа (ответ антител). Цитокины для идентификации активированных Т-клеток Т_H1-типа включают, но без ограничения перечисленным IL-2, тканевой фактор некроза опухоли (TNFα), гамма-интерферон (IFN-γ). Цитокины для идентификации активированных Т-клеток Т_H2-типа включают, но без ограничения перечисленным, IL-4, IL-5, IL-10 и IL-13. Подтипы Т-клеток также могут быть выделены при использовании положительной, селекции, отрицательной селекции или их комбинации для экспрессии продуктов цитокиновых генов хелперных Т-клеток или цитотоксических Т-клеток (например, γ-IFN относительно IL-4).

Активированная Т-клетка Т_H1-типа, специфичная в отношении представляющего интерес антигена, может быть выделена посредством идентификации клеток, которые экспрессируют CD69, CD4, CD25, IL-2, INF-γ TFNα или их комбинацию. Активированная Т-клетка Т_H1-типа, специфичная в отношении представляющего интерес антигена, может быть также выделена путем идентификации клеток, которые экспрессируют CD69 и CD4 вместе с IFN-γ или TFNα. Активированная Т-клетка Т_H2-типа, специфичная в отношении представляющего интерес антигена, может быть выделена путем идентификации клеток, которые экспрессируют CD69, CD4, IL-4, IL-5, IL-10, IL-13 или их комбинацию. Комбинация активированной Т-клетки Т_H1-типа и Т-клетки Т_H2-типа, специфичных в отношении представляющего интерес антигена, может быть выделена путем идентификации клеток, которые экспрессируют CD69, CD4, CD25, IL-2, IFNγ, TFNα или их комбинацию, и клеток, которые экспрессируют CD69, CD4, IL-4, IL-5, IL-10, IL-13 или их комбинацию.

Продукты генов, используемые для положительной или отрицательной селекции активированных Т-клеток, соответствующих настоящему изобретению, можно идентифицировать с помощью методик иммуноселекции, известных специалистам в данной области, в которых используют антитела, включая, но без ограничения, клеточный сортинг с возбуждением флуоресценции (FACS), магнитный клеточный сортинг, пэннинг и хроматографию. Иммуноселекцию двух или более маркеров на активированных Т-клетках можно осуществить в одну или более стадий, причем на каждой стадии проводится положительная или отрицательная селекция по одному или более маркеров. Когда иммуноселекцию двух или более маркеров проводят в одну стадию при использовании FACS, два или больше различных антител могут быть помечены различными флуорофорами.

Магнитный клеточный сортинг осуществляют при использовании суперпарамагнитных микрочастиц, состоящих из оксида железа и полисахаридного покрытия. Предпочтительно микрочастицы могут быть приблизительно 50 нм в диаметре и иметь объем, составляющий примерно одну миллионную часть от типичной клетки млекопитающего. Предпочтительно, когда микрочастицы достаточно маленькие для того, чтобы оставаться в коллоидной суспензии, которая обеспечивает быстрое эффективное связывание с антигенами клеточной поверхности. Предпочтительно, когда микрочастицы не нарушают процесс проточной цитометрии и являются биоразрушаемыми, а также оказывают пренебрежимо маленький эффект на клеточные функции. Связывание антитела с микрочастицами может быть прямым и непрямым посредством второго антитела к лиганду, такому как флуоресцеин.

Антитело может быть антителом классов IgG, IgM, IgA, IgD и IgE или их фрагментами и производными, включая Fab, F(ab')₂, Fd, и одноцепочечными антителами, диантителами, биспецифическими антителами, бифункциональными антителами и их производными. Антитело может быть моноклональным антителом, поликлональным антителом, аффинно-очищенным антителом или их смесями, которые проявляют достаточную специфичность связывания с эпитопом продукта гена, специфичного для активированных Т-клеток, или полученных из них последовательностей. Антитело может быть химерным антителом.

Антитело может быть дериватизировано путем присоединения одной или более химических, пептидных или полипептидных структур, известных в области техники, которые позволяют идентифицировать и/или отбирать активированную Т-клетку, с которой связано антитело. Антитело может быть конъюгировано с химической молекулой, такой как флуоресцентный краситель. Активированная Т-клетка, связанная с антителом с флуоресцентной метой, может быть выделена с использованием методик, включающих, но без ограничения перечисленным, клеточный сортинг с возбуждением флуоресценции (FACS). Антитело может быть также конъюгировано с магнитной частицей, такой как парамагнитная микрочастица (Miltenyi Biotec, Germany). Активированную Т-клетку, связанную с антителом с магнитной меткой, можно выделить при использовании методик, включающих, но без ограничения перечисленным, магнитный клеточный сортинг.

Для продуктов генов, экспрессирующихся на клеточной поверхности, антитело может непосредственно связываться с продуктом гена и может быть использовано для селекции клеток. Для продуктов генов, экспрессирующихся в низких концентрациях на клеточной поверхности, для селекции клеток можно использовать магнитофлуоресцентные липосомы (см. статью Scheffold, et al. Nature Med 6: 107-110, 2000). При низких уровнях экспрессии обычные антитела с флуоресцентной меткой могут быть недостаточно чувствительными для детекции присутствия продукта гена, экспрессирующегося на клеточной поверхности. Липосомы, содержащие флуорофор, могут быть конъюгированы с антителами с представляющей интерес специфичностью, обеспечивая таким образом возможность детекции продукта гена, экспрессирующегося на клеточной поверхности.

Для внутриклеточных продуктов гена, таких как цитокины, антитело может быть использовано после нарушения проницаемости клеток. Альтернативно, чтобы избежать гибели клеток при нарушении проницаемости, внутриклеточный продукт гена, если он конечном счете секретируется клеткой, может быть определен, поскольку он секретируется через клеточную мембрану, с помощью "захватывающего" антитела на клеточной поверхности. Захватывающее антитело может быть двойным антителом, которое является специфичным в отношении двух различных антигенов: (i) секретируемого продукта гена, представляющего интерес, и (ii) белка клеточной поверхности. Белок клеточной поверхности может быть любым поверхностным маркером, находящемся на Т-клетках, в частности, и лимфоцитах, в общем (например, CD45). Захватывающее антитело может сначала связываться с белком клеточной поверхности, а затем с внутриклеточным продуктом гена, представляющим интерес, поскольку он секретируется через клеточную мембрану, оставляя при этом продукт гена на поверхности клетки. Меченое антитело, специфичное в отношении захваченного продукта гена, затем можно использовать для связывания с захваченным продуктом гена, который дает возможность проведения селекции активированной Т-клетки (см. статью Manz, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 1921-1925, 1995, которая включена в данном контексте в виде ссылки).

Обнаружено, что некоторые формы цитокинов экспрессируются в низкой концентрации на клеточной поверхности. Например γIFN представлен в низкой концентрации на клеточной поверхности с кинетикой, подобной кинетике экспрессии внутриклеточного γIFN (см. статью Assenmacher, et al. Eur J. Immunol, 1996, 26: 263-267). Для форм цитокинов, экспрессирующихся на клеточной поверхности, можно использовать обычные антитела с флуоресцентной меткой или липосомы, содержащие флуорофоры, для детекции цитокина, представляющего интерес. Обычному специалисту в данной области будут известны другие методики обнаружения и селекции внеклеточных и внутриклеточных продуктов генов, специфичных для активированных Т-клеток.

Т-клетки, выделенные посредством настоящего изобретения, могут быть обогащены из цельной крови по меньшей мере до 90%. Т-клетки могут быть обогащены из цельной крови по меньшей мере до 95%. Т-клетки могут быть обогащены из цельной крови по меньшей мере до 98%. Т-клетки могут быть обогащены из цельной крови по меньшей мере до 99,5%.

б. Выделенные моноклональные антигенспецифические Т-клетки

Во втором аспекте настоящее изобретение направлено на Т-клетку, специфичную в отношении представляющего интерес антигена, выделенного согласно способу, соответствующему первому аспекту настоящего изобретения.

в. Выделение поликлональных антигенспецифических Т-клеток

В третьем аспекте настоящее изобретен