Способ ранней диагностики прогрессирования идиопатического сколиоза

Способ ранней диагностики прогрессирования идиопатического сколиоза

Реферат

Изобретение относится к медицине, а именно к ортопедии, и может быть использовано в качестве диагностического биохимического теста, способного с долей вероятности около 70% предположить возможность прогрессирования сколиотической деформации у детей на ранних стадиях ее формирования, может служить полезной информацией для дальнейших поисков диагностических тестов в области исследования метаболизма протеогликанов.

Известны способы диагностики ранних стадий сколиоза путем клинико-рентгенологического обследования больных (В.Д.Чаклин, Е.А.Абальмасова в кн. «Сколиоз и кифозы», 1973, М., Медицина, с.255; Morrissy R.T. School screening for scoliosis // SPINE, 1999, Vol.24, P.2584-2591), которые заключаются в динамическом рентгенологическом наблюдении (3-6 месяцев). При появлении нарастающей боковой деформации, выявляемой по отклонению остистых отростков от средней линии и торсии тел позвонков, диагностируют идиопатический сколиоз (ИС). Способ информативен для развившегося идиопатического сколиоза, но не позволяет осуществлять диагностику на ранних стадиях заболевания.

Наиболее близким к заявляемому изобретению является способ диагностики прогрессирующей формы идиопатического сколиоза путем биохимического исследования биологических жидкостей (Патент RU 2194988, МПК 7 G01N 33/52), сущность которого заключается в следующем. В моче больного определяют количество сульфатированных гликозаминогликанов (С-ГАГ) и при показателе выше 10,0 мг/моль креатинина проводят повторное определение через 3-6 месяцев и при нарастании количества С-ГАГ в пределах 15-20 мг/моль креатинина и выше диагностируют прогрессирующую форму идиопатического сколиоза. Однако из-за особенности обменных процессов у людей (детей и взрослых) независимо от данного заболевания с мочой может выводиться значительное количество аминокислот, содержащих серу (например, цистин, глутамин), что ведет к получению ложноположительных результатов, поскольку применяемый для выявления С-ГАГ в моче краситель ациановый синий 8GX не специфически реагирует с сульфатными группами органических веществ.

Задача изобретения: предложить способ ранней диагностики вероятности прогрессирования сколиотической болезни до ее клинического проявления.

Техническим результатом изобретения является ранняя диагностика вероятности прогрессирования сколиотической болезни до ее клинического проявления, повышение точности диагностики путем исключения ложноположительных результатов.

Решение поставленной задачи даст возможность профилактировать прогрессирование, избежать (по возможности) оперативного лечения, снизить инвалидность и сохранить работоспособность.

Технический результат достигается за счет того, что определяют количество сульфатированных ГАГ и активность лизосомальных ферментов в сыворотке крови.

В результате проведенных популяционных исследований (Wise CA et al. // Spine, 2000, Vol.25, P.2372; Salehi LB et al. // Hum Genet. 2002. Vol.111. P.401; Аксенович Т.И. и др. // Генетика, 1988. Т.24. с.2056; Аксенович Т.И., Зайдман А.М. и др. // Генетика, 1999, т.35, с.255) был установлен наследственный характер сколиотической болезни. Одним из критических звеньев метаболических процессов в позвоночнике, нарушение которых может привести к структурным и функциональным изменениям соединительно-тканных и хрящевых компонентов позвоночника, являются протеогликаны (ПГ) - основной компонент хрящевых тканей (Oegema TRJ et al. // Spine, 1983, N 8, P.378-384; Ponseti IV et al. // Clin. Ortop. 1976. Vol.156. P.79-90). Кроме того, эти вещества оказывают большое влияние на формирование костной ткани, регулируя сборку коллагеновых фибрилл и очагов отложения минерального компонента кости в процессе ее формирования и роста. Сопротивление тканей биомеханическим нагрузкам, проницаемость тканей и формирование межклеточного матрикса зависят от полноценности структуры ПГ. Исследования ПГ, предпринятые в ННИИТО, выявили существование химических нарушений в структуре их углеводного компонента - гликозаминогликанов (Русова Т.В., Рыкова В.И. и др. // БЭБМ. 2005. Т.139. №6. С.740-742). Эти нарушения снижают возможность присоединения сульфатных групп к цепям ГАГ, и в результате формируются структурно и функционально измененные ткани позвоночника, не способные противостоять предъявляемым биомеханическим и функциональным нагрузкам в период активного роста организма.

Наши исследования детей, больных ИС, и их родственников в Новосибирске и Красноярске, а также пациентов клиники ННИИТО (всего 946 чел.) показали, что у больных сколиотической болезнью в сыворотке крови снижено количество сульфатированных ГАГ (у 73% детей с диагностированной III - IV стадией заболевания) и повышена активность катепсина Д (70% детей с диагностированной III-IV стадией заболевания) и α-галактозидазы (100% детей с диагностированной III-IV стадией заболевания). Таким образом, сколиотическую болезнь, как генетически наследуемую патологию, одним из аспектов патогенеза которой является системное нарушение структуры и обмена протеогликанов, можно диагностировать до стадии клинического проявления лабораторными методами в сыворотке крови у лиц с подозрением на данное заболевание.

Поставленная задача решается за счет того, что определяют количество сульфатированных ГАГ и активность лизосомных ферментов катепсина Д и α-галактозидазы, и при снижении количества сульфатированных ГАГ в 1,5 и более раза, увеличении активности катепсина Д в 1,5-2 раза, активности α-галактозидазы - в 1,5-10 раз прогнозируют в доклинической стадии прогрессирование идиопатического сколиоза.

Способ осуществляется следующим образом.

Определение количества сульфатированных ГАГ.

Для выделения ГАГ из сыворотки использован метод Карякиной Е.В. и Косягина Д.В. (Определение гликозаминогликанов сыворотки крови // Лаб. дело, 1982, №10, стр.591-593). К 0,5 мл сыворотки добавляют 1,5 мл физиологического раствора и 0,2 мл 0,1 М ацетатного буфера рН 5,8 с 0,01 М цистеином и 0,01 М ЭДТА с 3 мг папаина. Полное расщепление белков происходит в течение 18 часов при 65°С. Для удаления белков из раствора к нему добавляют 0,12 мл 100% ТХУ и оставляют на 30 мин в холодильнике. Затем центрифугируют при 10000 об/мин 10 мин (осадок можно отделить фильтрованием через мелкопористый фильтр). ГАГ остаются в надосадочной жидкости. Эту жидкость отбирают, нейтрализуют 1 н раствором NaOH (0,1 мл) и добавляют 6 мл этанола, содержащего 4% ацетат калия, тщательно перемешивают и оставляют при -18°С на 12 часов для осаждения ГАГ. Осадок центрифугируют при 3000 об/мин в течение 15 мин. Полученный осадок подсушивают, переворачивая пробирку и давая стечь избытку этанола, и растворяют в 100 мкл воды.

Для определения количества сульфатированных ГАГ использован метод J.G.N.Jong, R.A.Wevers, C.Laarakkers, J.H.M.Poorthuis (Clin. Chem. 1989. V.35. pp.1472-1477). Растворяют 2,1 мг диметилметилена голубого в 200 мл 55 мМ муравьиной кислоты (конечный рН раствора 3,3). Раствор хранится при комнатной температуре. К 100 мкл раствора ГАГ добавляют 2,5 мл раствора красителя. Окраска развивается немедленно и устойчива в течение 3 мин; ее интенсивность измеряют на спектрофотометре при длине волны 520 нм. В качестве стандарта использован хондроитинсульфат С (концентрация в пробе от 2 до 30 мкг). Результаты выражаются в мг хондроитинсульфата С на литр сыворотки.

Определение активности α-галактозидазы в сыворотке кроем (метод Barren A.J., Heath M.F. Lysosomal enzymes // In: J.T.Dingle ed. Lysosomers: a Laboratory Handbook. Amsterdam. - London: North Holland, 1972. P.46-135).

Субстрат 4-умбеллиферил (МУФ)-β-Д-галактопиранозид растворяют в 0,1 М ацетатном буфере рН 4,0 (0,25 мг/мл). Для остановки реакции используют 0,2 М раствор Na₂CO₃. В качестве контроля используют такую же пробу без инкубации.

Ход реакции: сыворотку крови перед инкубацией разводят в 1000 раз физиологическим раствором. 20 мкл разведенной сыворотки добавляют к 80 мкл раствора субстрата и инкубируют 20 мин в термостате при 37°С. Реакцию останавливают 1 мл раствора карбоната натрия. Флюоресценцию измеряют при длине волн 362 нм (возбуждение) и 448 нм (эмиссия).

Активность фермента рассчитывают по формуле: ΔА*11,33,

где ΔА - разница экстинций между опытом и контролем,

11,33 - молярный коэффициент пересчета, выражающий активность фермента в наномолях освобожденного МУФ за 1 мин на 1 мл сыворотки.

Определение активности катепсина Д (метод Barrett A.J., Heath M.F.Lysosomal enzymes // In: J.T.Dingle ed. Lysosomers: a Laboratory Handbook. Amsterdam. - London: North Holland, 1972. P.46-135).

В качестве субстрата используется водный раствор гемоглобина 2,5%. Реакцию останавливают 5% ТХУ. В качестве среды инкубации используют 0,1 М ацетатный буфер рН 3,6.

Схема реакции: К 600 мкл раствора гемоглобина добавляют 600 мкл 0,1 М ацетатного буфера и 300 мкл сыворотки, разведенной в 3 раза физиологическим раствором. Смесь ставят в термостат при 37°С и инкубируют 1 час. Реакцию останавливают 1500 мкл 10% ТХУ. В качестве контроля используют такую же пробу без инкубации в термостате. Смесь центрифугируют при 10000 об/мин 15 мин. Об активности фермента судят по количеству свободного тирозина в смеси, который измеряют на спектрофотометре при длине волны 280 нм.

Расчет активности: ΔА*9,86,

где ΔА - разница экстинций между опытом и контролем,

9,86 - молярный коэффициент, выражающий активность фермента в микромолях тирозина на 1 мл сыворотки.

Нормальные значения тестов находятся в пределах:

количество С-ГАГ - 40,0-70,0 мкг ХС-«С»/мл;

активность катепсина D - 0-0,2 микромоль тирозина/мл.час;

активность α-галактозидазы - 10-20 наномолей МУФ/мл.час.

Примеры применения способа.

1. При медико-генетическом обследовании детей с нарушением осанки и членов их семей выявлена семья:

Девочка О. (11 лет), нарушение осанки.

Уровень исследованных параметров в сыворотки крови составил:

активность α-галактозидазы - 75,6 нМ МУФ/мл·час,

активность катепсина Д - 0,25 мкМ тирозина/мл·час,

количество С-ГАГ - 18,6 мкг/мл.

Наблюдения в течение года выявили прогрессирование нарушения осанки.

Ее троюродный брат А., 14 лет. Без нарушений осанки.

активность α-галактозидазы - 15,6 нМ МУФ/мл·час,

активность катепсина Д - 0,05 мкМ тирозина/мл·час,

количество С-ГАГ - 48,6 мкг/мл.

Наблюдения в течение года не выявили нарушения осанки.

Ее троюродная сестра А., 10 лет (родная сестра троюродного брата А.). Нарушение осанки.

активность α-галактозидазы - 101,1 нМ МУФ/мл·час,

активность катепсина Д - 0,28 мкМ тирозина/мл·час,

количество С-ГАГ - 8,6 мкг/мл.

Наблюдения в течение года выявили прогрессирование нарушения осанки.

2. Мальчик М., 12 лет. Нарушение осанки.

Уровень исследованных параметров в сыворотки крови составил:

активность α-галактозидазы - 11,0 нМ МУФ/мл·час,

активность катепсина Д - 0,11 мкМ тирозина/мл·час,

количество С-ГАГ - 32,2 мкг/мл.

Через 2 года наблюдения не отмечено прогрессирования нарушения осанки.

Способ ранней диагностики прогрессирования идиопатического сколиоза, включающий определение сульфатированных гликозаминогликанов, отличающийся тем, что исследуют сыворотку крови, определяют содержание сульфатированных ГАГ, активность лизосомных ферментов катепсина Д и α-галактозидазы, и при снижении количества сульфатированных ГАГ в 1,5 и более раз, увеличении активности катепсина Д в 1,5-2 раза, активности α-галактозидазы - в 1,5-10 раз относительно нормы, определяют в доклинической стадии вероятность прогрессирования идиопатического сколиоза.