Способ иммобилизации остеогенных стромальных стволовых клеток костного мозга

Способ иммобилизации остеогенных стромальных стволовых клеток костного мозга

Реферат

Изобретение относится к медицине и биологии, а именно к трансплантологии и цитологии, и может быть использовано для получения иммобилизованной трехмерной монокультуры остеогенных стромальных стволовых клеток костного мозга с устойчивой пространственной организацией на биологически инертном твердофазовом пористом металлическом каркасе с заданными параметрами количества и плотности форменных элементов с длительным сохранением их пролиферативной активности и тканевой дифференцировки.

Известен способ (Дамбаев Г.Ц., Гюнтер В.Э., Загребин Л.В. и др. Патент RU №2143867 «Имплантат для хирургического лечения заболеваний внутренних органов») иммобилизации культивированных эмбриональных (9-11 недель гестации) клеток поджелудочной железы в комплексе с клетками печени, тимуса, костного мозга на пористом носителе из никелида титана. Благодаря свойствам клеточного носителя удалось фиксировать и физически иммуноизолировать островки поджелудочной железы, отсрочить реакцию отторжения материала при аллотрансплантации, увеличить срок действия трансплантата.

Общими признаками являются:

1. Диффузионное осаждение клеточной суспензии на пористом проницаемом твердофазовом биологически инертном клеточном носителе.

2. Пространственная организация иммобилизованной клеточной культуры на трехмерном каркасе.

Недостатки:

1. Комбинация в клеточной суспензии фенотипически различных форменных элементов из тканевого материала различных эмбриональных органов тканей 9-11 недель гестации.

2. Конкурентное межклеточное взаимодействие фенотипически различных форменных элементов при неспецифической поверхностной адгезии на субстрате носителя в условиях смешанной культуры.

3. Слабая неспецифическая поверхностная адгезия используемых клеточных элементов в обычных условиях с неустойчивостью их фиксации на субстрате носителя и постепенной обратной диффузией по сквозным каналам ячеек за пределы пористого каркаса.

Способ предназначен для физической иммуноизоляции в условиях диффузионной камеры из пористого металлического каркаса эмбриональных инсулинпродуцирующих β-клеток островков Лангерганса поджелудочной железы без их иммобилизации с целью пролонгации их гормональной функции и не может быть использован для стабильной иммобилизации остеогенных стромальных стволовых клеток костного мозга с длительным сохранением их пролиферативной активности и остеогенной дифференцировки.

Известен способ иммобилизации выращенных в культуре стромальных стволовых клеток костного мозга на пористых керамических цилиндрах из гидроксиапатита и трифосфата кальция (Bruder S.P., Kraus K.H., Goldberg V.M., Kadiyala S. The effect of implants loaded with autologous mesenchymal stem cells on the healing of canine segmental bone defects. // J Bone Joint Surg. Am. 1998. Vol.80. N7. P.985-995). Благодаря предложенной экспериментальной модели удалось убедительно продемонстрировать возможность использования иммобилизованных стромальных стволовых клеток костного мозга для аутотрансплантации.

Общими признаками являются:

1. Пространственная организация монокультуры стромальных стволовых клеток костного мозга на трехмерном пористом твердофазовом каркасе.

2. Покрытие поверхности клеточного носителя протеиновой оболочкой.

Недостатки:

1. Активное диффузионное осаждение клеточной суспензии методом вакуум-аспирации ведет к механическим, осмотическим и бародинамическим повреждениям форменных элементов.

2. Стромальные стволовые клетки без остеогенной индукции не способны устойчиво поддерживать направленную тканевую дифференцировку.

3. Быстрая электрохимическая и ферментативная биодеградация керамического носителя из гидроксиапатита (65%) и трифосфата кальция (35%) препятствует стабильной пространственной организации и поверхностной адгезии клеточных элементов.

Способ предназначен для временного заполнения диффузионной камеры из пористого керамического каркаса и иммобилизации стромальных стволовых клеток костного мозга без остеогенной индукции и не может быть использован для стабильной иммобилизации пространственно организованных остеогенных стромальных стволовых клеток костного мозга с длительной пролонгацией их пролиферативной активности и остеогенной дифференцировки.

Наиболее близким к заявленному является способ иммобилизации остеогенных стромальных стволовых клеток костного мозга на губчатом костном или пористом керамическом матриксе (Чайлахян Р.К., Патент RU №2167662 «Способ восстановления целостности костей и трансплантат для его осуществления»). Автор предложил метод трансплантации иммобилизованных на губчатом костном матриксе и пористом гидроксиапатите остеогенных стромальных стволовых клеток костного мозга, который заключается в следующем. Под местным обезболиванием резецируется часть крыла тазовой кости, из которой костный мозг выскребается в питательную среду. Клеточную взвесь готовят методом трипсинизации и эксплантируют в пластиковые флаконы с питательной средой, состоящей из 80% среды L-MEM и 20% сыворотки эмбрионов коров с добавлением антибиотиков (по 100 ед/мл пенициллина и стрептомицина), а также метилпреднизолона (10 нг/мл), ascorbate-Na и гидрокортизона (по 10 нг/мл). Выросшие на 1-14 день колонии стромальных клеток-предшественников снимают с пластика и в дальнейшем культивируют на коллагеновых микроносителях в питательной среде того же состава. Микроносителями с выросшими на них клетками заполняют пористые каркасы, которые для лучшей адгезии клеток на поверхности их пор предварительно обрабатывали 0,5% раствором поли-L-лизина или фибронектина. После заполнения клетками пористые каркасы выдерживают во влажной камере 30-45 мин при 37°С. Подготовленный таким образом комбинированный трансплантат переносят аутологично в область костного дефекта. Через 1,5-2 месяца на месте трансплантации образуется новая кость, которая хорошо встраивается в материнскую, восстанавливая целостность костного органа.

Общими признаками являются:

1. Получение суспензии остеогенных стромальных стволовых клеток костного мозга путем фракционирования его форменных элементов и культивации в ростовой среде с добавлением дифференцировочных индукторов.

2. Осаждение посредством диффузии клеточной суспензии на пористом каркасе.

3. Покрытие поверхности клеточного носителя протеиновой оболочкой.

Недостатки:

1. Присутствие в исходной суспензии примеси попутных форменных элементов жировой, соединительной, эндотелиальной и др. тканей, так как механическая фрагментация и ферментативная обработка губчатой кости препятствует получению очищенного препарата костного мозга.

2. Межклеточные взаимодействия форменных элементов тканевых примесей угнетают пролиферацию и дифференцировку стромальных стволовых клеток костного мозга.

3. Коллагеновые микроносители в ходе культивации в суспензионной среде конкурентно блокируют клеточные эффекторы неспецифической поверхностной адгезии с поверхностью пористого каркаса.

4. Неустойчивость индукции тканевой дифференцировки иммобилизованных стромальных стволовых клеток костного мозга в условиях трансплантации.

5. Ферментативная и электрохимическая нестойкость свободных костных трансплантатов и пористой керамики ведет к их быстрой биодеградации и препятствует стабильной пространственной организации и поверхностной адгезии клеточных элементов.

Способ предназначен для временного заполнения диффузионной камеры из губчатого костного или пористого керамического каркаса иммобилизованными на коллагеновом микроносителе форменными элементами тканевых фракций губчатой кости, обогащенных стромальными стволовыми клетками.

Задачей изобретения является создание иммобилизованной трехмерной монокультуры остеогенных стромальных стволовых клеток костного мозга с устойчивой пространственной организацией на биологически инертном твердофазовом пористом металлическом каркасе, с заданными параметрами количества и плотности форменных элементов с пролонгированной пролиферативной активностью и тканевой дифференцировкой для моделирования тканевой структуры и репаративной функции губчатой кости.

При решении поставленной задачи имеет место лечебный эффект, который заключается в локальном восстановлении репаративного остеогенеза у пациентов с различными его нарушениями как местного, так и системного характера, исключении риска ятрогенного инфицирования, снижении вероятности микробиологической контаминации клеточного материала, а также объема хирургической агрессии за счет отказа от резекции костных трансплантатов в качестве источника клеточного материала и структурного каркаса.

Заготовки из пористого никелида титана легко моделируются по форме и размерам. Они обеспечивают прочный контакт с материнским ложем за счет шероховатой пористой поверхности и высокой биомеханической и биохимической совместимости, играют роль фиксатора-распорки и пространственного трехмерного каркаса на протяжении всего времени формирования костного регенерата.

Тканевая репарация идет по первичному типу, компенсируются локальные расстройства репаративной регенерации (дефицит тканей, обширный тканевой дефект, заполнение тканевого дефекта брадитрофной с низкой клеточностью фиброзной тканью). Предотвращается интерпозиция тканевых структур быстро растущей грануляционной тканью, избыточное и гетерогенное формирование тканевого регенерата и окружающих его тканей. В связи с этим достигается ускорение и оптимизация репаративных процессов, предоставляется возможность отказаться от других видов пластического замещения тканевых дефектов.

Экономический эффект заключается в сокращении материальных затрат на проведение экспериментальных и клинических исследований и оценку эффективности коррекции нарушений тканевой репарации путем применения универсальной технологии структурного восстановления гистогенеза в виде устойчивой трехмерной модели стабильного источника клеточной пролиферации, дифференцировки и продукции гуморальных факторов, что связано с упрощением ее технического исполнения и использования. Экспериментальное и клиническое использование способа значительно снижает объем и стоимость хирургических вмешательств за счет отказа от открытой резекции транплантатов, поиска и подготовки донора, типирования HLA-систем донора и реципиента на гистосовместимость, тестирования донора на инфекционные маркеры, обработку и подготовку донорского трансплантата и от этического и юридического сопровождения трансплантации. Этот способ способствует уменьшению капиталоемкости исследований, стоимости и продолжительности лечения и реабилитации, сокращению трудопотерь, снижению удельного веса инвалидизации у больных с различными нарушениями тканевой репаративной регенерации.

Экспериментальное и клиническое использование способа уменьшает объем и травматичность хирургических вмешательств за счет отказа от открытой резекции костных трансплантатов.

Широкие возможности для использования аутологичного тканевого материала при проведении исследований и клиническом использовании значительно снижают затраты за счет отказа от поиска и подготовки донора, типирования HLA-систем донора и реципиента на гистосовместимость, тестирования донора на инфекционные маркеры, обработку и подготовку донорского трансплантата и от этического и юридического сопровождения трансплантации.

Технический результат достигается тем, что создается произвольная с устойчивой трехмерной пространственной организацией иммобилизованная локальная монокультура остеогенных стромальных стволовых клеток костного мозга с заданными параметрами общей клеточной численности и плотности распределения на пористом твердофазовом биоинертном металлическом каркасе с моделированием тканевой структуры и остеопоэтической функции губчатой кости. При этом обеспечиваются оптимальные условия для клеточной жизнедеятельности, в частности, метаболизма, продукции и секреции гуморальных факторов, пролиферации, направленной гистоспецифической дифференцировки и миграции клеток. В способе использованы остеогенные стромальные стволовые клетки костного мозга, что дает возможность длительно поддерживать и контролировать в лабораторных условиях качественные и количественные параметры клеточной популяции и применять ее направленную гистоспецифическую дифференцировку. Использование предложенного способа при аутотрансплантации позволяет значительно повысить количество и активность аутологичных клеточных элементов, отказаться от HLA-типирования трансплантата и определения гистосовместимости донора и реципиента, а также предотвращает артифициальное инфицирование пациента. Пористый сплав никелида титана увеличивает площадь фиксации клеток за счет трехмерной сквозной пористости и обеспечивает стабильную иммобилизацию клеточной популяции с заданными параметрами общей численности и плотности распределения клеточных элементов за счет своей инертности в условиях питательной или биологической среды, устойчивости к биодеградации. Его применение позволяет отказаться от использования массивных костных аллотрансплантатов во избежание инициации аутоиммунных реакций и ятрогенного инфицирования и аутотрансплантатов в виде трехмерных тканевых фрагментов с сокращением степени хирургической агрессии.

Иммобилизованные стромальные стволовые клетки на носителе из пористого никелида титана сохраняют свою жизнеспособность, пролиферативную и миграционную активность и заданное направление гистоспецифической дифференцировки, что показано в эксперименте на моделях in vitro.

Технический результат достигается за счет того, что твердофазовый металлический носитель клеток имеет трехмерную проницаемую сквозную регулярную пористую структуру с размерами ячеек 300-400 мкм и соединяющих их каналов 25-35 мкм в диаметре и обладает инертностью и устойчивостью в питательных и биологических средах за счет тонкого поверхностного супероксидного слоя, блокирующего электрохимическую диссоциацию. Клеточный носитель из пористого никедида титана с иммобилизованными стромальными стволовыми клетками костного мозга играет роль трехмерного каркаса, выполняет в условиях механической нагрузки опорную и динамическую функцию за счет высокой циклоизносоустойчивости и близости по параметрам гистерезиса к упругоэластичным тканям живых организмов.

Инкубация заготовки пористого никелида титана в растворе коллагена и желатиноля с остеогенным индуктором β-глицерофосфатом создает комбинированное гидрофильное протеиновое покрытие в виде сплошного слоя на поверхности всех ячеек и соединительных каналов с равномерным объемным распределением по всему объему металлической заготовки. Эта оболочка придает поверхности свойства гидрофильности, высокую степень смачиваемости и обеспечивает значительно выраженный капиллярный эффект. Мощный капиллярный эффект вызывает активную быстротечную диффузию клеточной суспензии, включая жидкую фазу и форменные элементы, при ее нанесении на поверхность материала с равномерным заполнением всего его объема. При этом остатки газа полностью пассивно вытесняются из ячеек пористой заготовки. Подобные свойства обработанной заготовки позволяют заполнять ее клеточной суспензией ex tempore, т.е непосредственно перед или во время использования, например в операционной ране. Включение в состав протеинового покрытия каркаса остеогенного индуктора обеспечивает длительную пролонгацию заданной тканевой дифференцировки стромальных стволовых клеток после иммобилизации и трансплантации на весь период образования фенотипически зрелых форменных элементов.

Пункционный способ получения аспирата костного мозга с последующим многоступенчатым фракционированием и культивацией в монослойных культурах с остеогенными индукторами обеспечивает выделение монокультуры и направленную тканевую дифференцировку популяции остеогенных стромальных стволовых клеток костного мозга.

Поставленная задача решается за счет того, что культивация стромальных стволовых клеток проводится после их выделения с высокой степенью очистки от сопутствующих форменных элементов из аспирата костного мозга без его предварительной механической и ферментативной обработки и применения микроносителей в монослойной культуре; поверхность пористого каркаса покрывается двойным протеиновым гидрофильным остеогенным слоем путем инкубации заготовки произвольной формы и размеров в течение 2 часов при 37°С в растворе коллагена (2 мг/мл) в 0,1 М уксусной кислоты и 18 часов при 37°С в среде DMEM, содержащей 0,4% раствора желатиноля и остеогенный индуктор - β-глицерофосфат в концентрации 3 мг/мл; пористый каркас представляет собой биологически инертный металлический сплав никелида титана с проницаемой сквозной пористой структурой с размерами ячеек 300-400 мкм и соединяющих их каналов 25-35 мкм в диаметре; суспензию очищенных и выращенных в монослойных культурах остеогенных стромальных стволовых клеток костного мозга наносят непосредственно перед использованием ex tempore на пористый каркас посредством активного диффузионного осаждения на гидрофильную проницаемую поверхность с объемным капиллярным эффектом. Проводят приближенный расчет размеров и формы металлической заготовки из пористого никелида титана с учетом планируемых технических и пространственных характеристик с последующим ее моделированием в ходе применения.

Способ осуществляется следующим образом: костный мозг получают аспирационным путем из крыла подвздошной кости человека. Для этого в условиях операционной при анестезиологической поддержке проводят пункцию гребня крыла подвздошной кости внутрикостной иглой по стандартной методике, аспирируют 50-100 мл костного мозга, помещают полученный аспират в стерильный флакон с раствором гепарина из расчета 50 Ед/мл. В лабораторном блоке флакон инкубируется при 37°С в течение 40 мин. После гравитационного разделения цельного костного мозга в отдельный флакон собирается «верхняя» фракция, состоящая из клеток лейковзвеси в аутоплазме. После центрифугирования (1500 об/мин, 8 мин) надосадок, содержащий аутоплазму, собирают в отдельный стерильный флакон, а осадок клеток лейковзвеси ресуспендируют в 20 мл фосфат-забуференного физиологического раствора, содержащего 10 Ед/мл гепарина (ЗФР/гепарин). Затем клетки лейковзвеси наслаивают на градиент плотности фиколла-верографина (1,078 г/л) и центрифугируют в течение 20 мин при 3000 об/мин. Собранные из интерфазы костномозговые мононуклеарные клетки (МНК КМ) троекратно отмывают в ЗФР/гепарине и ресуспендируют в среде DMEM (Sigma-Aldrich). После получения гомогенной клеточной взвеси подсчитывают общее количество выделенных МНК КМ и их жизнеспособность по окраске трипановым синим.

Для получения обогащенной популяции стромальных (мезенхимальных) стволовых клеток выделенные МНК КМ (3-5×10⁶ /мл) инкубируют в пластиковых флаконах (Nunc, площадью 150 см²) в 50 мл среды DMEM, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки при 37°С в атмосфере 5% СО₂. Через 24 ч инкубации собирают фракцию не прилипающих к пластику клеток, содержащих стволовые кроветворные клетки, эндотелиальные предшественники и другие типы прогениторных клеток, а также фракцию прилипающих к пластику клеток, обогащенных стромальными (мезенхимальными) стволовыми клетками, с помощью стандартной методики отделения клеток от пластиковой поверхности в присутствии 0,25% раствора трипсина и 0,02% раствора ЭДТА при 37°С в течение 8-10 мин. В полученных фракциях подсчитывают общее количество выделенных клеток и их жизнеспособность.

С целью количественной экспансии и индукции направленной дифференцировки стромальных мезенхимальных стволовых клеток в остеогенном направлении полученная фракция прилипающих к пластику костномозговых клеток дополнительно культивируется в среде DMEM, дополненной 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 50 мкМ аскорбатадифосфата, 0,1 мкМ дексаметазона, 0,3 мг/мл L-глютамина, 5 мМ HEPES-буфера, 100 мкг/мл гентамицина в присутствии остеогенного индуктора - β-глицерофосфата (3 мг/мл) при 37°С в атмосфере 5% СО₂. В таких условиях клетки культивируют в течение 21 суток с заменой культуральной среды через каждые 5 суток.

За сутки до иммобилизации стромальных стволовых клеток проводят подготовительную процедуру, с целью соответствующей подготовки твердофазового носителя и покрытия пористой поверхности никелида титана морфогенной средой, обеспечивающей надежную фиксацию клеток и их направленную дифференцировку в остеогенном направлении. Для этого цилиндрическую заготовку из пористого сплава никелида титана соответствующего размера обезжиривают, дезинфицируют, автоклавируют по стандартным методикам, после чего инкубируют 2 часа при 37°С в растворе коллагена (2 мг/мл) в 0,1 М уксусной кислоты, затем троекратно отмывают в ЗФР, высушивают в ультрафиолетовом ламинаре с вертикальным током воздуха. Затем заготовку из пористого сплава никелида титана повторно инкубируют 18 часов при 37°С в среде DMEM, содержащей 0,4% раствора желатиноля и остеогенный индуктор - β-глицерофосфат в концентрации 3 мг/мл. После инкубации рабочую пористую поверхность металлотрансплантата освобождают от культуральной среды путем центрифугирования в течение 5 мин при 1000 об/мин.

На завершающем этапе подготовки клеточного носителя фракцию прилипающих к пластику костномозговых клеток, обогащенных стромальными (мезенхимальными) стволовыми клетками, или прокультивированные в течение 21 суток стромальные (мезенхимальные) стволовые клетки с остеогенным вектором дифференцировки разводят в среде DMEM, содержащей 10% аутоплазмы, в заданной концентрации из расчета на 1 см³ пористого никелида титана и в объеме, не превышающем объем подготовленного твердофазового носителя.

После чего клеточную взвесь медленно инъецируют в разных точках подготовленной каркасной конструкции из никелида титана, что обеспечивает равномерное заполнение пор твердофазового носителя клеточным материалом. Фиксацию клеток проводят при 37°С в СО₂-инкубаторе в течение 30 мин. Затем помещают подготовленный клеточный носитель с иммобилизованными стромальными (мезенхимальными) стволовыми клетками в стерильный флакон, содержащий среду DMEM с 10% аутоплазмы, укупоривают, маркируют и транспортируют из лабораторного блока в операционную, где аутобиотрансплантат ex tempore используется для локального восстановления функции репаративного остеогенеза в зоне костного дефекта при различных его нарушениях в экспериментальных или клинических целях.

Расчет приблизительных размеров, формы и объема носителя проводят в соответствии с задачей экспериментального исследования или клинического использования, определяют количество клеток для иммобилизации по измерениям имплантата соответствующих размеров, формы и объема. В ходе применения возможно выполнение моделирования металлической заготовки по фактически необходимым форме и размеру.

С целью потенцирования остеогенного эффекта используемого биотрансплантата, а также для улучшения трофики и неоваскуляризации в окружающих тканях целесообразно дополнительно использовать введение фракции не прилипающих к пластику аутологичных костномозговых клеток, содержащих стволовые кроветворные клетки, эндотелиальные предшественники и другие типы прогениторных клеток, в смежные сегменты кости и периостально в мягкие ткани.

В другом варианте иммобилизация клеток производится непосредственно перед использованием. Полученную клеточную суспензию укупоривают в стерильный маркированный стеклянный флакон, который в течение 1 часа при комнатной температуре доставляют к месту применения. В операционной после моделирования подготовленной и обработанной металлической заготовки из пористого никелида титана клеточная суспензия аспирируется шприцем и инъекционной иглой из флакона и наносится на поверхность носителя из нескольких точек с визуальным контролем скорости и степени диффузии суспензии, протекающей активно и полностью с распределением по всему объему. Активность объемной диффузии клеточной суспензии в подготовленном носителе позволяет выполнять ее нанесение в условиях операционной раны.

Разработка и тестирование предложенного способа проведена экспериментально в условиях клеточной культуры и на взрослых беспородных собаках при проведении межтелового корпородеза. Проведена клиническая апробация предложенного способа у пациентов с осложненной травмой позвоночника.

1. Способ иммобилизации стромальных стволовых клеток на пористом каркасе, отличающийся тем, что культивацию стромальных стволовых клеток проводят после их выделения с высокой степенью очистки от сопутствующих форменных элементов из аспирата костного мозга без его предварительной механической и ферментативной обработки и применения микроносителей в монослойной культуре; поверхность пористого каркаса покрывают двойным протеиновым гидрофильным остеогенным слоем путем инкубации заготовки произвольной формы и размеров в течение 2 ч при 37°С в растворе коллагена 2 мг/мл в 0,1 М уксусной кислоты и 18 ч при 37°С в среде DMEM, содержащей 0,4% раствора желатиноля и остеогенный индуктор - β-глицерофосфат в концентрации 3 мг/мл; пористый каркас представляет собой биологически инертный металлический сплав никелида титана с проницаемой сквозной пористой структурой с размерами ячеек 300-400 мкм и соединяющих их каналов 25-35 мкм в диаметре; суспензию очищенных и выращенных в монослойных культурах остеогенных стромальных стволовых клеток костного мозга наносят на пористый каркас непосредственно перед использованием ex tempore посредством активного диффузионного осаждения на гидрофильную проницаемую поверхность с объемным капиллярным эффектом.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что проводят приближенный расчет размеров и формы металлической заготовки из пористого никелида титана с учетом планируемых технических и пространственных характеристик с последующим ее моделированием в ходе применения.