Способ получения растворов гемоглобина, очищенных от стромальных компонентов

Способ получения растворов гемоглобина, очищенных от стромальных компонентов

Реферат

Изобретение относится к такой области медицины, как трансфузиология, точнее к выделению растворов нативного гемоглобина, очищенных от стромальных компонентов, из эритроцитов крови.

Изобретение может найти широкое использование при создании кровезаменителей - переносчиков кислорода, в которых гемоглобин, очищенный от стромальных компонентов, является основой.

(1. Artificial Cells, Blood Substitutes and Immobilisation Biotechnology / Ed. Chang T.M.S, 1998, Marcel DekkerInc. - V.26. - N 2 - P.173-180 and 213-222).

Кровезаменители - переносчики кислорода необходимы при лечении тяжелых кровопотерь (в хирургии, гинекологии, травматологии, ортопедии и др.), а также в случаях чрезвычайных ситуаций (аварий, катастроф, военных конфликтов). Кровь доноров является до сих пор единственным кислородпереносящим лечебным средством, срок годности которого для клинического применения составляет не более 5-7 суток со дня забора крови. При более длительном хранении в крови накапливаются токсические продукты, способные вызывать при введении в организм тяжелые побочные реакции, поэтому серьезной задачей является получение и очистка гемоглобина из крови с истекшим сроком хранения.

Стандартный метод получения гемоглобина (Гб) из эритроцитов млекопитающих включает следующие стадии:

1. Отделение от плазмы, консервантов и других форменных элементов эритроцитов и их отмывка.

2. Гемолиз отмытых эритроцитов с получением сложной смеси, содержащей Гб, строму, составляющую мембраны эритроцитов, растворимые стромальные компоненты и продукты клеточного метаболизма (фосфолипиды и иные фосфорсодержащие соединения клеток, внутриклеточные белки и ферменты, остатки плазменных и мембранных белков). Структура, состав, функциональные характеристики примесей до сих пор остаются неопределенными.

3. Отделение Гб от нерастворимых клеточных фрагментов фильтрацией или центрифугированием.

4. Очистка растворов Гб от всех растворимых примесей, образовавшихся при гемолизе эритроцитов. Эти примеси могут снижать функциональную активность Гб и придавать его растворам токсичность, пирогенность и иные характеристики, отрицательное действие которых будет сказываться негативно при получении кровезаменителей - переносчиков кислорода на основе Гб.

На практике самой сложной стадией оказалась стадия 4, поскольку качественный и количественный состав растворимых примесей существенно изменяется в зависимости от многих параметров: индивидуальности доноров, условий хранения эритроцитов (времени, температуры и т.п.), условий их гемолиза и др.

Известны различные способы очистки растворов Гб:

- Аффинная хроматография (2. Pat. US №6365147, дата подачи 13.10.1999).

- Вытеснительная препаративная ВЭЖХ (3. Pat. US №6506725, дата подачи 10.05.1999).

- Ионообменная хроматография с использованием катионитов и анионитов (4. Williams R.С., Jr., Kuo-Ji Tsay // Analyt. Biochem., 1973, - V.54. - N 1. - P.137-145).

Все известные хроматографические методы предусматривают сорбцию Гб из фильтрата гемолизата с удалением несорбируемых свободных примесей. После этого проводят десорбцию Гб с сорбента элюентом в градиенте рН или ионной силы.

Все известные методы хроматографической очистки основаны на длительном контакте Гб с сорбентом, воздействии слишком низких или высоких значений ионной силы и рН, необходимости проведения длительных хроматографических процессов при низких температурах (что может привести к необратимому автоокислению Гб - образованию метформы). Кроме того, известные методы колоночной хроматографии трудно масштабируемы.

Наиболее близким по технической сущности является способ получения растворов Гб с использованием ионообменной жидкостной хроматографии (пункт 29 патентной формулы патента США №5296465 А (BIOPURE CORPORATION), 22.03.1994.

Этот способ реализуется следующей совокупностью существенных признаков:

1. Эритроцитарную массу отмывают, гемолизуют и центрифугируют.

2. Супернатант подвергают очистке с помощью высокоэффективной ионообменной хроматографии.

Растворы Гб, полученные по известному изобретению, не содержат стромы и балластных липопротеинов и фосфорсодержащих веществ. При этом Гб сохраняет биологическую и функциональную активность. Однако известный способ затруднительно приспособить для использования в промышленных масштабах.

Задачей предлагаемого изобретения является создание масштабируемого технологического процесса получения растворов Гб, очищенных от стромальных компонентов.

Эта задача достигнута заявленным способом, включающим следующие существенные признаки:

1. Эритроцитарную массу отмывают, гемолизуют и центрифугируют.

2. В супернатант добавляют флокулянт, смесь перемешивают, поддерживая рН 6,6-7,2, флокулянт отделяют центрифугированием.

3. В качестве флокулянта берут аниониты с размером частиц 90-160 мкм, при массовом соотношении анионит:гемоглобин=1,0:4,0.

Анализ известного научно-технического уровня не позволил найти публикацию, которая по совокупности существенных признаков полностью совпадает с совокупностью признаков заявленного решения. Это подтверждает соответствие изобретения такому условию патентноспособности как «новизна». Не удалось найти такое решение, в котором для количественного отделения из растворов Гб растворимых стромальных компонентов были использованы флокулянты, в качестве которых берут аниониты с размером частиц 90-160 мкм.

Впервые обнаружена новая функциональная связь структура - размер частиц флокулянта - избирательная сорбция примесей. Это подтверждает соответствие решения такому условию патентноспособности как «изобретательский уровень».

Для доказательства соответствия изобретения условию «промышленная применимость» и для лучшего понимания сущности изобретения приводим примеры его конкретной реализации, которыми не исчерпывается его сущность.

Пример 1. Подготовка флокулянта.

200 г коммерческого анионита (ЭДЭ-10п, АВ-16 ГС, АВ-17-8) при перемешивании последовательно обрабатывают 2-3 раза на воронке Бюхнера 0,05 н водным раствором NaOH в суммарном объеме 1000-1500 мл. Затем ионит обрабатывают раствором 0,1 н HCl также 2-3 раза в суммарном объеме 1000-1500 мл. После чего анионит отмывают водой до рН 5-6. Отмытый водой анионит сушат на воздухе до сыпучего состояния, измельчают в шаровой мельнице с периодическим отбором и фракционированием на ситах с выделением частиц:

<45 мкм 3-15%;

1 фракция 45-56 мкм 10-12%;

2 фракция 56-90 мкм 15-20%;

3 фракция 90-160 мкм 45-54%;

>160 мкм 6-10%.

Суммарный выход фракций ˜60-80%

Из каждой фракции декантацией водой удаляют оставшиеся пылевидные частицы. Затем фракции сушат на воздухе.

Пример 2. Выделение гемоглобина.

Отмытые физиологическим раствором эритроциты отделяют от промывного раствора центрифугированием на рефрижераторной центрифуге (+4÷+8°С) при 3000 об/мин. Затем проводят осмотический гемолиз эритроцитов под действием гипоосмотического раствора фосфатного буфера (15-25 мОсм) при рН 7,2-7,8 и объемном соотношении эритроциты:фосфатный буфер=1:2÷5. Гемолиз ведут 20-30 мин. Гемолизат центрифугируют, отделяя нерастворимые фрагменты клеток. Супернатант - водный раствор Гб имеет концентрацию от 25 до 66 мг/мл при рН 6,6-7,2. При этом оказалось, что для получения Гб могут быть использованы эритроциты с различными сроками хранения, в том числе так называемые «старые эритроциты» с истекшим сроком хранения (до 35 суток). В таблице 1 приведены характеристики растворов Гб, полученных из эритроцитов различного срока хранения.

Таблица 1.
№ примеров	Сроки хранения эритроцитов (сутки)	Концентрация Гб СГб, мг/мл	Концентрация метформы Гб, мг/мл	рН раствора Гб
2.1	7	25	0,29	6,8
2.2	21	38,5	0,16	7,2
2.3	35	48	0,32	6,6

Примеры 2.1-2.3 выполнены в следующих условиях: 60 мл эритроцитов и 240 мл гемолизующего раствора (20 мОсм раствора фосфатного буфера рН 7,5), время гемолиза 1 час, температура 6±2°С с последующим выделением раствора Гб центрифугированием.

В гемолизат добавляют флокулянт - анионит, предварительно набухший в воде. Сорбцию примесей ведут при слабом перемешивании и пониженной температуре. В процессе сорбции рН раствора регулируют на уровне 6,6-7,2 путем добавления 0,01 н водного раствора NaOH.

Дисперсию флокулянта отделяют центрифугированием. В качестве контроля чистоты получаемых растворов Гб используют известный высокочувствительный иммунологический метод тестирования следов стромы по кольцам преципитации при образовании комплекса антиген (стромальные примеси в растворе Гб) - антитело с сывороткой крови кролика, предварительно иммунизированного гомогенатом стромы. (7. Биохимические исследования мембран, ред. Э.Мэдди, 1979 г, М., Мир. С.334-372).

Образование колец преципитации оценивают по системе, где гомогенат стромы по реакции преципитации имеет 4+, исходный гемолизат Гб 2+, отсутствие следов стромы 0. В примерах 3.1-3.10 реализуется определение иммунологических характеристик растворов Гб после обработки флокулянтом.

К 10 мл гемолизата, полученного по примеру 2.3 с С_Гб=48 мг/мл рН 6,6, добавляют различные количества флокулянта с величиной частиц 90-160 мкм. Результаты примеров 3.1-3.10 сведены в таблицу 2.

Таблица 2.
№ примеров	Количество флокулянта, (г)	Соотношение флокулянт / Гб, (г/г)	Показатель иммунной реакции (в баллах)
3.0	Исх. гемолизат	-	2+
3.1	Гомогенат мембран эритроцитов (строма)	-	4+
3.2	0,10	0,2	1+
3.3	0,50	1,0	0
3.4	0,75	1.5	0
3.5	1,00	2,0	0
3.6	2,00	4,0	0
3.7	1,00	2,0	0
3.8	1,50	3,0	0
3.9	1,50	3,0	0
3.10	2,00	4,0	0
Примечание: примеры 3.2-3.6 выполнены с использованием флокулянта-анионита ЭДЭ-10П, примеры 3.7-3.8 - флокулянта-анионита АВ-16 ГС, примеры 3.9-3.10 - флокулянта-анионита АВ-17-8.

Заявленная величина частиц флокулянта определена экспериментально.

Частицы отработанного флокулянта с размером 45-56 мкм было трудно отделить от раствора Гб центрифугированием. Частицы размером 56-90 мкм требовали для отделения в 3-4 раза больше времени при центрифугировании и большую скорость вращения ротора, чем в процессе с использованием частиц размером 90-160 мкм. Использование частиц с размером свыше 200-250 мкм значительно увеличивало время флокуляции из-за снижения скорости сорбции примесей и потребовало также увеличения количества флокулянта.

Представленные данные подтверждают решение поставленной задачи, поскольку нет ограничений на масштабирование процесса. Кроме того, показана высокая эффективность заявленного способа при получении растворов Гб, очищенных от стромальных компонентов, как из свежих эритроцитов, так и эритроцитов с просроченным временем хранения.

Способ получения растворов гемоглобина, очищенных от стромальных компонентов, путем выделения эритроцитарной массы из крови, ее отмывки, гемолиза, центрифугирования с последующим удалением из супернатанта всех растворимых примесей с помощью анионитов, отличающийся тем, что растворимые примеси из супернатанта удаляют добавлением в качестве флокулянта анионитов с размером частиц 90-160 мкм при массовом соотношении флокулянт/гемоглобин=1,0÷4,0, при этом рН поддерживают при значениях 6,6-7,2.